對根腫病具有抗性的HO/LL芸苔的製作方法

2023-08-05 13:32:36 4

本申請是2012年9月27日提交的申請號為201280058249.7(pct申請號為pct/us2012/057574)、發明名稱為「對根腫病具有抗性的ho/ll芸苔」的發明專利申請的分案申請。

優先權要求

本申請要求2011年9月27日提交的美國專利申請系列號13/246,757的優先權。

發明領域

本公開內容涉及對疾病有抗性的植物，例如對疾病，即根腫病(clubroot)有抗性的歐洲油菜(brassicanapus)植物。本公開內容還涉及與根腫病抗性連鎖的分子標誌物。在具體的實施方案中，公開內容涉及通過例如使用與根腫病抗性連鎖的分子標誌物將根腫病抗性引入植物中的組合物和方法。具體的實施方案涉及使用特定核酸序列來鑑定有可能具有根腫病抗性表型的植物的方法。

發明背景

根腫病是一種分布廣泛的疾病，其對許多芸苔(brassica)生長區引起嚴重的問題。參見例如dixon(1999)growerapril29:28-9。該疾病由芸苔根腫菌(plasmodiophorabrassicae)(一種單細胞生物體)引起。疾病的症狀包括根畸形，伴有最終腐爛的硬腫脹(棒狀物(clubs))。疾病還經由降低的生長而引起發育遲緩，並且在水應激下觀察到葉的萎蔫。對疾病的化學控制是無效的。

芸苔屬包含商業目的的幾種物種，諸如蕪菁(b.rapa)(例如大白菜(chinesecabbage)、小白菜(pakchoi)、蕪菁(turnip))；歐洲油菜(例如含油種子，瑞典蕪菁(swede))；芥菜(b.juncea)(例如芥菜(mustard))；黑芥(b.nigra)(例如黑芥(blackmustard))；和甘藍(b.oleracea)(例如花椰菜(cauliflower)、花莖甘藍(broccoli)、甘藍(cabbage)、抱子甘藍(brusselssprouts)、皺葉甘藍(savoycabbage)、羽衣甘藍(borecole)、苤藍(kohlrabi)、羽衣甘藍，等等)。雖然芸苔屬物種內的亞種通常是有性相容的，但是芸苔屬的不同物種之間不一定如此。例如，蕪菁和甘藍沒有相同數目的染色體(10條染色體對9條染色體)，並且因此不是有性相容的。這使性狀從一種芸苔物種轉移至另一種變得特別困難。

已經在芸苔屬內描述了對根腫病的抗性的幾種來源。參見例如bradshaw等(1997)ann.appl.biol.130:337-48；gowers(1982)euphytica31:971-6。一些抗性是單基因的，一些是多基因的，一些是顯性的，而一些是隱性的。已經在蕪菁和歐洲油菜中描述了單基因顯性抗性，諸如例如蕪菁大白菜中的單基因顯性抗性。yoshikawa(1983)japanagriculturalresearchquarterly17(l):6-11。已經顯示了具有此抗性的大白菜fl雜種針對根腫病具有良好的保護，儘管少量根腫病菌株(「種」)已經能夠突破此抗性。

認為根腫病感染是芸苔栽培業的主要威脅。為了得到根腫病抗性芸苔品種的育種嘗試會產生大量需要篩選根腫病抗性的分離植物。對育種材料篩選根腫病抗性的目前實踐包括對單獨的植物測定表型，其經由在用芸苔根腫菌病原體接種植物後觀察所述植物的表型反應進行。這種已經麻煩且費時的方法進一步伴隨目前對根腫病病原體或任何感染性材料運輸的管理限制。前述考慮因素使對育種材料篩選根腫病抗性的成本變得非常高，而且還通過限制可同時測試的品係數目而顯著阻礙育種的努力。

發明概述

本文中描述了芸苔植物及其部分，其中植物包含至少一種選自下組的性狀：高油酸和/或低亞麻酸含量；對芸苔根腫菌的抗性；對除草劑(例如草甘膦或咪唑啉酮除草劑)的抗性；和細胞質雄性不育的恢復系。在一些實施方案中，芸苔植物選自下組：蕪菁、歐洲油菜、芥菜、黑芥、和甘藍。例如在具體的實施方案中利用歐洲油菜。具體的實施方案提供了芸苔植物及其部分，其中植物顯示與同一物種的野生型植物相比的高油酸和/或低亞麻酸含量，顯示與同一物種的野生型植物相比對芸苔根腫菌的抗性，顯示與同一物種的野生型植物相比對咪唑啉酮的抗性，且包含細胞質雄性不育系統恢復系基因。具體的實施方案可以包括在包含芸苔根腫菌的田地中種植依照本發明的芸苔植物或其部分的方法。

在具體的實施方案中，植物(或其部分)可以包含就對於植物的第一親本天然的且對於第二親本非天然的遺傳等位基因而言純合的基因組，其中第二親本顯示比第一親本顯著更少的油酸和/或更高的亞麻酸含量。在一些例子中，植物(或其部分)包含在至少一個基因座中雜合或近交組合的來自第一親本的等位基因，所述基因座選自定位於選自下組的連鎖群的基因座：芸苔物種的n14、n4、n5和n1。在具體的例子中，可以通過一種或多種以seqidno:5、6、14、和15列出的標誌物定位來自第一親本的等位基因。

本文中還描述了與歐洲油菜中的高油酸(ho)和/或低亞麻酸(ll)表型連鎖(例如連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的核酸分子標誌物。在具體的實施方案中，與ho表型連鎖的標誌物與fad2基因中的突變連鎖。在具體的實施方案中，與ll表型連鎖的標誌物與fad3基因中的突變連鎖。在一些實施方案中，可以使用與歐洲油菜中的ho/ll表型連鎖的標誌物將ho/ll表型引入其它植物(例如其它芸苔物種)中。一些實施方案包括使用至少一種與歐洲油菜中的ho/ll表型連鎖的核酸分子標誌物的方法，例如但不限於用以鑑定具有ho/ll表型的植物；和/或將ho/ll表型引入新的植物基因型和種質(例如經由標誌物輔助育種或遺傳轉化)。

進一步描述了用於將ho表型引入芸苔屬植物中的手段，和用於將ll表型引入芸苔屬植物中的手段。在一些例子中，用於將ho表型引入芸苔屬植物中的手段是歐洲油菜植物中fad2基因中第411位的「c」至「t」突變。在一些例子中，用於將ll表型引入芸苔屬植物中的手段是歐洲油菜植物中fad32基因中第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基處的「g」至「a」突變。

還描述了用於鑑定攜帶促成芸苔屬植物中ho表型的基因的植物的手段。在一些例子中，用於鑑定攜帶促成ho表型的基因的植物的手段是探針，該探針與包含第411位的「c」至「t」突變的歐洲油菜fad2基因區段特異性雜交，但是不與沒有此突變的野生型歐洲油菜fad2基因的相同區段雜交。還描述了用於鑑定攜帶促成芸苔屬植物中ll表型的基因的植物的手段。在一些例子中，用於鑑定攜帶促成ll表型的基因的植物的手段是探針，該探針與包含第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基處的「g」至「a」突變的歐洲油菜fad32基因區段特異性雜交，但是不與沒有此突變的野生型歐洲油菜fad32基因的相同區段雜交。

在一些實施方案中，本發明的芸苔植物的種子可以包含至少63％油酸(c18:1)。例如，本發明的芸苔植物的種子可以包含至少77％油酸(c18:1)。在本發明的一些實施方案中，芸苔植物的種子可以包含不超過6％亞麻酸(c18:3)。例如，芸苔植物的種子可以包含不超過1.5％亞麻酸(c18:3)。

在一些實施方案中，本發明的植物(或其部分)可以包含與選自下組的核苷酸序列的互補物特異性可雜交的核苷酸序列：seqidno:7和12。在這些和其它實施方案中，植物或其部分可以對咪唑啉酮(例如選自下組的咪唑啉酮：imazamethbenz、甲氧咪草煙(imazamox)、甲咪唑煙酸(imazapic)、滅草煙(imazapyr)、滅草喹(imazaquin)、和咪唑乙煙酸(imazethapyr))有抗性。具體的實施方案包括控制田間的至少一種雜草的方法，其中田間含有至少一種芸苔植物或其部分，並且對田間的至少一部分施用咪唑啉酮。

本文中還描述了與歐洲油菜中的根腫病抗性表型連鎖(例如連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的核酸分子標誌物。在一些實施方案中，可以使用與歐洲油菜中的根腫病抗性表型連鎖的標誌物將根腫病抗性表型引入其它植物(例如其它芸苔物種)中。可以使用與歐洲油菜中的根腫病抗性表型連鎖的標誌物將根腫病抗性表型引入其它植物(例如其它芸苔物種)中。一些實施方案包括使用至少一種與歐洲油菜中的根腫病抗性表型連鎖的核酸分子標誌物的方法，例如但不限於用以鑑定具有根腫病抗性表型的植物；和/或將根腫病抗性表型引入新的植物基因型(例如經由標誌物輔助育種或遺傳轉化)。在具體的例子中，可以利用選自下組的引物或其功能等同物通過dna擴增測定和/或鑑定與根腫病抗性連鎖的標誌物：seqidno:18-22。

進一步描述了用於將根腫病抗性引入芸苔植物中的手段，和用於鑑定攜帶促成根腫病抗性的基因的植物的手段。在一些例子中，用於將根腫病抗性引入芸苔植物中的手段是長度為300bp並且通過例示性引物seqidno:18和19擴增的基因組dna的連續區段，該標誌物與歐洲油菜植物中的根腫病抗性連鎖。還描述了用於鑑定攜帶促成根腫病抗性的基因的植物的手段。在一些例子中，用於鑑定攜帶促成根腫病抗性的基因的植物的手段是探針，該探針與基因組dna的連續區段特異性雜交，所述連續區段長度為300bp，並且通過例示性引物seqidno:18和19擴增。

更具體而言，本申請公開了以下各項技術方案：

1.一種用於鑑定包含fad2基因中促成歐洲油菜(brassicanapus)中的高油酸表型的突變的植物的方法，該方法包括：

從植物分離基因組dna；並

對分離的基因組dna篩選歐洲油菜連鎖群n5或n1中的核酸分子標誌物，其中所述核酸分子標誌物的存在指示fad2基因中促成歐洲油菜中的高油酸表型的突變。

2.依照項1的方法，其中所述突變是生成截短的fad2表達產物的單核苷酸多態性。

3.依照項1的方法，其中所述分子標誌物是在與歐洲油菜fad2基因的第411位對應的位置處的單核苷酸多態性。

4.依照項3的方法，其中所述分子標誌物是在與歐洲油菜fad2基因的第411位對應的位置處的胸苷核苷酸。

5.依照項4的方法，其中對分離的基因組dna篩選所述核酸分子標誌物包括測定所述分離的基因組dna中與seqidno:7的互補物特異性可雜交的核酸分子的存在。

6.一種通過依照項1的方法鑑定的植物。

7.一種用於鑑定包含fad3基因中促成歐洲油菜中的低亞麻酸表型的突變的植物的方法，該方法包括：

從植物分離基因組dna；並

對分離的基因組dna篩選歐洲油菜連鎖群n4或n14中的核酸分子標誌物，其中所述核酸分子標誌物的存在指示促成歐洲油菜中低亞麻酸表型的fad3基因中的突變。

8.依照項7的方法，其中所述突變是導致fad3表達產物的異常剪接的單核苷酸多態性。

9.依照項7的方法，其中所述分子標誌物是與歐洲油菜fad32基因的第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基對應的位置處的單核苷酸多態性。

10.依照項9的方法，其中所述分子標誌物是與歐洲油菜fad32基因的第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基對應的位置處的腺嘌呤核苷酸。

11.依照項10的方法，其中對分離的基因組dna篩選所述核酸分子標誌物包括測定所述分離的基因組dna中與seqidno:12的互補物特異性可雜交的核酸分子的存在。

12.一種通過依照項7的方法鑑定的植物。

13.一種用於鑑定包含促成歐洲油菜中的根腫病抗性的dna序列的植物的方法，該方法包括：

從植物分離基因組dna；並

對分離的基因組dna篩選歐洲油菜中的核酸分子短序列重複(ssr)標誌物，其中所述核酸分子ssr標誌物的存在指示促成歐洲油菜中根腫病抗性的dna序列。

14.依照項13的方法，其中所述分子標誌物是bn1810ssr標誌物。

15.依照項1的方法，其中對分離的基因組dna篩選所述核酸分子標誌物包括測定所述分離的基因組dna中在聚合酶鏈式反應中通過seqidno:16-17的引物擴增的長度為約300個鹼基對的核酸序列的存在。

16.一種通過依照項13的方法鑑定的植物。

17.一種用於在芸苔植物中引入高油酸表型的方法，該方法包括：

將第一芸苔植物與第二芸苔植物雜交以生成f1芸苔植物，所述第一芸苔植物包含fad2基因中生成截短的fad2表達產物的單核苷酸突變；

使用標誌物輔助選擇來鑑定包含歐洲油菜連鎖群n5或n1中的核酸分子標誌物的f1芸苔植物，其中所述核酸分子標誌物的存在指示fad2基因中促成歐洲油菜中的高油酸表型的突變；並

