一種白葉枯病抗性相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2024-04-04 05:35:05

專利名稱：一種白葉枯病抗性相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物抗病性相關蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及一種白葉枯病抗性相關蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
生長在自然界中的植物會經常受到各種細菌、真菌和病毒等侵害，在長期演化過程中形成了各種應答機制。對植物抗病性和抗病機制的研究一直是植物病理學和抗病育種界十分關注的課題。在早期的研究中建立了著名的「基因對基因」學說，它能闡述多種植物-病原菌之間的作用關係，已成為克隆病原菌無毒基因和植物抗病基因的理論基礎。自1992年從玉米中克隆到第一個抗病基因Hm1以來，現在已有40多個植物抗病(R)基因被克隆了，它們編碼的蛋白質產物多數具有某一特定的結構域，如NBS(Nucleotide binding site，核苷酸結合位點)，LRR(Leucine-rich repeat，富亮氨酸重複)，TM(Transmembrane domain，跨膜結構域)，PK(Protein kinase，蛋白激酶)，LZ(Leucine zipper，亮氨酸拉鏈)，CC(Coiled Coil，捲曲螺旋)和TIR(Toll-Interleukin-1 Receptor，Toll白介素-1區域)等。根據抗病基因是否含有這些結構域，可將它們分為LZ(CC)-NBS-LRR，TIR-NBS-LRR，TM-LRR，TM-LRR，LRR-TM-STK 5類。但是還有其它特殊類型的R基因不含有這些結構域，如大麥的隱性抗白粉病(Erysiphe graminis f.sp.Hordei)mlo基因編碼一個至少含有6個跨膜螺旋(Membrane spanning helices)的膜蛋白；胡椒的隱性抗馬鈴薯Y病毒(PVY)基因pvr2則編碼真核轉錄起始因子4E(elF4E)。這些隱性抗病基因都無法用「基因對基因」學說來解釋它們的抗病性，它們的具體作用機理也不清楚，只有再克隆更多的隱性抗病基因，才有助於全面解析植物的抗病機制。
白葉枯病是世界範圍內水稻最嚴重的病害之一，也是我國的主要病害。迄今為止，國內外至少已經鑑定了26個白葉枯病抗性基因，其中有顯性基因，也有隱性基因。近年來，水稻在顯性抗白葉枯病基因的克隆與研究方面有了很大突破，先後圖位克隆了三個顯性抗白葉枯病基因Xa21、Xa1和Xa26。Xa4和xa5一直是我國水稻生產上利用的主要抗源，其中Xa4是顯性基因對我國大多數白葉枯病菌型都有全生育期抗性，它的克隆即將完成(Wang WM，Zhai WX，Luo MZ，Jiang GH，Chen XW，LiXB，Wing RA，Zhu LH.Chromosome landing at the bacterial blight resistancegene Xa4 locus using a deep coverage rice BAC library.Molecular GeneralGenetics.2001.265118-125；Sun X，Yang Z，Wang S，Zhang Q.Identificationof a 47-kb DNA fragment containing Xa4，a locus for bacterial blightresistance in rice.Theor Appl Genet.2003.106(4)683-687)；而xa5是隱性廣譜抗白葉枯病基因，通過回交育種構建的xa5基因與其它顯性抗白葉枯病基因Xa21和Xa4的聚合系，對白葉枯病抗性水平(比單基因系)顯著增強，抗譜拓寬(HuangN.，Augetes E.R.，Domingo J.，Magpantay G.，Singh S.，Zhang G.，KumardivelN.，Bennett J.and Khush G.S.(1997)Pyramiding of bacterial blight resistancegene in ricemarker-assisted selection using RFLP and PCR.Theor.Appl.Genet.95313-320)。