繁殖鑑定的f1芸苔植物，由此在芸苔植物中引入高油酸表型。

18.依照項17的方法，其中鑑定所述f1芸苔植物包括測定所述f1芸苔植物中與seqidno:7的互補物特異性可雜交的核酸分子的存在，其中所述核酸分子不與seqidno:9的互補物特異性可雜交。

19.一種用於在芸苔植物中引入高油酸表型的方法，該方法包括對所述芸苔植物引入編碼包含seqidno:8的多肽的突變體fad2基因。

20.依照項19的方法，其中所述突變體fad2基因包含seqidno:7。

21.依照項19的方法，其中通過與包含所述突變體fad2基因的芸苔植物雜交將所述突變體fad2基因導入所述芸苔植物中。

22.一種用於在芸苔植物中引入低亞麻酸表型的方法，該方法包括：

將第一芸苔植物與第二芸苔植物雜交以生成f1芸苔植物，所述第一芸苔植物包含fad3基因中導致fad3表達產物的異常剪接的單核苷酸突變；

使用標誌物輔助選擇來鑑定包含歐洲油菜連鎖群n4或n14中的核酸分子標誌物的f1芸苔植物，其中所述核酸分子標誌物的存在指示fad3基因中促成歐洲油菜中的低亞麻酸表型的突變；並

繁殖鑑定的f1芸苔植物，由此在芸苔植物中引入低亞麻酸表型。

23.依照項22的方法，其中鑑定所述f1芸苔植物包括測定所述f1芸苔植物中與seqidno:12的互補物特異性可雜交的核酸分子的存在，其中所述核酸分子不與seqidno:13的互補物特異性可雜交。

24.一種用於在芸苔植物中引入高油酸表型的方法，該方法包括對所述芸苔植物導入包含seqidno:12的突變體fad3基因。

25.依照項23的方法，其中通過與包含所述突變體fad3基因的芸苔植物雜交將所述突變體fad3基因導入所述芸苔植物中。

26.一種用於在芸苔植物中引入根腫病抗性的方法，該方法包括：

將第一芸苔植物與第二芸苔植物雜交以生成f1芸苔植物，所述第一芸苔植物包含歐洲油菜中的核酸分子短序列重複(ssr)標誌物，其中所述核酸分子ssr標誌物的存在指示促成歐洲油菜中的根腫病抗性的dna序列；

使用標誌物輔助選擇來鑑定包含所述核酸分子ssr標誌物或其等同物的f1芸苔植物；並

繁殖鑑定的f1芸苔植物，由此在芸苔植物中引入根腫病抗性。

27.依照項26的方法，其中所述核酸分子標誌物是bn1810ssr標誌物。

28.一種分離的核酸分子，其編碼包含seqidno:8的多肽。

29.項28的核酸分子，其包含seqidno:7。

30.一種分離的核酸分子，其包含seqidno:12。

31.一種分離的核酸分子樣品，其包含：

編碼包含seqidno:8的多肽的核酸分子；和

包含seqidno:12的核酸分子。

32.一種生成遺傳工程化生物體的方法，其包括將項28的核酸分子導入所述生物體中。

33.一種生成遺傳工程化生物體的方法，其包括將項30的核酸分子導入所述生物體中。

34.一種包含項28的核酸分子和seqidno:12的芸苔植物，其中所述植物比同一物種的野生型植物對根腫病更具抗性。

35.項34的芸苔植物，其中所述野生型植物是歐洲油菜品種quantum。

36.項34的芸苔植物，其中所述植物比同一物種的野生型植物對選自下組的除草劑更有抗性或耐受性：草甘膦(glyphosate)和咪唑啉酮(imidazolinone)除草劑。

37.項36的芸苔植物，其中所述野生型植物是歐洲油菜品種quantum。

38.項34的芸苔植物，其中所述植物包含細胞質雄性不育恢復系的性狀。

39.項34的芸苔植物，其中所述植物包含：

與同一物種的野生型植物相比對選自下組的除草劑的抗性或耐受性：草甘膦和咪唑啉酮除草劑；和

細胞質雄性不育恢復系的性狀。

40.項34的芸苔植物，其中從所述植物獲得的種子油包含如下的脂肪酸概貌(fattyacidprofile)，該脂肪酸概貌包含至少約63％油酸和不超過約6％亞麻酸。

41.一種用於在芸苔植物中引入高油酸表型的方法，該方法包括：

將第一芸苔植物與第二芸苔植物雜交以生成f1芸苔植物，所述第二芸苔植物包含用於將高油酸表型引入芸苔屬植物中的手段；

鑑定包含用於將高油酸表型引入芸苔屬植物中的手段的f1芸苔植物；並

繁殖鑑定的f1芸苔植物，由此在芸苔植物中引入高油酸表型。

42.一種用於鑑定包含高油酸表型的芸苔植物的方法，該方法包括：

從芸苔植物分離核酸分子；並

使分離的核酸分子與用於鑑定攜帶促成芸苔屬植物中的高油酸表型的基因的植物的手段接觸，以產生指示所述芸苔植物中高油酸表型存在的可檢測信號。

43.一種用於在芸苔植物中引入低亞麻酸表型的方法，該方法包括：

將第一芸苔植物與第二芸苔植物雜交以生成f1芸苔植物，所述第二芸苔植物包含用於將低亞麻酸表型引入芸苔屬植物中的手段；

鑑定包含用於將低亞麻酸表型引入芸苔屬植物中的手段的f1芸苔植物，並

繁殖鑑定的f1芸苔植物，由此在芸苔植物中引入低亞麻酸表型。

44.一種用於鑑定包含低亞麻酸表型的芸苔植物的方法，該方法包括：

從芸苔植物分離核酸分子；並

使分離的核酸分子與用於鑑定攜帶促成芸苔屬植物中的低亞麻酸表型的基因的植物的手段接觸，以產生指示所述芸苔植物中低亞麻酸表型的存在的可檢測信號。

45.一種用於在芸苔植物中引入根腫病抗性的方法，該方法包括：

將第一芸苔植物與第二芸苔植物雜交以生成f1芸苔植物，所述第二芸苔植物包含用於將根腫病抗性引入芸苔植物中的手段；

鑑定包含用於將根腫病抗性引入芸苔植物中的手段的f1芸苔植物；並

繁殖鑑定的f1芸苔植物，由此在芸苔植物中引入根腫病抗性。

46.一種用於鑑定包含根腫病抗性的芸苔植物的方法，該方法包括：

從芸苔植物分離核酸分子；並

使分離的核酸分子與用於鑑定攜帶促成根腫病抗性的基因的植物的手段接觸，以產生指示所述芸苔植物中根腫病抗性的存在的可檢測信號。

通過參考附圖進行的幾個實施方案的以下詳細描述，前述和其它特徵會變得更加顯而易見。

附圖簡述

圖1包括從歐洲油菜品種dms100和quantum克隆的fad2基因的部分基因組核苷酸序列。頂部顯示了從dms100克隆的fad2基因的部分基因組核苷酸序列(seqidno:7)，底部顯示了從quantum克隆的fad2基因的部分基因組核苷酸序列(seqidno:9)。箭頭標示「c」至「t」的單核苷酸突變，這產生終止密碼子(「tag」)(有陰影)。以粗體和下劃線顯示了突變體等位基因特異性正向(seqidno:5)和反向(seqidno:6)引物，用於突變體等位基因特異性標誌物的基於pcr的鑑定。

圖2包括與從dms100(seqidno:8)，quantum(seqidno:10)，及從發表的歐洲油菜fad2基因(bnfad2)(seqidno:11)克隆的基因組核苷酸序列簡併的fad2基因的胺基酸序列。箭頭標示源自dms100中的單核苷酸突變(「c」至「t」)的終止密碼子位置。

圖3包括從dms100和quantum克隆的fad3c基因的基因組核苷酸序列。頂部顯示了從dms100克隆的fad3c基因(seqidno:12)，而底部顯示了從quantum克隆的fad3c基因(seqidno:13)。與蕪菁和擬南芥(arabidopsis)中的fad3基因的外顯子4、5、6和7對應的外顯子是框示的，而與蕪菁和擬南芥中的fad3基因的內顯子4、5、和6對應的內含子是未框示的。箭頭標示「g」至「a」的單核苷酸突變。以粗體和下劃線顯示了正向(seqidno:14)和突變體等位基因特異性反向(seqidno:15)引物，用於突變體等位基因特異性標誌物的基於pcr的鑑定。

圖4包括關聯突變體等位基因特異性標誌物和源自quantum和dms100雜交的184種雙重單倍體(dh)品系的脂肪酸含量的表(頂部)，及從fad2基因的突變體等位基因特異性標誌物擴增的pcr產物的電泳結果(底部)。

圖5包括數量性狀基因座(qtl)圖，其顯示了通過本發明的標誌物檢出的一個主要(n5)和一個次要(n1)qtl區(對於高油酸(c18:1))，和三個qtl區(n4和n14)(對於低亞麻酸(c18:3))。

圖6包括雜種種子生成方案中的細胞質雄性不育系統的一種用途的圖示。

圖7包括fame圖，其顯示多種植物雜交的脂肪酸概貌的分布。

圖8包括例示性的根腫病抗性、高油酸、和低亞麻酸芸苔植物中開花日期的分布的顯示。

圖9包括凝膠圖像，其顯示了與芸苔中根腫病抗性連鎖的分子標誌物的鑑定。與根腫病抗性連鎖的鑑定的標誌物條帶以紅色突出顯示，並且在此情況中，擴增片段的大小是333bp(將總共33個額外的鹼基對添加至seqidno:18和19的引物(將26個鹼基添加至seqidno:18的5』端，並且將7個鹼基添加至seqidno:19的5』端，如分別在seqidno:20和21中給出)以便於使用abi3130遺傳分析儀的檢測)。提供了測試的每個品系的根腫病反應。

序列表

使用如37c.f.r.§1.822中限定的核苷酸鹼基的標準字母縮寫顯示所附序列表中所列的核酸序列。僅顯示每個核酸序列的一條鏈，但是應當理解通過任意參考展示鏈而包括互補鏈。

seqidno:1-2是用於從親本系dms100和quantum的基因組歐洲油菜dna擴增fad2基因的引物。

seqidno:3-4是用於從親本系dms100和quantum的基因組歐洲油菜dna擴增fad31基因的引物。

seqidno:5是突變體特異性正向引物，用於鑑定和/或測定促成芸苔中的高油酸和/或低亞油酸含量的fad2等位基因。

seqidno:6是反向引物，用於鑑定和/或測定促成芸苔中的高油酸和/或低亞油酸含量的fad2等位基因。

seqidno:7是從歐洲油菜品種dms100克隆的fad2基因的部分基因組核苷酸序列。

seqidno:8是與從歐洲油菜品種dms100克隆的基因組核苷酸序列簡併的fad2基因產物的胺基酸序列，該序列以如標示的「終止」密碼子中斷。

seqidno:9是從歐洲油菜品種quantum克隆的fad2基因的部分基因組核苷酸序列。

seqidno:10是與從歐洲油菜品種quantum克隆的基因組核苷酸序列簡併的fad2基因產物的胺基酸序列。

seqidno:11是與來自歐洲油菜品種bnfad2的基因組核苷酸序列簡併的fad2基因產物的胺基酸序列。

seqidno:12是從歐洲油菜品種dms100克隆的fad3c基因的基因組核苷酸序列。

seqidno:13是從歐洲油菜品種quantum克隆的fad3c基因的基因組核苷酸序列。

seqidno:14是正向引物，用於鑑定和/或測定促成芸苔中的高油酸和/或低亞油酸含量的fad32等位基因。

seqidno:15是突變體特異性反向引物，用於鑑定和/或測定促成芸苔中的高油酸和/或低亞油酸含量的fad32等位基因。

seqidno:16和17是用於從親本系dms100和quantum的基因組歐洲油菜dna擴增fad32基因的引物。

seqidno:18-21是可用於鑑定和/或測定根腫病抗性標誌物的例示性引物序列。

seqidno:22是在與seqidno:20和21一起使用時用於擴增經標記的dna片段的經螢光標記的m13通用引物序列，用於檢測。

發明詳述

i.幾個實施方案的概述

本文中描述了包含根腫病抗性表型的芸苔(例如歐洲油菜)植物及其後代。本文中還描述了從此類芸苔植物獲得的植物部分，包括植物的種子和植物材料。在具體的實施方案中，對根腫病的抗性可以是單基因的和/或多基因的。在具體的實施方案中，對根腫病的抗性可以是顯性的和/或隱性的。

使用包含根腫病抗性表型的歐洲油菜植物，已經鑑定出與根腫病抗性表型緊密連鎖的分子標誌物。特別地，鑑定出一個簡單序列重複(ssr)標誌物基因座，其與根腫病抗性表型緊密連鎖。此ssr標誌物特別可用於將此表型引入其它植物(例如其它歐洲油菜品種和其它芸苔物種)中，例如經由傳統的植物育種進行，而且還可用於鑑定可能具有此表型的植物(例如在通過重組遺傳工程產生的植物中)。在芸苔育種項目中利用至少一種與根腫病抗性表型緊密連鎖的分子標誌物可以大大降低對育種材料篩選根腫病抗性的時間和成本。例如，利用此類標誌物可以降低對昂貴的根腫病抗性篩選的需要，由此顯著有助於根腫病抗性芸苔品種的育種。

ii.術語

回交：回交方法可以用於將核酸序列導入植物中。幾十年以來已經廣泛使用回交技術來將新性狀導入植物中。jensen,n.編plantbreedingmethodology,johnwiley&sons,inc.,1988。在一個典型的回交方案中，將感興趣的初始品種(回歸親本)與攜帶要轉移的感興趣基因的第二品種(非回歸親本)雜交。然後，將來自此雜交的所得後代與回歸親本再次雜交，並重複該過程，直到獲得如下的植物，其中在來自非回歸親本的轉移基因外，在轉化植物中恢復回歸植物的基本上所有期望的形態學和生理學特徵。

根腫病抗性：植物對根腫病的抗性或耐受性指在包含芸苔根腫菌的田間種植時與相同植物的非抗性和/或非耐受性品系相比升高的生長、生產力、和/或植物中根小結大小和/或數目的降低。如本文中使用的，根腫病抗性還包括對根腫病抗性的耐受性。根腫病抗性可以由一種或多種基因、等位基因、或事件賦予。

遺傳基因座：如本文中使用的，術語「遺傳基因座」指染色體上的位置。

基因組基因座：如本文中使用的，術語「基因組基因座」指生物體的整組染色體內的位置。

連鎖不平衡：如本文中使用的，術語「連鎖不平衡」指兩個基因座之間或性狀與標誌物之間的統計學關聯。

連鎖的、緊密連鎖的、和極端緊密連鎖的：如本文中所使用的，基因或標誌物間的連鎖指染色體上的基因或標誌物顯示一起傳遞到下一代個體的可測量概率的現象。兩種基因或標誌物彼此越接近，此概率變得越接近(1)。如此，術語「連鎖的」可以指以大於0.5的概率(其從獨立分類預期，其中標誌物/基因位於不同染色體上)與某個基因一起傳遞的一種或多種基因或標誌物。由於染色體上兩個基因或標誌物的接近性與基因或標誌物會一起傳遞到下一代個體的概率直接相關，術語「連鎖的」在本文中也可以指在同一芸苔染色體上彼此位於約2.0mb內的一種或多種基因或標誌物。因此，兩種「連鎖的」基因或標誌物可以相隔約2.1mb；2.00mb；約1.95mb；約1.90mb；約1.85mb；約1.80mb；約1.75mb；約1.70mb；約1.65mb；約1.60mb；約1.55mb；約1.50mb；約1.45mb；約1.40mb；約1.35mb；約1.30mb；約1.25mb；約1.20mb；約1.15mb；約1.10mb；約1.05mb；約1.00mb；約0.95mb；約0.90mb；約0.85mb；約0.80mb；約0.75mb；約0.70mb；約0.65mb；約0.60mb；約0.55mb；約0.50mb；約0.45mb；約0.40mb；約0.35mb；約0.30mb；約0.25mb；約0.20mb；約0.15mb；約0.10mb；約0.05mb；約0.025mb；約0.012mb；和約0.01mb。基因可以與駐留於基因外顯子或內含子內的標誌物「連鎖」。在此情況中，連鎖的基因和標誌物之間的相隔0.00mb。

與fad2「連鎖的」標誌物的具體例子包括歐洲油菜基因組的連鎖群n5和n1中的核苷酸序列，例如歐洲油菜fad2基因中第411位的「c」至「t」突變。與fad3「連鎖的」標誌物的具體例子包括歐洲油菜基因組的連鎖群n14和n4中的核苷酸序列，例如歐洲油菜fad32基因中的第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基處的「g」至「a」突變。

標誌物和/或基因也可以與表型(例如牽涉連鎖基因或與連鎖標誌物連鎖的基因的表型)「連鎖」。一些實施方案包括與ho、ll、咪唑啉酮抗性、和/或根腫病抗性表型連鎖的標誌物。與ho/ll表型「連鎖的」標誌物的具體例子包括與fad2和fad3連鎖的標誌物。與根腫病抗性表型「連鎖的」標誌物的具體例子包括長度為300bp並且通過例示性引物seqidno:16和17擴增的基因組dna的連續區段。如本領域技術人員應當理解，若添加或從位於退火時使用的特定引物的遠端末端間的基因組dna跨距扣除核苷酸，則此ssr的長度會有所變化。

如本文中使用的，術語「緊密連鎖的」可以指在同一染色體上彼此位於約0.5mb內的一種或多種基因或標誌物。因此，兩種「緊密連鎖的」基因或標誌物可以相隔約0.6mb；約0.55mb；0.5mb；約0.45mb；約0.4mb；約0.35mb；約0.3mb；約0.25mb；約0.2mb；約0.15mb；約0.12mb；約0.1mb；約0.05mb；和約0.00mb。與fad2「緊密連鎖的」標誌物的具體例子包括歐洲油菜基因組的連鎖群n5和n1中的某些核苷酸序列，例如歐洲油菜fad2基因中第411位的「c」至「t」突變。與fad3「緊密連鎖的」標誌物的具體例子包括歐洲油菜基因組的連鎖群n14和n4中的某些核苷酸序列，例如歐洲油菜fad32基因中第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基處的「g」至「a」突變。與根腫病抗性表型「緊密連鎖的」標誌物的具體例子包括長度為300bp並且通過例示性引物seqidno:16和17擴增的基因組dna的連續區段。

如本文中使用的，術語「極端緊密連鎖的」可以指在同一染色體上彼此位於約100kb內的一種或多種基因或標誌物。因此，兩種「極端緊密連鎖的」基因或標誌物可以相隔約125kb；約120kb；約115kb；約110kb；約105kb；100kb；約95kb；約90kb；約85kb；約80kb；約75kb；約70kb；約65kb；約60kb；約55kb；約50kb；約45kb；約40kb；約35kb；約30kb；約25kb；約20kb；約15kb；約12kb；約10kb；約5kb；約1kb；和約0kb。與fad2「極端緊密連鎖的」標誌物的具體例子包括歐洲油菜基因組的連鎖群n5和n1中的某些核苷酸序列，例如歐洲油菜fad2基因中第411位的「c」至「t」突變。與fad3「極端緊密連鎖的」標誌物的具體例子包括歐洲油菜基因組的連鎖群n14和n4中的某些核苷酸序列，例如歐洲油菜fad32基因中第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基處的「g」至「a」突變。與根腫病抗性表型「極端緊密連鎖的」標誌物的具體例子包括長度為300bp並且通過例示性引物seqidno:16和17擴增的基因組dna的連續區段。

連鎖的，緊密連鎖的，和極端緊密連鎖的遺傳標誌物可以用於標誌物輔助育種項目來鑑定包含連鎖表型和/或基因類型的個體，以及將這些性狀和/或基因育種到芸苔品種中。

基因座：如本文中使用的，術語「基因座」指基因組上與可測量的特徵(例如，性狀)對應的位置。snp基因座通過與基因座內含有的dna雜交的探針限定。

標誌物：如本文中使用的，標誌物指可以用於鑑定具有特定等位基因(例如fad2、fad32和長度為300bp並且通過例示性引物seqidno:16和17擴增的基因組dna的連續區段)的植物的基因或核苷酸序列。標誌物可以描述為給定基因組基因座處的變異。遺傳標誌物可以是短的dna序列，諸如單鹼基對變化(單核苷酸多態性，或「snp」)周圍的序列，或長的dna序列，例如小衛星/簡單序列重複(「ssr」)。「標誌物等位基因」指特定植物中存在的標誌物型式。如本文中使用的，「標誌物」包括指染色體上用來鑑定染色體上獨特位置的基因座。基因型可以通過使用一種或多種標誌物限定。因此，「標誌物」包括指位於基因組的染色體上的基因中的一個或多個核苷酸位置。

分子標誌物特別可用於加速經由回交將基因或數量性狀基因座(qtl)導入良種栽培種或育種系中的方法。可以使用與基因連鎖的標誌物來選擇擁有期望性狀的植物，並且可以使用遍及基因組的標誌物來選擇在遺傳上與回歸親本相似的植物。young和tanksley(1989)theor.appl.genet.77:95-101；hospital等(1992)genetics132:1199-210。

如本文中使用的，術語「標誌物」可以指芸苔染色體dna的克隆區段(例如，seqidno:7或seqidno:12的核苷酸序列的區段)，並且還可以或備選地指與芸苔染色體dna的克隆區段互補的dna分子。

一些實施方案包括標誌物的「衍生物」。如本文中使用的，術語「衍生物」可以指特定標誌物序列的修飾。就分子標誌物而言的例示性此類修飾是與本文中公開的標誌物的核酸序列相關的一個或多個鹼基的取代、插入、和/或缺失，其保留，略微改變，或提高分子標誌物在鑑定一種或多種性狀(例如芸苔或其它含油種子作物物種中的根腫病抗性，和高油酸和/或低亞麻酸性狀)中的功能。本領域技術人員可以例如通過使用用於預測和優化序列結構的計算機建模技術容易地確定此類衍生物。因此，術語「衍生物」包括與本文中公開的一種或多種標誌物序列基本上相同，使得衍生物標誌物能夠擁有標誌物輔助育種中使用的公開的功能性的核酸序列。

標誌物輔助育種：如本文中使用的，術語「標誌物輔助育種」可以指在一種或多種複雜性狀(例如ho、ll、咪唑啉酮抗性、和/或根腫病抗性)方面直接育種的方法。在當前的實踐中，植物育種人員嘗試鑑定與農藝學期望的性狀連鎖的容易地可檢出的性狀，諸如花顏色、種皮外觀、或同工酶變體。植物育種人員然後通過追蹤容易地可檢出的性狀的分離來追蹤分離的育種群體中的農藝學性狀。然而，存在著可用於植物育種中使用的非常少的這些連鎖關係。

標誌物輔助育種提供了用於改善植物品種的時間和成本有效的方法。應用標誌物輔助育種的幾個例子牽涉使用同工酶標誌物。參見例如tanksley和orton編(1983)isozymesinplantbreedingandgenetics,amsterdam:elsevier。一個例子是與對番茄中的線蟲有害生物的抗性的基因關聯的同工酶標誌物。受到稱作mi的基因控制的抗性位於番茄的染色體6上，並且與aps1(即一種酸性磷酸酶同工酶)非常緊密連鎖。aps1同工酶標誌物間接選擇mi基因的用途提供如下的優點，即可以用標準的電泳技術明確測定群體中的分離；可以在幼苗組織中對同工酶標誌物評分，消除對將植物維持至成熟的需要；以及同工酶標誌物等位基因的共顯性容許區別純合子和雜合子。參見rick(1983)於tanksley和orton,見上文。

在一些實施方案中，可以經由使用核酸探針檢測植物中的標誌物存在。探針可以是dna分子或rna分子。可以通過本領域中已知的手段，例如使用dna分子模板合成rna探針。探針可以含有標誌物的整個或部分的核苷酸序列和來自芸苔基因組的額外的、連續的核苷酸序列。這在本文中稱為「連續探針」。所述額外的、連續的核苷酸序列稱為初始標誌物的「上遊」或「下遊」，這取決於來自芸苔染色體的連續核苷酸序列是在初始標誌物的5』還是3』側，如按照慣例理解的。對於與ho性狀連鎖的標誌物的例子，所述額外的、連續的核苷酸序列可以位於芸苔染色體上初始標誌物與fad2基因的第411位之間。對於與ll性狀連鎖的標誌物的例子，所述額外的、連續的核苷酸序列可以位於芸苔染色體上初始標誌物與fad3基因的第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基之間。如本領域普通技術人員認可的，可以幾乎無限重複獲得標誌物中納入的額外的、連續的核苷酸序列的方法(僅受限於染色體的長度)，由此沿著芸苔染色體鑑定額外的標誌物。可以在本發明的一些實施方案中使用所有上文描述的標誌物。

可以合成或通過克隆製備寡核苷酸探針序列。合適的克隆載體是本領域技術人員公知的。寡核苷酸探針可以是標記的或未標記的。存在用於標記核酸分子的極其多種技術，包括例如但不限於：通過缺口平移的放射性標記；隨機引發；用末端脫氧轉移酶(deoxytransferase)的加尾；等等，其中採用的核苷酸例如用放射性32p標記。可以使用的其它標記物包括例如但不限於：螢光團；酶；酶底物；酶輔因子；酶抑制劑；等等。或者，自身或與其它反應劑一起提供可檢測信號的標記物的使用可以用受體結合的配體替換，其中受體是標記的(例如，通過上文指定的標記物進行)，從而自身或與其它試劑一起提供可檢測信號。參見例如leary等(1983)proc.natl.acad.sci.usa80:4045-9。