最新研究表明xa5基因是通過調節水稻防衛途經來增加對白葉枯病的抗性，對一些白葉枯病病原小種有部分顯性效應或加性效應(Li ZK，Sanchez A，Angeles E，et al.Are the Dominant and Recessive Plant Disease ResistanceGenes Similar？A Case Stude of Rice R Genes and Xanthomonas oryzae pv.OryzaeRaces.Genetics.2001，159757-765。)。克隆出xa5基因並通過基因工程將其與其它不同類型的抗病基因聚合有望培育出持久高抗白葉枯病的水稻品種。因此，xa5基因的圖位克隆一直是國內外研究的熱點，隱性抗白葉枯病基因xa5對菲律賓的幾個生理小種呈廣譜抗性，最初由Petpisit et al(Petpisit V.，Khush G.S.，KauffmanH.E.(1977)Inheritance of resistance to bacterial blight in rice.Crop Sci.17551-554)鑑定，並被初步定位在第5染色體上(Yang D.，Sanchez A.，Khush G.S.，Zhu Y.，Huang N.(1998)Construction of a BAC contig containing the xa5 locusin rice.Theor Appl Genet.971120-1124)。
發明創造內容本發明的目的是提供一種白葉枯病抗性相關蛋白及其編碼基因。
本發明所提供的白葉枯病抗性相關蛋白，名稱為xa5，它是具有序列表中SEQ ID№3胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID №3的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且與白葉枯病抗性相關的由SEQ ID №3衍生的蛋白質。
序列表中的序列3是由106個胺基酸殘基構成的一個具有保守的氨基端和羧基端結構域的基本轉錄因子IIA(TFIIA)小亞基。序列3中，自氨基端第2-50位胺基酸殘基序列為氨基端保守結構域，具有4個螺旋束；第52至101位胺基酸殘基序列是羧基端保守結構域，有12個β摺疊。
上述白葉枯病抗性相關蛋白的編碼基因(名稱為xa5)也屬於本發明的保護範圍。
上述白葉枯病抗性相關蛋白的編碼基因包括其cDNA基因和基因組基因。其基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
序列表中的序列1由13228個鹼基組成，其讀碼框為自5』端第3080到第8589位鹼基。自5′端的第2739-2834位鹼基為該基因組基因的第一個外顯子，自5′端的第2968-3208位鹼基為該基因組基因的第二個外顯子，自5′端的第3303-3354位鹼基為該基因組基因的第三個外顯子，自5′端的第8450-8965位鹼基為該基因組基因的第四個外顯子，自5′端的第3080-3082位鹼基為該基因的基因組DNA起始密碼子ATG，自5′端的第8587-8589位鹼基為該基因的基因組DNA終止密碼子TAA；自5′端的第2835-2967位鹼基為該基因組基因的第一個內含子，自5′端的第3209-3302位鹼基為該基因組基因的第二個內含子，自5′端的第3355-8449位鹼基為該基因組基因的第三個內含子。
其cDNA序列具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
序列表中的SEQ ID №2由905個鹼基組成，該cDNA序列的編碼序列為序列表中SEQ ID №2的自5′端第209-529位鹼基。
上述高嚴謹條件為在含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃下雜交並洗膜。
實驗證明，白葉枯病抗性相關蛋白基因xa5為組成型表達。
含有本發明基因的表達載體、細胞系及宿主菌也屬於本發明的保護範圍。
擴增xa5中任一片段的引物對也在本發明的保護範圍之內。
本發明的第二個目的是提供一種利用上述白葉枯病抗性相關蛋白編碼基因培育抗白葉枯病植物的方法。
本發明所提供的培育抗白葉枯病植物的方法，是將上述白葉枯病抗性相關蛋白編碼基因導入目的植物。