探針可以含有與初始標誌物的核苷酸序列不連續的核苷酸序列；此探針在本文中稱為「非連續探針」。非連續探針的序列與芸苔染色體上的初始標誌物的序列足夠接近地定位，從而非連續探針與相同基因(例如fad2或fad3)遺傳連鎖。例如，在一些實施方案中，非連續探針可以位於芸苔染色體上的初始標誌物的500kb；450kb；400kb；350kb；300kb；250kb；200kb；150kb；125kb；120kb；100kb；0.9kb；0.8kb；0.7kb；0.6kb；0.5kb；0.4kb；0.3kb；0.2kb；或0.1kb內。

探針可以是要檢測的標誌物的精確拷貝。探針也可以是包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的核酸分子，所述核苷酸序列與芸苔染色體dna的克隆區段(例如，如以seqidno:7中包含核苷酸位置411的區段和seqidno:12中包含基因的第三個內含子的5』剪接位點的第一個核苷酸位置的區段限定)是基本上相同的。如本文中使用的，術語「基本上相同的」可以指超過85％相同的核苷酸序列。例如，基本上相同的核苷酸序列與參照序列可以是85.5％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或99.5％相同的。

探針也可以是與要檢測的標誌物的精確拷貝(「dna靶物」)「特異性可雜交」或「特異性互補」的核酸分子。「特異性可雜交」和「特異性互補」是如下的術語，其指示足夠的互補性程度，使得核酸分子和dna靶物之間發生穩定的且特異性的結合。因此，在一些例子中，探針可以是dna靶物的互補物。然而，核酸分子與要特異性可雜交的其靶序列不需要是100％互補的。在存在有足夠的互補性程度以避免核酸在期望特異性結合的條件下，例如在嚴格雜交條件下對所有非靶序列的非特異性結合時，核酸分子是特異性可雜交的。因此，在一些例子中，探針與dna靶物的互補物可以是基本上相同的。例如，探針與dna靶物的互補物可以是85.5％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或99.5％相同的。

探針可以包含在包含額外的核酸序列的核酸分子內；例如啟動子；轉錄信號；和/或載體序列。可以使用探針限定與基因緊密連鎖的別的標誌物，所述基因牽涉ho、ll、咪唑啉酮抗性、和/或根腫病表型(例如fad2和fad3)。如此鑑定的標誌物可以與本公開內容中命名的例示性標誌物等同，並且因此在本發明的範圍內。

產生特定嚴格性程度的雜交條件會隨選擇的雜交方法的性質及雜交核酸序列的組成和長度而有所變化。一般地，雜交的溫度和雜交緩衝液的離子強度(尤其是na+和/或mg++濃度)會決定雜交嚴格性，儘管清洗次數也影響嚴格性。關於獲得特定嚴格性程度需要的雜交條件的計算是本領域普通技術人員已知的，並且例如在sambrook等(編)molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,第1-3卷,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,1989,第9章和第11章；及hames和higgins(編)nucleicacidhybridization,irlpress,oxford,1985中討論。關於核酸雜交的更為詳細的用法說明書和指導可以參見例如tijssen,「overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,」於laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicacidprobes,第i部分,第2章,elsevier,ny,1993；和ausubel等編,currentprotocolsinmolecularbiology,第2章,greenepublishingandwiley-interscience,ny,1995。

如本文中所使用的，「嚴格條件」涵蓋僅在雜交分子與dna靶物之間存在有小於25％錯配時發生雜交的條件。「嚴格條件」包括其它特定的嚴格性水平。如此，如本文中使用的，「溫和(moderate)嚴格性」條件是具有超過25％序列錯配的分子不會雜交的那些條件；「中等(medium)嚴格性」條件是具有超過15％錯配的分子不會雜交的那些條件；而「高嚴格性」條件是具有超過10％錯配的分子不會雜交的那些條件。「非常高嚴格性」的條件是具有超過6％錯配的分子不會雜交的那些條件。

在具體的實施方案中，嚴格條件是於65℃在6x鹽水-檸檬酸鈉(ssc)緩衝液、5x登哈特(denhardt)氏溶液、0.5％sds、和100μg剪切的鮭魚精巢dna中雜交，接著於65℃在2xssc緩衝液和0.5％sds中，接著是1xssc緩衝液和0.5％sds中，最終0.2xssc緩衝液和0.5％sds中序貫清洗15-30分鐘。

咪唑啉酮：如本文中使用的，術語「咪唑啉酮」指幹擾植物中酶乙醯乳酸合酶(als)(又稱為乙醯羥酸合酶(ahas))的作用的除草劑，該幹擾最終可以導致植物死亡。咪唑啉酮的例子包括但不限於：咪草酸(imazamethbenz)；甲氧咪草煙(imazamox)；甲咪唑煙酸(imazapic)；滅草煙(imazapyr)；滅草喹(imazaquin)；和咪唑乙煙酸(imazethapyr)。

如本文中使用的，「咪唑啉酮抗性」指至少部分以在與同一物種的野生型植物相比時對抗性植物的健康和/或生活力的損傷降低、改善和/或消除為特徵的表型。咪唑啉酮抗性包括對咪唑啉酮的耐受性。咪唑啉酮抗性可以由改變乙醯乳酸合酶(als)，又稱為乙醯羥酸合酶(ahas)，且容許該酶對抗或耐受咪唑啉酮作用的一種或多種基因、等位基因、或事件賦予。賦予咪唑啉酮抗性的例示性基因包括但不限於那些例如由lee等(1988)emboj.7:1241，及miki等(1990)theor.appl.genet.80:449(兩篇都通過提及完整併入本文)描述的基因。植物對咪唑啉酮的抗性或耐受性可以容許在栽培有植物的區域中為了控制雜草而需要時使用咪唑啉酮。

indel：如本文中使用的，術語「indel」一般用於描述基因中的插入或缺失。因此，「indel」指可以作為插入、缺失、或其組合的特定突變。如本文中使用的，「插入」或「添加」指與天然存在的分子相比分別導致一個或多個胺基酸或核苷酸殘基的添加的胺基酸或核苷酸序列變化。

油含量：如本文中使用的，「油含量」指植物或植物部分(例如種子)中的油表徵。在一些實施方案中，油含量以全乾燥種子的百分比表示。在一些實施方案中，特定的種子油含量是特定植物品種特徵性的，並且可以用於區別所述特定品種的植物與同一物種的其它植物。可以經由使用多種分析技術，諸如例如但不限於nmr、nir、fame分析、和soxhlet提取測量油含量。

在具體的實施方案中，特徵性油含量可以包括「百分比油酸」和/或「百分比亞麻酸」的描述。如本文中使用的，「百分比油酸」指如通過fame分析測量的油酸佔總種子油的百分比。如本文中使用的，「百分比亞麻酸」指如通過fame分析測量的亞麻酸佔總種子油的百分比。

fame分析可以用於測量樣品中總脂肪酸中特定脂肪酸的百分比組成。就種子油而言，可以如下測定百分比，即從種子提取油樣品，生成所述油樣品中存在的脂肪酸的甲酯，並且使用氣相層析分析樣品中的各種脂肪酸的比例。如此測定的油含量可以是品種的區別性特徵。

序列同一性：如本文中在兩種核酸或多肽序列的背景中所使用的，術語「序列同一性」或「同一性」可以指兩種序列中在規定的比較窗裡為了實現最大對應性而比對時相同的殘基。

在提及蛋白質使用序列同一性百分比時，認可的是，不相同的殘基位置經常相差保守的胺基酸取代，其中胺基酸殘基用具有類似化學特性(例如，電荷、疏水性或空間效應)的其它胺基酸殘基取代，並且因此不改變分子的功能特性。

因此，在序列相差保守取代時，百分比序列同一性可以向上調節以校正不相同殘基位點處取代的保守性質。相差此類保守取代的序列被說成具有「序列相似性」或「相似性」。用於進行此調節的技術是本領域普通技術人員公知的。通常，此類技術牽涉將保守取代評分為部分的，而不是完全的錯配，由此增加百分比序列同一性。例如，在對相同的胺基酸給予0-1的得分，而對非保守取代給予0得分的情況中，對保守取代給予0-1的得分。可以計算保守取代的得分，例如，如程序pc/gene(intelligenetics,mountainview,ca)中執行的。

如本文中所使用的，術語「序列同一性百分比」可以指在比對窗裡比較兩個最佳比對序列時測定的數值，其中為了兩個序列的最佳比對，比較窗中序列的部分與參照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通過測定兩個序列中存在相同核苷酸或胺基酸殘基的位置的數目以產生匹配位置數目，將匹配位置的數目除以比較窗中位置的總數，並將結果乘以100以產生序列同一性百分比來計算百分比。可以用於測定兩種序列間的同一性和相似性的電腦程式包括：gcg程序包(devereux等(1984)nucleicacidsres.12(1):387)；blastp；blastn；fasta；和tfasta(atschul等(1990)j.mol.biol.215:403)。

統計學關聯的：如本文中使用的，術語「統計學關聯的」指兩種事件以比可歸於偶然性的頻率大的頻率一起發生的趨勢，其中可歸於偶然性的頻率以預先確定的顯著性水平表示。可以通過本領域技術人員公知的許多顯著性檢驗中的任一種，例如anova或t檢驗測定統計學關聯。參見例如statisticalmethods,g.w.snedecor和w.g.cochran,iowastateuniversitypress,ames,iowa(1985)。優選地，alpha的顯著性水平小於0.01。例如，本發明的顯著性水平範圍可以為0-約0.250，例如小於約0.0001,0.00050,0.0010,0.0050,0.010,0.025,0.050,0.100或0.250，包括其間的任何水平。

性狀或表型：術語「性狀」和「表型」在本文中可互換使用。出於本公開內容的目的，特別感興趣的性狀包括例如但不限於：高油酸含量；低亞麻酸含量；咪唑啉酮抗性；根腫病抗性；和細胞質雄性不育的能育性恢復。

iii.fad2和fad3基因中的ho/ll突變

一些實施方案包括fad2和fad3基因中賦予芸苔屬植物中的ho/ll(高油酸(fad2)和低亞麻酸(fad3))表型的突變。本發明的一些實施方案利用包含核酸序列的分離的核酸分子，所述核酸序列包含這些突變之一或兩者以對接受分離的核酸分子導入的植物賦予ho/ll性狀之任一或兩者。另外，此類分離的核酸分子可以包含與芸苔中的ho和/或ll表型緊密連鎖的標誌物。

歐洲油菜品種dms100(突變體類型)和quantum(野生型)在fad2(脂肪酸去飽和酶-2)和fad3(脂肪酸去飽和酶-3)等位基因的克隆中使用。突變體dms100品種從源自globalxag019姐妹系雜交的單一f3植物選擇的f4批量衍生。dms100是一種具有約77％的油酸含量和約3％的亞麻酸含量的ho/ll系。quantum是一種含有相當低的油酸(～66％)含量和高亞麻酸(～7％)含量的商業野生型品種。如本文中詳細討論的，涉及脂肪酸合成途徑的酶fad2和fad3去飽和酶的dms100基因組克隆的測序揭示了每個基因中的單核苷酸突變。其它序列分析顯示了突變是dms100中改變的脂肪酸含量的原因。這兩個突變與先前發表的突變(等(1998)mol.breeding4:543-50；jourdren等(1996)theor.appl.genet.93:512-8)截然不同。

一些實施方案利用fad2基因中與特定油含量有關的單核苷酸多態性(snp)的鑑定，所述特定油含量在一些應用中可以是期望的。芸苔中的油酸(c18:1)含量受到fad2基因影響，所述fad2基因編碼負責將油酸去飽和成亞油酸(c18:2)的酶(內質delta12油酸去飽和酶)。具體的實施方案包括單核苷酸取代突變，其在fad2可讀框中引入過早的「終止」密碼子，生成截短的表達產物。在某些實施方案中，單核苷酸取代突變位於fad2基因的第411位(參見圖1)。例如，突變可以是第411位的「c」至「t」突變，其產生終止密碼子「tag」，並且生成長度僅為185個胺基酸的fad2表達產物。在一些實施方案中，fad2基因中的單核苷酸取代突變生成截短的表達多肽，其作為將油酸去飽和成亞油酸的活性去飽和酶具有降低的功能(例如無功能或基本上無功能)。

fad2基因的失活突變體等位基因通過降低油酸去飽和成亞油酸來促成芸苔中油酸含量的控制。在實施方案中，fad2突變體等位基因包含在包含第411位核苷酸的區域中與seqidno:7的互補物特異性可雜交的核苷酸序列，如通過與seqidno:7比對確定的。在具體的實施方案中，fad2突變體等位基因是seqidno:7。在一些實施方案中，本發明還包括那些與seqidno:7的突變體fad2等位基因基本上相同的核苷酸序列。例如在一些實施方案中，核酸分子是fad2同系物(例如直向同系物)，其與seqidno:7的突變體fad2等位基因是至少約85％相同的。fad2同系物與seqidno:7的突變體fad2等位基因可以是86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％；99.5％；或99.8％相同的。此類fad2同系物可以從多種生物體(例如芸苔)的對於本領域技術人員容易得到的任何完整或部分基因組容易地鑑定並分離。

一些實施方案還包括seqidno:7的突變體fad2等位基因的功能性變體。fad2的功能性變體包括例如seqidno:7的fad2序列、包含一處或多處核苷酸取代、缺失或插入的序列，其中功能性變體降低芸苔細胞中油酸去飽和成亞油酸，其可以通過本領域普通技術人員公知的常規技術測量。例如，可以通過將突變或片段同源重組到在功能性fad2等位基因方面純合的植物中，接著從植物常規分離並表徵種子油來測定fad2基因的特定變體在芸苔細胞中降低將油酸去飽和成亞油酸的能力。fad2基因的功能性變體可以通過定點誘變，誘導突變創建，或者它們可以以等位變體(多態性，例如snp)存在。具體的實施方案包括在fad2可讀框中引入過早的「終止」密碼子，生成截短且無活性的表達產物的突變。

一些實施方案利用fad32基因中與特定油含量有關的單核苷酸多態性(snp)的鑑定，所述特定油含量在一些應用中可以是期望的。fad3基因編碼內質delta-15亞油酸去飽和酶，即一種負責亞油酸(c18:2)去飽和成亞麻酸(c18:3)的酶。具體地，fad32基因促成亞麻酸含量的控制。具體的實施方案包括單核苷酸取代突變，其幹擾fad32基因的正確剪接，由此生成不完全翻譯的表達產物。在某些實施方案中，單核苷酸取代突變位於fad32基因中內含子的5』剪接位點的第一個鹼基。例如，內含子可以是歐洲油菜的fad32基因中的第三個內含子、蕪菁的fad32基因中的第六個內含子、或別的植物物種的fad32基因中的同源內含子。例如，突變可以是歐洲油菜fad32基因中第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基處的「g」至「a」突變，其幹擾基因的正確剪接(參見圖3)。在一些實施方案中，幹擾fad32基因的正確剪接，由此生成不完全翻譯的表達產物的單核苷酸取代突變可以導致無活性的酶，並且阻斷亞油酸(c18:2)去飽和成亞麻酸(c18:3)，最終導致芸苔種子中c18:3積累的降低。

fad3基因的失活突變體等位基因通過降低亞油酸去飽和成亞麻酸來促成芸苔中亞麻酸含量的控制。在實施方案中，fad3突變體等位基因包含在包含fad32基因中內含子的5』剪接位點的第一個鹼基處的核苷酸的區域中與seqidno:12的互補物特異性可雜交的核苷酸序列，如通過與seqidno:12比對測定的。在具體的實施方案中，fad3突變體等位基因是seqidno:12。在一些實施方案中，本發明還包括那些與seqidno:12的突變體fad3等位基因基本上相同的核苷酸序列。例如，在一些實施方案中，核酸分子是fad3同系物(例如直向同系物)，其與seqidno:12的突變體fad3等位基因是至少約85％相同的。fad3同系物與seqidno:12的突變體fad3等位基因可以是86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％；99.5％；或99.8％相同的。此類fad3同系物可以從多種生物體(例如芸苔)的對於本領域技術人員容易得到的任何完整或部分基因組容易地鑑定並分離。

一些實施方案還包括seqidno:12的突變體fad3等位基因的功能性變體。fad3的功能性變體包括例如seqidno:12的fad3序列、包含一處或多處核苷酸取代、缺失或插入的序列，其中功能性變體降低芸苔細胞中亞油酸去飽和成亞麻酸，其可以通過本領域普通技術人員公知的常規技術測量。例如，可以通過將突變或片段同源重組到在功能性fad3等位基因方面純合的植物中，接著從植物常規分離並表徵種子油來測定fad3基因的特定變體在芸苔細胞中降低將亞油酸去飽和成亞麻酸的能力。fad3基因的功能性變體可以通過定點誘變，誘導突變創建，或者它們可以以等位變體(多態性，例如snp)存在。具體的實施方案包括在fad2可讀框中引入過早的「終止」密碼子，生成截短且無活性的表達產物的突變。

iv.分子標誌物及其應用

本發明的實施方案包括與感興趣基因(例如fad2或fad3)連鎖(例如連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的分子標誌物(即核酸標誌物)。例如，在一些實施方案中的感興趣基因可以是促成芸苔中選自下組的表型或性狀的基因：高油酸，低亞麻酸，除草劑抗性(例如草甘膦抗性和咪唑啉酮抗性)，和根腫病抗性。具體的實施方案包括使用此類標誌物，例如以轉移感興趣的基因(例如其包含在dna區段中)，以將感興趣的基因導入宿主中，以及鑑定生物體或來自生物體的dna樣品中的感興趣基因的方法。在具體的實施方案中，可以使用ssr標誌物轉移dna區段，其包含促成根腫病抗性歐洲油菜品種的根腫病抗性的基因。此類ssr標誌物可以包含基因組dna的連續區段，其長度為300bp，並且通過例示性引物seqidno:18和19擴增。

在一些實施方案中，在感興趣基因側翼的標誌物可以用於轉移供體親本dna的區段，其明確含有感興趣的基因。在具體的實施方案中，歐洲油菜連鎖群n5和n1中的標誌物，或與此類標誌物等同的標誌物可以用於轉移包含來自歐洲油菜品種dms100的fad2的dna區段。在這些和其它實施方案中，歐洲油菜連鎖群n14和n4中標誌物，或與此類標誌物等同的標誌物可以用於轉移包含歐洲油菜品種dms100的fad32的dna區段。

在一些實施方案中，使用在感興趣基因側翼的標誌物以轉移明確含有感興趣基因的供體親本dna區段的方法可以包括用與同感興趣基因連鎖的標誌物特異性可雜交的探針分析兩個親本植物的基因組dna；有性雜交兩個親本植物基因型以獲得後代群體，並且對那些後代分析與感興趣的基因連鎖的標誌物的存在，將含有與感興趣基因連鎖的標誌物的後代與接受體基因型回交以生成第一回交群體，然後，繼續進行回交程序，直到獲得包含由親本基因型和感興趣基因展現的任何期望性狀的最終後代。在具體的實施方案中，通過在每個世代的標誌物分析選擇在每個雜交和回交步驟中獲得的個體後代。在一些實施方案中，用與同感興趣基因連鎖的標誌物特異性可雜交的探針分析兩個親本植物的基因組dna揭示親本植物之一包括與探針特異性雜交的較少連鎖標誌物，或與探針特異性雜交的無一連鎖標誌物。

在一些實施方案中，可以使用與感興趣基因連鎖的標誌物通過遺傳轉化將感興趣的基因導入芸苔屬的植物中。在具體的實施方案中，歐洲油菜連鎖群n5或n1中的標誌物，或與此類標誌物等同的標誌物可以用於將fad2基因轉移到芸苔屬的植物中。在這些和其它實施方案中，歐洲油菜連鎖群n14或n4中的標誌物，或與此類標誌物等同的標誌物可以用於將fad32基因轉移到芸苔屬的植物中。在這些和其它實施方案中，可以使用ssr標誌物來將促成根腫病抗性的基因轉移到芸苔屬的植物中。此類ssr標誌物可包括基因組dna的連續區段，其長度為300bp，並且通過例示性引物seqidno:18和19擴增。

在一些實施方案中，通過遺傳重組將感興趣的基因導入芸苔屬植物中的方法可以包括用與同感興趣基因連鎖的標誌物特異性可雜交的探針分析植物(例如歐洲油菜品種dms100)的基因組dna以鑑定植物中的感興趣基因；例如通過提取基因組dna，並用一種或多種酶限制性內切核酸酶消化基因組dna，來分離植物基因組dna中包含感興趣基因的區段；任選地，擴增分離的dna區段；將分離的dna區段導入芸苔屬宿主植物的細胞或組織中，並用探針分析宿主植物的dna以鑑定宿主植物中的感興趣基因，所述探針與同感興趣基因連鎖的標誌物特異性可雜交。在具體的實施方案中，可以將分離的dna區段導入宿主植物中，使得其穩定整合入宿主植物的基因組中。

在一些實施方案中，可以使用與感興趣基因連鎖的標誌物將感興趣的基因導入與芸苔屬植物不同的生物體(例如植物)中。在具體的實施方案中，感興趣基因是fad2，並且標誌物在歐洲油菜連鎖群n5或n1中，或者是等同的標誌物。在具體的實施方案中，感興趣的基因是fad3，並且標誌物在歐洲油菜連鎖群n14或n4中，或者是等同的標誌物。在具體的實施方案中，感興趣的基因是促成根腫病抗性的基因，並且標誌物是ssr標誌物或等同標誌物，所述ssr標誌物包含基因組dna中長度為300bp並且通過例示性引物seqidno:18和19擴增的連續區段。

在一些實施方案中，將感興趣的基因導入與芸苔屬植物不同的生物體(例如植物)中的方法可以包括用與同感興趣基因連鎖的標誌物特異性可雜交的探針分析芸苔植物(例如歐洲油菜品種dms100的植物)的基因組dna以鑑定植物中的感興趣基因；例如通過提取基因組dna，並用一種或多種酶限制性內切核酸酶消化基因組dna，來分離植物基因組dna中包含感興趣基因的區段；任選地，擴增分離的dna區段；將分離的dna區段導入與芸苔屬植物不同的生物體中，並用探針分析生物體的dna以鑑定生物體中的感興趣基因，所述探針與同感興趣基因連鎖的標誌物特異性可雜交。在具體的實施方案中，可以將分離的dna區段導入生物體中，使得其穩定整合入生物體的基因組中。

在一些實施方案中，可以使用與感興趣基因連鎖的標誌物來鑑定包含感興趣基因的植物。在具體的實施方案中，植物可以是芸苔。在一些實施方案中，可以從植物提取核酸分子(例如基因組dna或mrna)。然後，可以使提取的核酸分子與探針接觸，所述探針與同感興趣基因連鎖的標誌物特異性可雜交。探針與提取的核酸分子的特異性雜交指示植物中感興趣基因的存在。

關於分子標誌物及其使用方法的一般信息可以參見例如andrewh.paterson,「thednarevolution」(第2章)於：genomemappinginplants,andrewh.paterson編,1996,academicpress/r.g.landiscompany,austin,tex.,pp.7-21。

v.fad2和fad3基因的分子標誌物

提供了與芸苔中突變體等位基因fad2和fad3中每種連鎖(例如緊密連鎖)的分子標誌物。鑑定了含有ho性狀(fad2)和ll性狀(fad3)中牽涉的序列的dna區段。這些區段位於標誌物周圍及之間，所述標誌物與基因組連鎖群中的突變體等位基因連鎖(例如緊密連鎖)。因此，還提供了包含具有失活突變的突變體fad2或fad3基因的核酸分子。鑑定的區段及其標誌物在本文中部分以其在歐洲油菜基因組中連鎖群中的位置描述。例如，fad2和與其連鎖的分子標誌物可以位於連鎖群n5和n1中。還在例子中，fad3和與其連鎖的分子標誌物可以位於連鎖群n14和n4中。

鑑定的區段的位置及其標誌物可以以重組頻率或圖距單位表示。在歐洲油菜群體dms100xquantum中實施本文中描述的實施方案。然而，以圖距單位計的特定區段和標誌物的位置可以參照芸苔近交基因組序列表示。預期的是，以圖距單位計對特定區段和標誌物給予的數字可以在栽培種間有所變化，並且不是dna區段和標誌物的必要限定的一部分，所述dna區段和標誌物在其它情況中例如以核苷酸序列描述。

芸苔系dms100種質中存在的fad2和fad32基因中的特定例示性失活單核苷酸突變是造成此品系中觀察到的升高的油酸(ho)和降低的亞麻酸(ll)含量的因素。使用與這些中任一處或兩處突變連鎖的分子標誌物，可以使用標誌物輔助漸滲來將dms100及其後代或衍生物的ho/ll性狀，和/或dms100及其後代或衍生物的突變fad2和fad32基因(分別為seqidno:7(參見圖1)和seqidno:12(參加圖3))引入芸苔系中。

使用與突變體fad2或fad3等位基因連鎖或駐留於突變體fad2或fad3等位基因內的核酸分子標誌物將ho/ll性狀引入新植物和種質中以及鑑定具有ho/ll性狀的植物的方法可以導致植物發育者節約成本，因為此類方法可以降低或消除對意圖引入ho/ll性狀的雜交的後代測定表型的需要。

在實施方案中，與ho性狀極端緊密連鎖的標誌物是歐洲油菜fad2基因的第411位(或來自例如芸苔的比對序列的相同位置)的「t」核苷酸，如在圖1中描繪並在seqidno:7中表示的。在實施方案中，與ll性狀極端緊密連鎖的標誌物是歐洲油菜fad32基因中的第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基(或來自例如芸苔的比對序列的相同位置)處的「a」核苷酸，如在圖3中描繪並在seqidno:12中表示的。別的標誌物可以鑑定為等同於這些例示性標誌物之任一種，例如通過測定別的標誌物與例示性標誌物之間的重組頻率進行。此類測定可以利用基於mather(1931),themeasurementoflinkageinheredity,methuen&co.,london的方法的改良正交比較(orthogonalcontrast)方法，接著是最大似然檢驗以測定重組頻率。allard(1956)hilgardia24:235-78。為了在目前公開的方法中使用，若重組頻率的數值在任何栽培種中小於或等於0.10(即10％)，則認為別的標誌物等同於具體的參照標誌物。