可利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的白葉枯病抗性相關蛋白編碼基因導入植物細胞，可獲得抗病的或抗病增強的轉基因細胞系及轉基因植株。本發明的白葉枯病抗性相關蛋白編碼基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種一般性啟動子、增強啟動子或誘導型啟動子。為了便於對轉基因植物或轉基因植物細胞進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入可選擇性標記(GUS基因、GFP和螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記基因(慶大黴素，卡那黴素等)。為了轉基因植物釋放的安全性，在構建植物表達載體時也可不攜帶任何標記基因，在苗期接種白葉枯病菌種進行篩選。含有本發明的白葉枯病抗性相關蛋白編碼基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導或基因槍等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。該方法特別適合於培育抗白葉枯病的水稻。
在育種中，也可通過輔助選擇育種方法獲得抗白葉枯病水稻，如利用抗白葉枯病水稻品種IRBB5和感病水稻品種雜交得到F1代植株，F1代植株自交得到F2代植株，對得到的F2代植株接種白葉枯病致病菌進行抗性鑑定和利用分子標記K5或K8或SSR3進行PCR檢測，確定含有來自IRBB5中較大的漸滲片段的抗性植株，所述含有來自IRBB5材料中較大的漸滲片段的抗性植株自交產生的F3代抗性植株，即為xa5基因純合型的抗白葉枯病水稻。
本發明的另一個目的是提供一種利用該白葉枯病抗性相關蛋白編碼基因的片段檢測植物白葉枯病抗性的方法。
本發明所提供的檢測植物白葉枯病抗性的方法，是用由序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列組成的一對引物對待測植物的基因組DNA進行PCR擴增，然後對得到的PCR擴增產物進行下述1)和2)中的至少一種檢測1)對所述PCR擴增產物進行單核苷酸多態性檢測，確定自序列表中SEQ ID NO6的5′端第21-22位鹼基是否為AG；2)用XhoI酶切所述PCR擴增產物，確定酶切片段中是含有一條145bp帶。
序列表中的SEQ ID NO6由165個鹼基組成。
如果PCR擴增產物的單核苷酸多態性檢測結果是自序列表中SEQ ID NO6的5′端第21-22位鹼基(自序列表中序列1的5′端第3195-3196位鹼基；自序列表中序列2的5′端第324-325位鹼基)為AG，則待測植物抗白葉枯病。
如果用XhoI酶切所述PCR擴增產物，得到的酶切片段中含有一條145bp條帶，則待測植物抗白葉枯病。
該檢測植物白葉枯病抗性的方法尤其適合於水稻。
本發明對培育抗病植物品種，擴大作物種植範圍，提高農作物產量具有重要意義。
下面結合附圖及實施例對本發明做進一步說明。


圖1為xa5基因被初步定位於RFLP標記S1546和RG556之間圖2a為23個陽性克隆的Hind III酶切模式圖2b為23個Hind III酶切陽性克隆與BAC克隆40I13 DNA作探針進行的分子雜交圖2c為跨疊的9個陽性克隆的Sma I酶切模式圖3為xa5基因位點的精細遺傳圖和物理4為xa5基因的分離圖5為與其它生物的TFIIA小亞基胺基酸序列比較圖6為本發明的白葉枯病抗性相關蛋白的胺基酸序列保守區域分析圖7a-圖7b為Xa5和xa5基因在接種P1的感病和抗病材料中的表達情況圖8為NIP/IRBB5F3R的SSR3標記檢測結果圖9為互補實驗表達載體pCAMBIA1301Xa5的物理圖譜圖10a為轉基因植株接種病原菌後的表現圖10b為T0代轉基因植株具體實施方式
下述實施例中提到的實驗方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、本發明的白葉枯病抗性相關蛋白及其編碼基因的獲得1、隱性抗白葉枯病基因xa5的遺傳分析及初步定位利用含有xa5基因的抗病親本IRBB5同近等基因系(感病親本)IR24進行雜交，所得F1代接種白葉枯病致病菌小種P1(Kauffman H.E.，Reddy A.P.K.，Hsieh S.P.Y.and Merca S.D.(1973)An improved technique for evaluating resistance of ricevarieties to Xanthomonas oryzae.Plant Dis.Rep.57537-547)兩周後，測量病斑長度，均鑑定為感病植株。