與高油酸(ho)性狀極端緊密連鎖的標誌物包括用於將ho表型引入芸苔屬植物中的手段。用於將ho表型引入芸苔屬植物中的手段可以包括來自植物的核酸序列，該核酸序列的檢出至少提供強烈的指示，即植物包含核酸序列，該核酸序列包含促成ho性狀的突變體fad2等位基因。用於將ho表型引入芸苔屬植物中的手段的例子是歐洲油菜fad2基因的第411位的「t」核苷酸，如在圖1中描繪並在seqidno:7中表示的。與低亞麻酸(ll)性狀極端緊密連鎖的標誌物包括用於將ll表型引入芸苔屬植物中的手段。用於將ll表型引入芸苔屬植物中的手段可以包括來自植物的核酸序列，所述核酸的檢出至少提供強烈的指示，即植物包含核酸序列，該核酸序列包含促成ll性狀的突變體fad32等位基因。用於將ll表型引入芸苔屬植物中的手段的例子是歐洲油菜fad32基因中第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基處的「a」核苷酸，如在圖3中描繪並在seqidno:12中表示的。

涉及與高油酸(ho)性狀極端緊密連鎖的標誌物的是用於鑑定攜帶促成芸苔屬植物中ho表型的基因的植物的手段。此類手段包括在添加至自植物獲得的樣品時呈現可檢測信號的分子，所述植物攜帶促成芸苔屬植物中ho表型的基因。核酸的特異性雜交是可檢測信號，因此，與促成ho表型的基因特異性雜交的核酸探針可以是用於鑑定植物的手段，所述植物攜帶促成芸苔屬植物中ho表型的基因。在一些例子中，用於鑑定攜帶促成芸苔屬植物中ho表型的基因的植物的手段是探針，其與歐洲油菜fad2基因中包含第411位「c」至「t」突變的區段特異性雜交，但是不與野生型歐洲油菜fad2基因(例如seqidno:5)的相同區段雜交。

涉及與低亞麻酸(ll)性狀極端緊密連鎖的標誌物的是用於鑑定攜帶促成芸苔屬植物中ll表型的基因的植物的手段。此類手段包括在添加至自植物獲得的樣品時呈現可檢測信號的分子，所述植物攜帶促成芸苔屬植物中ll表型的基因。核酸的特異性雜交是可檢測信號，因此，與促成ll表型的基因特異性雜交的核酸探針可以是用於鑑定植物的手段，所述植物攜帶促成芸苔屬植物中ll表型的基因。在一些例子中，用於鑑定攜帶促成芸苔屬植物中ll表型的基因的植物的手段是探針，其與歐洲油菜fad32基因中包含第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基處的「g」至「a」突變的區段特異性雜交，但是不與野生型歐洲油菜fad32基因(例如seqidno:15)的相同區段雜交。

vi.根腫病抗性的標誌物

提供了與芸苔中的根腫病抗性連鎖(例如緊密連鎖)的分子標誌物。含有根腫病抗性中涉及的基因的dna區段與這些標誌物連鎖。因此，能夠使用提供的標誌物，利用並操作包含根腫病抗性中涉及的基因的核酸分子。鑑定的標誌物及與其連鎖的序列可以部分以其在歐洲油菜基因組中連鎖群中的位置描述。在一些例子中，與芸苔中的根腫病抗性連鎖的標誌物是ssr標誌物。

在歐洲油菜群體中實施本文中描述的實施方案，所述歐洲油菜群體通過雜交根腫病抗性品種mendel與含有能育性恢復基因(restr)和草甘膦抗性(gly)的ho/ll歐洲油菜近交物獲得。鑑定的標誌物的位置及與其連鎖的dna序列(例如基因)可以以重組頻率或圖距單位表示。以圖距單位計的特定序列和標誌物的位置可以參照芸苔近交物基因組序列表示。預期的是，以圖距單位計對特定區段和標誌物給予的數字可以在栽培種間有所變化，並且不是任何dna序列或標誌物的必要限定的一部分，所述dna序列和標誌物在其它情況中例如可以以核苷酸序列描述。

芸苔系mendel種質中存在的標誌物可以與造成此根腫病抗性來源品系中觀察到的根腫病抗性的因素連鎖。例如，通過使用這些標誌物或其等同物，可以使用標誌物輔助漸滲將mendel及其後代或衍生物的根腫病抗性引入芸苔系中。

可以將與芸苔中的根腫病抗性連鎖的標誌物整合到標誌物輔助選擇項目中，用於開發新的根腫病抗性基因型和種質。此類項目容許篩選數千個芸苔後代，該芸苔後代例如源自雜交具有一種或多種期望的性狀的芸苔近交物和mendel(或其後代或衍生物)。此類標誌物還容許根腫病抗性品系的相當快速且便宜的鑑定，之後在根腫病感染測定法中的生物學篩選期間利用資源，諸如溫室，田地，等等。目前，通常在以相當大的費用進行的約束性室內溫室試驗中實施疾病抗性篩選。

在實施方案中，與根腫病抗性表型連鎖的標誌物是ssr標誌物，其包含基因組歐洲油菜dna中長度為300bp並且通過例示性引物seqidno:18和19擴增的連續區段，所述標誌物與歐洲油菜植物中的根腫病抗性連鎖。本領域技術人員應當認可，同一基因座的等同標誌物可以通過改變引物的長度或位置限定，所述引物用於改變基因組歐洲油菜dna中通過引物擴增的連續區段的長度。

別的標誌物可以鑑定為等同於此例示性標誌物，例如通過測定別的標誌物與例示性ssr標誌物之間的重組頻率進行。此類測定可以利用基於mather(1931),themeasurementoflinkageinheredity,methuen&co.,london的方法的改良正交比較方法，接著是最大似然檢驗以測定重組頻率。allard(1956)hilgardia24:235-78。為了在目前公開的方法中使用，若重組頻率的數值在任何栽培種中小於或等於0.10(即10％)，則認為別的標誌物等同於具體的參照標誌物。

與根腫病抗性連鎖的標誌物包括用於將根腫病抗性引入芸苔屬植物中的手段。用於將根腫病抗性引入芸苔屬植物中的手段可以包括來自植物的核酸序列，該核酸序列的檢出至少提供強烈的指示，即植物包含核酸序列，該核酸序列包含促成根腫病抗性表型的dna序列。用於將根腫病抗性引入芸苔屬植物中的手段的例子是基因組dna中長度為300bp並且通過例示性引物seqidno:18和19擴增的連續區段，所述標誌物與歐洲油菜植物中的根腫病抗性連鎖。

涉及與根腫病抗性連鎖的標誌物的是用於鑑定攜帶促成芸苔屬植物中根腫病抗性的基因的植物的手段。此類手段包括在添加至自植物獲得的樣品時呈現可檢測信號的分子，所述植物攜帶促成芸苔屬植物中根腫病抗性的基因。核酸的特異性雜交是可檢測信號，因此，與促成根腫病抗性的dna序列特異性雜交的核酸探針可以是用於鑑定植物的手段，所述植物攜帶促成芸苔屬植物中根腫病抗性的基因。在一些例子中，用於鑑定攜帶促成芸苔屬植物中根腫病抗性的基因的植物的手段是探針，其與基因組dna中長度為300bp並且通過例示性引物seqidno:18和19擴增的連續區段特異性雜交，但是不與通過相同引物從野生型基因組dna擴增的任何區段雜交。

在上述內容外，可以在實施方案中使用以seqidno:18-22列出的引物組或其等同物，以篩選根腫病抗性中涉及的基因的存在。在使用這些引物或其等同物從基因組芸苔dna樣品擴增居間dna序列時，可以顯現擴增的dna片段(例如通過凝膠電泳)。300bp片段(或使用與seqidno:18-22功能等同的引物預期的大小的片段)的存在指示獲得基因組dna樣品的植物包含根腫病抗性中涉及的基因。

vii.除草劑和根腫病抗性ho/ll芸苔植物

本發明的一些實施方案提供或在其它方面包括芸苔植物(例如歐洲油菜植物)，其在與同一物種的野生型芸苔植物(例如歐洲油菜品種quantum)比較時具有高油酸和/或低亞麻酸(ho/ll)。在這些和其它實施方案中，芸苔植物可以包含對咪唑啉酮除草劑的抗性的性狀。在這些和其它實施方案中，芸苔植物可以包含對根腫病的抗性的性狀。因此，本發明的一些實施方案提供或在其它方面包括芸苔植物，其包含高油酸、低亞麻酸、咪唑啉酮抗性、和根腫病抗性的所有性狀。

因此，對根腫病有抗性的芸苔植物可以包含與根腫病抗性表型連鎖的標誌物，而且還包含與ho性狀連鎖的標誌物。在這些和其它實施方案中，芸苔植物還可以包含與ll性狀連鎖的遺傳標誌物。例如，對根腫病有抗性的芸苔植物還可以包含一種或多種與突變fad2和/或fad3基因對應的核酸序列。可以通過本領域中的多種已知方法之任一種將這些基因導入芸苔或其它含油種子植物中。另外，可以通過已知的體內或體外方法改變野生型fad2和/或fad3基因以提供例示性的突變fad2和/或fad3基因，或其等同物。此類基因、標誌物和突變的例子可以參見但不限於那些披露的美國專利公開文本no.2006/0248611(其全部內容通過提及併入本文)。

在具體的實施方案中，芸苔植物的種子可以包含有利的油概貌。例如，種子可以包含至少63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％或77％油酸(c18:1)。在這些和其它例子中，芸苔植物的種子可以包含不超過6％,5％,4％,3％,2％或1.5％亞油酸(c18:3)。

在本發明的實施方案中，對根腫病有抗性的歐洲油菜植物也可以對咪唑啉酮有抗性或耐受性。

在一些實施方案中，根腫病抗性芸苔植物還可以包含細胞質雄性不育系統恢復系。細胞質雄性不育(cms)是一種分布廣泛且典型的非孟德爾性狀。cms植物不能自花傳粉。因此，在雄性能育系旁邊種植cms系時，在不育植物上形成的所有種子會是兩個親本的雜種。與大多數性狀不同，cms是母本傳播的(即，它僅經由種子親本傳遞至後代)。此特性源自如下的事實，即決定cms的一種或多種基因位於線粒體dna(mtdna)上。與大多數基因(其駐留於核dna中)不同，mtdna中的基因在大多數植物物種中僅經由雌性傳播。由於母本傳播的此特性，有可能容易繁殖雌性cms系，其通過用雄性能育「維持者」系傳粉進行，所述雄性能育「維持者」系在其核基因上與cms系相同，但是其由於缺乏引起cms的mtdna而是雄性能育的。然而，由於cms的母本傳播，使用雌性cms系生成的雜種植物也是雄性不育的；它們攜帶賦予雄性不育性的mtdna。這對於種子作物(例如玉米和芸苔)是成問題的，所述種子作物需要花粉生成以形成收穫的產物種子。

幸運的是，在許多作物物種中，已經鑑定出稱作能育性恢復系(rf)的特定顯性核基因，其可以抑制雄性不育表型，並且對f1雜種「恢復」能育性。因此，cms系統的組分包含：(1)cms系(其含有雄性不育(s)胞質(或mtdna)，並且在恢復系基因的隱性或維持者等位基因方面是純合的)；(2)維持者系(其含有能育或正常的mtdna(f)，但是在核遺傳基因座上與cms系是同基因的)，和(3)恢復系品系(其通常含有雄性不育mtdna，但是在顯性核rf基因方面是純合的)。圖6中顯示了雜種種子生成方案中的這些組分的用途。可用於本發明的雄性不育性系統和恢復系包括但不限於：polima系統；ogura系統；美國專利6,365,798中描述的系統；和美國專利公開文本no.2004/0237141中描述的系統(每篇的全部內容通過提及併入本文)。

本文中引用的所有出版物、專利和專利申請在此通過提及併入。除非本文中另有記錄，dna純化、限制酶消化、瓊脂糖凝膠分析、dna片段分離、連接和轉化的標準方法可以用於本發明的目的。此類方法記載於例如sambrook等(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratorypress；及ausubel等(1987)currentprotocolsinmolecularbiology,johnwileyandsons,newyork(兩篇通過提及併入本文)。

提供以下實施例以例示某些具體的特徵和/或實施方案。實施例不應解釋為將公開內容限制為例示的具體特徵或實施方案。應當預期，本領域技術人員可以辨別並實施本文中在不偏離本發明範圍的前提下提供的具體教導的變型或備選。

實施例

實施例1：材料和方法

植物材料

在本研究中使用芸苔品種dms100(突變體類型)和quantum(野生型)以克隆fad2(脂肪酸去飽和酶-2)和fad3(脂肪酸去飽和酶-3)等位基因。dms100是一種具有約77％的油酸含量和約3％的亞麻酸含量的ho/ll(高油酸和低亞麻酸)系。dms100是從源自globalxag019姐妹系雜交的單一f3植物選擇的f4批量衍生。quantum是一種商業品種，並且含有低油酸(～66％)和高亞麻酸(～7％)含量。雙重單倍體(dh)群體通過至芸苔系quantum和dms100之間的雜交的f1植物的小孢子培養物形成。dh群體由604個系組成。通過使用氣相層析實施對dh系及其親本的種子的完全脂肪酸分析。在604個dh系中，隨機選擇183個進行標誌物分析和定位。

基因組dna提取和量化

使用qiagendneasytm96植物測試試劑盒從2周齡溫室培養植物的葉提取親本系和183個dh系兩者的dna。dna提取規程的詳情記載於dneasytm96植物測試試劑盒手冊中。此試劑盒容許dna以高通量提取的96孔形式提取。

對於dna量化，將picogreentm染料以200倍稀釋到1xte緩衝液中。在微量滴定板中，將100μl稀釋的picogreentm染料溶液添加至每孔中，然後添加5μl每種dna樣品或dna標準品(5μg/ml，10μg/ml和20μg/ml)。然後，將板在板搖動器上短暫攪動，然後使用moleculardevices的spectramaxgeministmxs微板螢光計閱讀。

pcr擴增

pcr擴增反應含有20至30ng基因組dna、0.25μm10聚體引物、2.5mmmgcl2、0.2mm每種dntp、1xpcr緩衝液和0.6個單位的tagdna聚合酶。在geneamppcr系統9700中實施擴增，程序為於94℃持續45秒，於55℃至60℃持續30秒，於72℃持續1分鐘的35個循環和以72℃持續7分鐘結束。

通過瓊脂糖凝膠電泳解析感興趣的pcr擴增產物，並從凝膠切出感興趣的條帶。將切出的條帶在含有無菌水的微量離心管中放置，並且在沸水中加熱5分鐘。用相應的引物對通過pcr擴增溶解的dna。使用ta克隆試劑盒(invitrogencorp.,sandiego,ca)依照製造商的說明書將擴增的產物與pcr2.1-topo克隆載體連接。然後，將連接的產物轉化到感受態細胞中，並且在含有氨苄青黴素或卡那黴素、x-gal和iptg以實現白/藍選擇的lb瓊脂板上鋪板。將轉化板中的白色菌落挑出，並且通過用限制酶ecori消化證實克隆的pcr產物的身份，這揭示了預期大小的載體dna片段和插入片段。含有插入物的陽性克隆由sequetechcorporation(mountainview,ca)測序。

序列和數據分析

通過使用gcg軟體包(wisconsinuniversity)中的基於seqwebtm(第2版)網絡的序列分析軟體分析並比對序列。通過t檢驗分析測定標誌物和高油酸或低亞麻酸(ho/ll)性狀之間的連鎖聯繫。使用最小lod為3.0用joinmaptmv2.0計算機軟體產生遺傳連鎖圖。使用kosambi函數將圖距轉化成釐摩(centimorgans)。使用mapqtlv3.0軟體通過間距定位對與c18:1和c18:3關聯的推定qtl區定位。使用lod得分3.0鑑定潛在影響ho和ll性狀的區域。

侵入者(invader)測定法

對fad2和fad3基因突變特異性的侵入者測定試劑盒經由thirdwavetechnologies(madison,wi)開發。使用qiagenbio-robot3000(valencia,ca)相對於15ng/μl標準化侵入者測定法的dna樣品濃度。按照製造商的說明書在96孔板中實施侵入者測定法。簡言之，將dna樣品於95℃變性10分鐘。將7μl變性的dna(15ng/μl)和8μl反應混合物(3μl寡聚物混合物和5μl24mmmgcl2)添加至96孔侵入者測定板的每孔中。然後，將每個反應用15μl礦物油覆蓋，並且將板在st.johnassociates,inc.(beltsville,maryland)的biooveniii中於63℃溫育4小時。使用moleculardevices的spectramaxgeministmxs微板螢光計閱讀反應板以得到螢光信號。將突變體等位基因的高於背景的百分比信號除以每個樣品的野生型等位基因的百分比信號以計算比率。基於計算的比率測定樣品的基因型。

實施例2：fad2和fad3等位基因的克隆

通過使用與擬南芥或蕪菁fad2基因序列同源的引物擴增來自親本歐洲油菜系dms100(突變體)和quantum(野生型)的fad2基因的基因組dna片段。等(1998),見上文圖1。將通過引物fad2-2f和fad2-6r從每個親本擴增的fad2片段克隆並測序。此引物對從兩個親本中每個擴增出相同長度(986bp)的fad2片段。這兩個引物的序列是：

fad2-2f:caatccctcgctctttctcctacc(seqidno:1)

fad2-6r:cctttcttgtcaccttccctgtcc(seqidno:2)

在兩個親本系間，在fad2基因的第411位鑑定出單核苷酸取代突變。圖1。野生型quantumfad2基因含有第411位的「c」核苷酸。然而，ho/lldms100fad2基因含有相同位置處的snp，其中核苷酸變為「t」。此位置處「t」的存在引入終止密碼子，並且生成嚴重截短的fad2表達產物，其長度僅為185個胺基酸。圖2。

從genbank對歐洲油菜內質delta-15亞油酸去飽和酶的fad31和fad32基因座的dna序列進行搜索並檢索(登錄號af056569(fad31)和af066570(fad32))。使用primerexpress引物設計軟體(peappliedbiosystems,fostercity,ca)從fad31和fad32基因序列設計用於fad31基因座和fad32基因座中每個的三對引物。克隆從每個親本通過引物對bnfd31-cf(gaggcttggacgaccacttg)(seqidno:3)和bnfd31-cr(gactggaccaacgaggaatg)(seqidno:4)擴增的fad31片段和通過引物對bnfd32-cf(caagaatttgtcccacagtacac)(seqidno:16)和bnfd32-cr(caactgttgttaatcctccacg)(seqidno:17)擴增的fad32片段。將fad31的7個dms100克隆和6個quantum克隆和fad32的6個dms100克隆和6個quantum克隆測序。

序列分析和比對揭示了在fad31方面在dms100和quantum克隆之間沒有序列差異(數據未顯示)。然而，序列比對揭示了fad32基因中第三個內含子的5』剪接位點的第一個鹼基處的單核苷酸突變(「g」至「a」)。圖3。此內含子對應於蕪菁((2000)mappingandcloningoffad3geneinbrassicarapasubsp.oleifera.genbankdirectsubmission.genbank登錄號af308975,af308976,af308977和af308978)和擬南芥(nishiuchi等(1994)plantphysiol.105:767-8)中fad3基因的內含子6。蕪菁和擬南芥的fad3基因含有8個外顯子和7個內含子，而本文中檢查的歐洲油菜序列覆蓋外顯子4(部分)、5、6、和7(部分)和內含子4、5、和6。fad3基因中外顯子/內含子的此解讀得到如下事實的支持，即fad3基因序列在測序的芸苔物種和擬南芥間是高度保守的。

植物內含子含有高度保守的5』剪接位點(外顯子/內含子交接：ag/gtaag)和3』剪接位點(內含子/外顯子交接：tgcag/g)。已經顯示了5』剪接位點內含子交接序列中的前兩個核苷酸+1g和+2t在研究的超過1000種擬南芥內含子間分別是100％和99％保守。等(2000)trendsplantsci.5(4):160-7；及brown(1996)plantmol.biol.32(3):531-5。剪接的精確性取決於內含子信號識別的機制和5』和3』剪接位點的正確選擇。本文中鑑定的5』剪接位點(第530位)的+1g至+1a突變(參見圖3)可以消除剪接或者導致外顯子跳躍，即受影響的外顯子(外顯子6)，並且可以在單一剪接事件中除去兩個側翼內含子。等(2000),見上文；及simpson等(1998)plantj.15(1):125-31。此類外顯子跳躍可以導致缺少由fad3基因的外顯子6編碼的胺基酸的多肽的合成。此突變還可以阻斷正常5』剪接位點的剪接，並且活化不同位置處隱蔽剪接位點，這可以引起受影響外顯子以及下遊內含子的隱蔽剪接。mccullough等(1993)mol.cell.biol.13(3):1323-31。此類隱蔽剪接可以導致由fad3編碼的delta-15亞油酸去飽和酶的早期翻譯終止和較短多肽的合成，因為內含子在所有三種可能的閱讀框中含有終止密碼子，因此外顯子7和8仍然會是未翻譯的。fad3的不完整翻譯可以使酶失活，並且阻斷亞油酸(c18:2)去飽和成亞麻酸(c18:3)，這導致芸苔種子中c18:3積累的降低。

這些數據強烈提示了fad2和fad3基因中鑑定的單核苷酸突變是造成芸苔系dms100中油酸含量升高和亞麻酸含量降低的因素。如分別在圖1和3中顯示，為了使用pcr擴增檢測fad2和fad32的突變體ho/ll等位基因，設計突變體特異性引物fad2gm(cgcaccgtgatgttaacggttt)(seqidno:5)和fad3cgm(ataaataatgttgatctacttat)(seqidno:15)。使用與上文描述的兩種突變之任一或兩者連鎖的分子標誌物，可以使用標誌物輔助漸滲將dms100及其後代或衍生物的ho/ll性狀，和/或dms100及其後代或衍生物的突變fad2(seqidno:7)和fad3(seqidno:12)基因引入芸苔系中。圖1和3。

實施例3：fad2和fad3基因的突變體等位基因特異性snp標誌物

使用存在於fad2和fad3基因中的單核苷酸突變作為snp標誌物以標記fad2和fad3基因，用於選擇芸苔育種中的高c18:1和低c18:3。設計突變體特異性引物(fad2gm:cgcaccgtgatggttaacggttt(seqidno:5)；和fad3cgm:ataaataatgttgatctacttat(seqidno:15))以使用pcr擴增檢測fad2和fad32的突變體等位基因。引物設計為使得突變鹼基(snp)在一條引物的3』端，用於等位基因特異性pcr擴增。圖1和3。

對fad2特異性的引物擴增出多態性條帶，其存在於dms100和dna體積(bulks)中(對於高油酸(c18:1))，但是不存在於quantum和dna體積中(對於低油酸)。圖4。對源自quantum和dms100雜交的dh群體測試此基因特異性標誌物，其中發現了等位基因分布與高c18:1高度相關。圖4；表1。fad3等位基因特異性引物也擴增出存在於dms100中，而不存在於quantum中的多態性片段。用dh群體的分析指示此等位基因特異性標誌物與低c18:3是統計學關聯的。圖4；表1。因此，成功開發直接標記fad2和fad3基因突變的兩種基因特異性的基於pcr的標誌物。鑑於本公開內容，例如基於在足夠數目的鹼基對裡的實質性同源性的本文中公開的標誌物的變型或衍生物(包括各種類型的標誌物)對於本領域技術人員會容易是顯而易見的。

表1

經由使用源自quantumxdms100雜交的dh群體的遺傳和qtl定位，找到一個主要(n5)和一個次要(n1)qtl區(對於高c18:1)，和三個qtl區(n4和n14)(對於低c18:3)。圖5。此qtl定位結果與遺傳分析一致，所述遺傳分析顯示了高c18:1受到一個主基因控制，而低c18:3受到多個基因控制。基於fad2基因的標誌物精確位於c18:1的主要qtl基因座的定位位置，這支持如下的事實，即此qtl對應於受到dms100中的突變影響的功能性fad2基因。這也與先前的研究一致，所述先前的研究證明了fad2基因可以位於連鎖群n5上。參見schierholt等(2000)theor.appl.genet.101:897-901。基於fad3基因的標誌物的位置精確匹配連鎖群14(c基因組)上c18:3的主要qtl基因座之一的定位位置，這支持如下的結論，此qtl是fad3c(c基因組中的fad3，先前稱作fad32)基因，並且其受到dms100中的第二處突變影響。

實施例4：育種群體的生成

初始育種雜交牽涉hollx非holl芸苔。使用f1作為雙重單倍體供體，並且所有供體植物在三個fad突變體中每個上是半合子的。所有供體植物在三種需要的脂肪酸去飽和酶突變中每種上是半合子的。預測所有三種基因獨立分類。因此，鑑於457個收穫個體的群體，預期這些個體中的1/8(1/2x1/2x1/2)會含有所有三種fad標誌物。因此，在457個個體中，預期約57個個體含有促成ho/ll芸苔的所有三種fad標誌物。然而，如圖7中顯示的fame分析中觀察到的，在此群體中沒有看到此預期。

ho/llx非ho/ll雜交中的脂肪酸概貌的分布不是預期的事情。存在有此群體中比會預期的事情更少的具有低c18:3的個體，和多許多具有非常低c18:1組成的個體。202個個體生成大於70％的c18:1水平，但是僅101個個體生成3.0％下的c18:3水平。僅41個個體具有大於70％c18:1和小於3.0％c18:3的組合。這低於57個個體的預期數目。替代12％含有ho/ll種子油概貌的個體(如預期)，僅9％個體顯示此概貌。