分單株種植F2群體，在植株孕穗期用剪葉法接種同樣小種，再根據細菌生長曲線確定感抗植株，病斑長度＜5cm確定為抗性植株，病斑長度≥5cm為感病植株。在640株F2群體中，共有165株感病，475株抗病，感抗比例近似3∶1，表明IRBB5抗病性狀確實為隱性的單基因控制。根據先前的研究結果，xa5基因位於RFLP標記RG207、RZ390、RG556和C597附近(Blair M.W.，McCouchS.R.(1997)Microsatellite and sequence-tagged site markers diagnostic forthe rice bacterial blight resistance gene xa5.Theor Appl Genet.95174-184；Yang D.，Sanchez A.，Khush G.S.，Zhu Y.，Huang N.(1998)Construction of aBAC contig containing the xa5 locus in rice.Theor Appl Genet.971120-1124)。由於發現RG207、RZ390標記在IR24和IRBB5親本間無多態性，發明人根據Harushima等人建立的水稻遺傳圖譜(Harushima Y，Yano M，Shomura A，Sato M，Shimano T，Kuboki Y，Yamamoto T，Lin SY，Antonio BA，Parco A，Kajiya H，Huang N，YamamotoK，Nagamura Y，Kurata N，Khush GS and Sasaki J1998..A high-density ricegenetic linkage map with 2275 markers using a single F2 poulation.Genetics.148479-494)，用位於C597到S12936區間的6個日本RFLP標記進行親本間多態性分析，其中C597、C919、S1546、S14158、S12936在親本間多態性非常明顯，隨後用RG556、S1546、C597、C919、S14158和S12936這6個有多態的標記對F2群體進行連鎖分析，用MAPMAKER軟體確定它們同xa5之間的位置關係。將xa5基因定位於S1546和RG556之間(圖1)，距S1546與RG556的遺傳距離分別為0.8cM和0.5cM。
2、xa5基因位點BAC跨疊群的構建用C597、S1546、RZ390、C919、S12936、S14158和RG556這7個探針對含xa5基因水稻品系IRBB56的文庫(Wang WM，Zhai WX，Luo MZ，Jiang GH，Chen XW，LiXB，Wing RA，Zhu LH.Chromosome landing at the bacterial blight resistancegene Xa4 locus using a deep coverage rice BAC library.Molecular GeneralGenetics.2001.265118-125)進行篩選，共獲得88個陽性克隆，在這88個陽性克隆中，有23個為RG207、C597和S14158共同檢出，其中BAC克隆28N23、100N7、109H1和124H1同時被S12936檢出，28N23、100N7、109H1、40I23、64G4、30N9、111B20、97B18和124H1同時由RG556篩到。由於RG207、C597和S14158共同篩到的這23個陽性克隆也包含了其它探針篩到的克隆，故重點對這23個克隆加以分析。將這些BAC克隆DNA用Hind III酶切，根據酶切電泳帶型(圖2a，Marker為λDNA/HindIII分子量標準)和與BAC克隆40I13 DNA作探針的分子雜交指紋圖譜(圖2b)，可以把這些BAC克隆分成兩組跨疊克隆。第1組28N23、100N7、109H1、124H1、40I23、64G4、111B20、30N9和97B18；第2組112G9、133O22、34G21、55J16、68F20、78H9、85N2、107P23、114I23、118M13、125I13、139M6、70P2和133J8。用C597和RG207作探針雜交，兩組克隆分別給出特異的雜交帶型；用S14158和RZ390作探針雜交，兩組克隆也分別給出特異的雜交帶型，但64G4克隆無雜交帶；用RG556作探針雜交，只有第1組克隆給出一條雜交帶，而第2組克隆不產生雜交帶；用S12936作探針雜交，只有第1組的28N23、100N7、109H1和124H1四個克隆產生2條雜交帶。根據以上結果推斷第1組跨疊克隆群來自第5染色體上xa5位點區域。將這一組9個克隆進行Sma I酶切，根據Sma I酶切電泳圖譜(圖2c，Marker為λDNA/HindIII分子量標準)確定了這組克隆的相互跨疊關係，得到一個覆蓋第5染色體上從C597到S12936包含xa5基因的長約213Kb的跨疊克隆群(圖3)。圖3中，圖片(a)為覆蓋xa5基因位點區域的精細遺傳圖譜，xa5基因定位於K5和T4之間且與T2共分離，橫線下面的數字表示該標記在4892個單株中檢測到的交換株數，Marker指圖譜上的RFLP，SSR和CAPS標記；圖片(b)為篩查水稻品系IRBB56BAC文庫構建的xa5基因位點的跨疊克隆群和SmaI的酶切圖譜(小於3kb的片段忽略不計)，將xa5限定在24kb區域內，▲代表xa5的候選基因。
3、xa5基因的精細定位隨著國際水稻基因組(http//www.genome.arizona.edu/fpc/rice/)和中國超級雜交稻基因組計劃(http//btn.genomics.org.cn/rice/)的順利進行，越來越多的序列被錨定在水稻染色體上。根據第5染色體短臂上的序列以及xa5位點跨疊BAC克隆的部分測序設計出一系列的SSLP和CAPS標記(表1)，這些以PCR為基礎的標記有效地加速了xa5基因的精細定位。利用這些標記對擴大的含4892單株的F2定位克隆群體(Zhong Y.M.，Jiang G.H.，Chen X.W.，Xia Z.H.，Li X.b.，Zhu L.H.and Zhai W.X.(2003)Identification and gene prediction of a 24kb regioncontaining xa5，a recessive bacterial blight resistance gene in rice(Oryzasativa L.).Chinese Science Bulletin，48(24)2725-2729)進行分析，獲得含xa5基因位點區域的高密度遺傳圖。xa5基因被定位於CAPS標記K8和T25之間且與T2共分離，其中K8標記檢測到1個交換單株，T25標記檢測到3個交換單株，它們之間的遺傳距離約為0.3cM(圖4(a))。圖4(b)為來自30N9或44B4 BAC克隆的13.2kb HindIII片段，它含有完整的xa5或Xa5基因；(c)xa5基因的結構及其在抗病和感病材料裡的鹼基替換的位點。
為了確定xa5的物理位點，用所設計的CAPS和SSLP標記引物對組成跨疊克隆群的9個BAC克隆(28N23、100N7、109H1、124H1、40I23、64G4、111B20、30N9和97B18)進行擴增，並用Sma I酶切的BAC克隆Sma I片段進行驗證，從而確定出xa5位點區域的各標記物理位置與Sma I內切酶圖譜(圖3b)。分析結果表明所有跨疊的9個BAC克隆都包含K5和T4標記，但30N9最小。根據K8-T25區間的部分序列測定，並與國際水稻基因組計劃提供的序列(http//www.genome.arizona.edu/fpc/rice/)比較，發現K8和T25均位於國際水稻基因組AC129716克隆上，二者之間的序列長度約為10.9kb。
為了驗證定位結果，利用日本晴和IRBB5的雜交組合，又構建了包含近2萬單株的F2群體。其定位結果先前的定位結果一致。
表1 本發明過程中所創製的標記和引物

用Genescan軟體(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)對10.9kb的序列進行基因預測，發現1個明顯的開放閱讀框(ORF)，編碼轉錄因子TFIIA小亞基；並將此10.9kb序列對日本已測序的水稻28,000多個cDNA克隆進行同源搜索(http//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA)，得到1個編碼TFAII小亞基的cDNA克隆AK065182，它包括4個外顯子(大小分別為96bp，241bp，52bp和516bp)和3個內含子(大小分別為133bp，94bp和5095bp(圖4(c))。