還調查組合兩組親本材料的效果。將ho/ll親本與非ho/ll親本雜交以生成育種群體。此群體生成大量不滿足ho/ll或標準芸苔脂肪酸概貌的dh系，即使親本是ho/ll或者具有標準的芸苔脂肪酸概貌(c18-1；c18-3)。88個dh系生成通常存在於小於60％c18:1的非芸苔質量材料中的c18:1概貌。這是意料不到的結果，因為供體植物的遺傳組成在所有三種fad突變方面是半合子的。與ho/ll和近ho/ll類型相比，觀察到這些材料中c16:0和c18:2兩者的更大生成。與ho/ll系相比，這些非芸苔質量類型生成略微升高的c16:0水平，但是這兩類品系之間的最大差異是亞麻酸(c18:2)的水平。含有非常低水平的c18:1的品系具有非常高水平的c18:2及還有非常高水平的c18:3。存在有具有非常低水平的c18:3(小於2％)的具有小於60％c18:1的品系，代表我們在先前這些種類的雜交中尚未看到的令人感興趣的遺傳學組合。

鑑於所有三種fad突變方面半合子的親本系的遺傳預期，會預測大比例的ho/ll系會展現出對根腫病的抗性。然而，在此類植物的後代中觀察到的脂肪酸組成的複雜性指示會難以通過雜交半合子fad植物開發對根腫病具有抗性的ho/ll系。

在ho/ll和非ho/ll親本的組合期間觀察到的另一種複雜性產生後代群體中早期開花的ho/ll系。如圖8的開花圖中顯示的，與開花日期比較育種系的數目的頻率。非常少的育種系是早期開花，並且有分布變平的趨勢，更多品系展現出後期開花。使用此親本材料，產生非常早期開花的、ho/ll、且根腫病抗性的品系證明是難得出乎意料的。開花的較大差異在圖7中鑑定的抗性品系中也是明顯的。

種植表1中鑑定的抗性品系(das34到das74)以返回與holl親本進行育種雜交。表1中的抗性品系在從3月19日至4月2日的第一次開花日期的非常大的差異。4個抗性品系是非常晚開花的，並且不產生花，直到holl親本沒有花。值得注意的是，在此實驗中開花的4個最早的根腫病抗性品系僅具有三種fda標誌物中的兩種。四個非常晚期開花的品系中的兩個具有所有三種fad突變體，並且兩個非常晚期開花品系具有兩個fad突變體。這指示在單一芸苔品系中產生根腫病抗性、早期開花、和holl種質的複雜性和困難性。

實施例5：fame分析

對於實施例3中分析的40個不同品系，進行fame分析以測定品系的脂肪酸含量。下文表2和3中呈現了結果：

表2：fame分析(c12:0–c18:3)

表3：fame分析(c20:0–c24:1)

實施例6：除草劑耐受性的選擇

對約1000個bc1世代個體(通過將mendelxho/ll/rest/gly個體與咪唑啉酮和草甘膦抗性近交物回交得到)調查能育性恢復系基因。確定約156個bc1個體在能育性恢復系方面是純合的，469個半合子的，且370個個體是野生型。能育(純合的和半合子的)個體的比例低於鑑於能育性恢復系方面50％純合和50％半合子的預期定量的預期；實際結果是625能育:469不育，顯著偏離預期比率。

對能育(純合的和半合子的)植物進行其它測定法以測定草甘膦抗性的存在。使用327個草甘膦抗性陰性bc1植物進行咪唑啉酮抗性育種。咪唑啉酮抗性類型產生三種fad基因方面1:1純合:半合子的大致比率(對於fad2為173:150，對於fad3a為144:177，且對於fad3c為174:153)，並且在所得的植物中，83個在恢復系基因方面是純合的，且244是半合子的。對單獨的草甘膦抗性陰性品系比較fad基因及恢復系基因的存在，並且在溫室樣地中種植鑑定為在三種fad基因中的兩種方面純合及在恢復系基因方面半合子的植物，用於選擇「開花前早熟性」。

對每個植物測定溫室條件下的開花前天數，並且將具有兩種或三種fad基因的最早開花植物和恢復系個別用袋自交以生成純的bc1s1種子。在收穫後，測試小種子樣品以證實種子油的脂肪酸概貌。這些樣品中的油酸(c18:1)含量範圍為63.34％至77.34％。亞麻酸(c18:3)含量範圍為5.81％至1.32％，並且飽和脂肪酸組成範圍為9.64％至6.49％。測試20個最早開花的bc1s1咪唑啉酮抗性、高油酸、低亞麻酸、恢復系基因系的剩餘種子，並且均測定為攜帶根腫病抗性。

實施例7：與根腫病抗性連鎖的標誌物

使用根腫病抗性歐洲油菜栽培種mendel以對含有能育性恢復基因(restr)和草甘膦抗性(gly)的ho/ll歐洲油菜近交物產生一系列雜交。將所得的f1後代與咪唑啉酮和草甘膦抗性近交物回交，其中選擇ho/ll、能育性恢復、和除草劑耐受性。f1植物在生長習性方面是中間的，並且需要低溫春化誘導開花。使用分子標誌物表徵組合除草劑耐受性、種子油概貌和能育性恢復以鑑定f1個體，用作雜交親本以開發bc1世代。在生成bc1世代後，使用生物學測定法測定根腫病抗性，所述生物學測定法指示根腫病抗性轉移至ho/ll親本類型。表4提供了對來自40種不同品系的多個植物測試根腫病抗性的結果。將植物分級為種類，其範圍為0(抗性)至3(易感)。然後，將作為整體的品系分配從r(抗性)、m(混合抗性)、和s(易感)的字母等級。

表4

40個分開的芸苔品系(多個植物)中測試根腫病抗性的結果

進行mendel(根腫病抗性)ho/ll近交物與根腫病易感性歐洲油菜近交物的3系雜交。使用生物學測定法對源自此3系雜交的f1世代植物的40個dh系篩選根腫病抗性。表5。種植這些選擇的dh系，兩個親本系和三個芸苔品種(nex827,nex830和nex845)，並且從每個收集葉組織。將收集的葉組織冷凍乾燥，並且研磨，用於dna提取。

表5

用於鑑定根腫病分子標誌物的dh系。

使用qiagentm微型植物dna提取試劑盒依照試劑盒的說明書從冷凍乾燥的研磨的葉組織提取dna。使用nanodroptm8000量化提取的dna樣品，並且通過用超純水稀釋產生濃度5ng/μl。使用來自5個根腫病抗性dh系(「r-合併物」)(dh系140227,145776,145853,145882和146058)和5個易感性dh系(「s-合併物」)(dh系145506,145645,145666,145842,145850)的等量dna配製兩個分開混合的dna樣品。

使用這兩個混合的dna樣品及親本dna樣品鑑定與芸苔中的根腫病抗性連鎖的ssr標誌物(簡單序列重複標誌物)，其使用混合分離子分析方法(bulkedsegregantanalysisapproach)進行：用簡單序列重複(ssr)分子標誌物，我們採用混合分離分析(bsa)方法，其利用r-合併物、s-合併物、和來自其相應親本系的dna樣品。然後，用具有已知根腫病抗性的40個個別dh系測試鑑定為在兩個混合dna樣品和親本系之間多態性的ssr標誌物。

用總共713個經ssrm13標記的引物對和abi3130遺傳分析儀篩選兩個混合dna樣品和兩個親本系，以鑑定抗性和易感性合併物之間的多態性標誌物及親本dna。通過製備具有引物(經fam標記)；hotmastertmtaq聚合酶；和hotmastertm反應緩衝液的pcr反應進行篩選，所述引物具有以seqid20,21,和22(fam-標記的)列出的序列。用於95℃持續3分鐘的1個周期；4個周期的降落概況(其由94℃持續30秒，56℃持續50秒(-2℃/周期)，和72℃持續55秒組成)；94℃持續30秒，51℃持續50秒，和72℃持續55秒的24個周期；72℃持續10分鐘的1個周期；和於8℃最終溫育直至完成實施pcr反應。將完成的pcr反應稀釋(7μl反應稀釋入100μlh2o)，並且將4μl稀釋的pcr產物與ssr運行緩衝液(10.8μlhidi甲醯胺和0.2μlgenescan600liz標準品dna)混合，並轉移至板，用於abi3130xl遺傳分析儀。然後，將板短暫快速旋轉(最大值500rpm持續幾秒)，於95℃變性5分鐘，並且在冰上冷卻。將板再次快速旋轉以確保所有液體在每孔的底部，並且沒有氣泡。然後，將製備好的板安裝到板裝配中，並且加載到abi3130xl遺傳分析儀中。使用genemappertm軟體分析數據。

篩選的713個ssr引物對中的42個在抗性dna合併物(r-合併物)和易感性dna合併物(s-合併物)之間在dna擴增中是多態性的，並且觀察到的多態性與抗性親本(mendel)和易感性近交親本一致。使用這42種ssr標誌物篩選40個單獨的dh系、親本品種、nex827、nex830、和nex845以測定標誌物與根腫病抗性表型之間的關聯。

混合分離子分析鑑定出一個ssr引物對(bn1810)，其產生與根腫病抗性表型緊密有關的333bpdna片段的擴增。

表6.

bn1810ssr標誌物

bn1810-das-m13f：cacgacgttgtaaaacgacggccagtttctccgaccaaagctgttt(seqidno:20)

bn1810-有尾(tailed)r：gtttcttaaggagctggattcacatgg(seqidno:21)

m13-6fam(經螢光標記的引物)：6fam-cacgacgttgtaaaacga(seqidno:22)

除了兩個誤分類外，此標誌物精確預測測試芸苔系的根腫病反應。來自表6的數據證明了19個抗性個體、13個易感性個體、和6個分類為中等抗性的個體。還用源自mendel作為抗性親本的另一dh群體測試此標誌物，並且標誌物預測抗性與易感性個體的預期分離比率。此另一dh群體中評估的個體並不來自純合親本，因此預期一些分離。

表6

單個的dh系、親本系和das芸苔品種(用於測定連鎖關係)的根腫病反應和bn1810ssr引物對的標誌物等位基因。正確分類表型的標誌物等位基因以灰色突出顯示，而錯分類的標誌物等位基因以粗體文本(黃色)突出顯示。

*鑑定為與根腫病抗性連鎖並且從根腫病抗性親本系mendel貢獻的等位基因。

實施例8：根腫病抗性基因的鑑定

對歐洲油菜基因組dna中通過bn1810ssr引物對擴增的區域測序。使用擴增區的序列探查基因組資料庫，用於鑑定包含bn1810ssr標誌物的基因。鑑定包含bn1810ssr標誌物的基因，並且此基因測定為是根腫病抗性的來源。

鑑定的根腫病抗性基因位於芸苔基因組中，並且鑑定出與減數分裂期間聯繫的基因足夠接近的標誌物。在根腫病抗性和易感性品種之間雜交的f1群體中篩選鑑定的標誌物以進一步鑑定標誌物亞組，所述標誌物是多態性的，因此可用作以bn1810ssr標誌物表示的根腫病抗性來源的標誌物。此亞組中的一些標誌物可以比bn1810ssr標誌物更緊密與根腫病抗性連鎖。

從提供的品種中分離基因組dna，並且使用bn1810ssr引物對探查分離的dna。若擴增出分離的dna中在與bn1810ssr引物對對應的序列之間的序列表明標誌物的存在，則數據是潛在的根腫病抗性來源與mendel中存在的來源是等位的證據。

將提供的品種各自與根腫病易感性品系雜交以生成f1群體。從此f1群體生成雙重單倍體(dh)系，並且使用生物學測定法對該品系篩選根腫病抗性。將選擇的dh系、兩個親本系、和mendel種植，並且從每個收集植物組織。從收集的植物組織提取dna。將提取的dna樣品量化，並且配製來自根腫病抗性dh系和根腫病易感性dh系的混合dna樣品。

在混合分離子分析方法中使用混合的dna樣品以及親本dna樣品以測定bn1810ssr標誌物在根腫病抗性和易感性dna合併物、親本、和dh系之間是否是多態性的。若標誌物是多態性的，則數據與如下的假設一致，即潛在的根腫病抗性的來源與mendel中存在的來源是等位的。

雖然本文中已經描述了某些例示性的實施方案，本領域普通技術人員會認可並領會，可以在不偏離所附權利要求書範圍的前提下對例示性實施方案做出許多添加、刪除和修飾。另外，一個實施方案的特徵可以與另一個實施方案的特徵組合。

序列表

陶氏益農公司(dowagrosciencesllc)

ripley,vanl

gingera,gregoryr

zhao,jianwei

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對根腫病具有抗性的omega-9芸苔的產生

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未知

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patentinversion3.4

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歐洲油菜(brassicanapus)

caatccctcgctctttctcctacc24

dna

歐洲油菜(brassicanapus)

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