根據預測的候選基因設計引物對抗病材料IRBB5，IRBB56，IRBB4以及感病材料IR24，IR64的cDNA和基因組DNA進行擴增和測序，發現抗病材料的候選基因TFIIA小亞基的編碼區，與Xa5相比，在氨基端內(自序列表中序列1的5′端第3195-3196位鹼基；自序列表中序列2的5′端第324-325位鹼基)有兩個鹼基的替換(TC變成AG)，造成一個胺基酸的改變(序列表中序列3的自氨基端第39位纈氨酸殘基變成穀氨酸殘基)(圖4(c))。將該位置為穀氨酸的蛋白質命名為xa5，它具有序列表中序列3的胺基酸殘基序列，具有序列表中序列1的基因組序列，具有序列表中序列2的cDNA序列。
為了進一步確定這兩個鹼基的替換在抗病材料和感病材料裡的一致性，根據IRBB5的序列設計了一對CAPS引物D5對IRBB5、NIP/IRBB5F3R和20多種感病品種(Nipponbare、IR24、MH63、K2908、ShuHui(蜀恢)527、Sdg、WP、Chuanghui(創恢)11、ZYQ(窄葉青)、MH(明恢)86、Lijiang(麗江)、PA64S、NJ(南京)6、Zhonghua(中花)11、NJ(南京)11、D62B、Zhi(制)7、9311、TP(臺北)309、JingXi(京系)17、MianHui(綿恢)725(以上感病材料購於中國農業科學院品質所和中國水稻所)進行擴增和XhoI(識別位點為CTCGAG)酶切，圖4c中xa5基因的部分序列是CAAGTTCTTGAG，但所設計的D5正向引物3『端序列是CAAGTTCTCG，因此抗性材料的DNA擴增出的PCR產物含有XhoI的識別位點CTCGAG)酶切，結果顯示只有IRBB5和NiP/IRBB5F3R的PCR產物被切開產生一條145bp的帶，其它感病材料的PCR產物不能被切開，表現為一條165bp的帶，表明這兩個鹼基在抗病和感病材料裡的替換與它們的抗病和感病是相關的(圖4(d))。說明xa5是白葉枯病抗性相關蛋白。
其中，抗白葉枯病水稻NIP/IRBB5F3R(即用於Xa5基因功能互補驗證的轉化體系)的獲得方法如下利用感病材料Nipponbare(粳稻)和抗病材料IRBB5(秈稻)雜交得到F1代植株，F1代植株自交得到F2代植株，對得到的F2代植株接白葉枯病致病菌小種P1進行抗性鑑定和利用13.2kb DNA片段兩側分子標記(K5，K8和SSR3)進行PCR檢測，確定含有來自IRBB5材料中較大的漸滲片段(因為分子標記K5，K8和SSR3在IR24(Nipponbare)和IRBB5兩親本之間是有多態的，即這些標記的PCR產物酶切後或直接經過瓊脂糖凝膠電泳能顯示出兩個親本之間的帶型不一樣，那些F3植株的DNA用K5，K8，SSR3標記進行PCR檢測後能顯示出IRBB5的帶型，這個較大的漸滲片段指這些植株具有來自IRBB5，且含有從K5到SSR3標記這一段較大的DNA片段)的抗性植株，這些含有來自IRBB5材料中較大的漸滲片段的抗性植株自交產生的F3代抗性植株，對白葉枯病菌P1(PXO61)和P2(PXO86)均具有抗性，該F3代抗性植株即為粳稻背景下含純合的xa5基因材料NIP/IRBB5F3R(圖8顯示了SSR3標記檢測的結果)。
對序列表中序列3的胺基酸殘基序列進行序列分析，發現它是基本轉錄因子IIA(TFIIA)的小亞基，由TFIIA_gamma_N，TFIIA_gamma_C 2個保守區域組成，全長106個胺基酸中，第2至第50個胺基酸為TFIIA_gamma_N保守區，有4個螺旋束；第52至101為TFIIA_gamma_C保守區，有12個β摺疊。突變位點位於TFIIA_gamma_N保守區(圖6)。其與其它生物的TFIIA小亞基序列，如074948(Fission Yeast)，Q39236(Arabidopsis)，008950(Rat)，P52656和Q9W5B9((Fruit fly)，XP_510452(Human)，NP_012865(Baker’s yeast)相比，具有高度的保守性(圖5)(以上字母數字均為各種生物的TFIIA小亞基的蛋白質代號，可從www.ncbi.nlm.nih.gov搜尋到它們的蛋白質序列。圖5中的「○」顯示與抗性有關的穀氨酸。)實施例2、功能互補實驗在構建xa5基因位點跨疊克隆群時，還用K8，T2，T23，T25，T4和SSR3等標記篩查了含xa5顯性等位基因Xa5的水稻品系IR64 BAC文庫，獲得一個陽性BAC克隆44B4，並顯示在44B4上有相對應的13.2kb等位片段，用HindIII酶切44B4 BAC克隆後，得到一個13.2kb片段，核苷酸序列測定結果表明它含有完整的xa5顯性等位基因Xa5，從IR64基因組DNA中分離了一個含Xa5基因的長13.2kb HindIII片段，將它克隆入pCAMBIA1300的兩個HindIII位點之間，得到重組表達載體pCAMBIA1300-Xa5(圖9)。並用它來轉化含xa5基因純合隱性位點的水稻抗性品種NiP/IRBB5F3R，獲得了42株呈潮黴素抗性的T0代轉基因植株，經過苗期接種P1鑑定和用與xa5基因共分離的標記T2或S5(S5是xa5基因內部標記)進行PCR檢測(如圖10a-圖10b)，確定有37株表現為感病並含有轉入目標片段，而未轉入目標片段的植株仍表現為抗病，初步證明了本發明的白葉枯病抗性相關蛋白編碼基因為隱性基因。隨後，在海南播種了它們的自交後代，這些T1代轉基因植株表現為3:1感抗分離。圖10a中，1，IRBB5；2，IRBB5和日本晴雜交F3代中的抗病植株NiP/IRBB5F3R；3，Nipponbare；4，T0代轉基因植株；圖10b是xa5基因內部標記S5/NcoI對轉基因植株的檢測結果，將轉基因植株的PCR產物經過NcoI酶切，表明具有IRBB5和IR24兩種親本帶型的植株都含有完整的13.2kb轉基因片段。
實施例3、xa5基因的表達分析用白葉枯病生理小種P1對抗病材料IRBB5(含xa5基因)和感病材料日本晴(Nipponbare)(含Xa5基因)在苗期進行剪葉法接種處理，並以水處理作為對照，然後按處理後0，12，24，48，96小時取樣提取RNA，並對各樣品RNA進行RT-PCR分析。引物為基因xa5或Xa5內的一對特異性擴增引物J5(此引物在cDNA中能擴出614bp的片段，在基因組DNA中能擴增出1024bp，它的正向引物位於第二個外顯子，反向引物位於第四個外顯子，包含2個內含子)，用Actin引物作為對照。結果如圖7a-圖7b(M為DL2000；數字顯示接種時間；圖7a接種P1；圖7b，注射水作為對照)所示，表明xa5或Xa5基因不受P1的誘導。表明該xa5基因如同所克隆的其他多數植物抗性基因(如Xa21等)一樣，為組成型表達。(J5是根據xa5或Xa5基因序列設計的標記，用於檢測它們的表達情況(xa5或Xa5基因表達序列中只有兩個鹼基的不同)。
實施例4、培育抗白葉枯病的水稻以IRBB5的cDNA為模板，以xa5F 5』-GTTCTAGAATCGCCCATGGCCACC-3』和xa5R5』-GTCCCGGGGAGACTAACAAATACC-3』為引物(序列中含有將其克隆入含35S啟動子的pZh01(Xiao H，Wang Y，Liu D，Wang W，Li X，Zhao X，Xu J，Zhai W，Zhu L.(2003)Functional analysis of the rice AP3 homologue OsMADS16 by RNA interference.Plant Mol Biol.52(5)957-966.)的限制性內切酶識別位點，在正向引物中有XbaI位點TCTAGA；在反向引物中有SmaI位點)，PCR擴增xa5基因的cDNA。其中，反應體系1ng基因組DNA，正反向引物各0.25μM，1.5mM MgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物，以及0.5個單位的pfu聚合酶(上海生工生物工程技術服務有限公司)。反應條件先94℃5分鐘；再94℃30秒，55℃1分鐘，72℃3分，共30個循環；最後72℃5分鐘。將擴增得到的389bpDNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司科技有限公司)按供應商提供的方案回收該片段，利用限制性內切酶將其連接入含35S啟動子的pZh01相應的XbaI和SmaI位點，將得到的連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經克隆篩選和酶切鑑定，得到含有xa5基因cDNA的重組表達質粒pZh01-xa5。將pZh01-xa5通過農桿菌LBA4404的介導轉入感病材料Nipponbare的愈傷組織，將該愈傷組織用選擇培養基(N6培養基的無機鹽，B5培養基的微量元素和維生素，水解酪蛋白1g/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝膠2.0g/L，羧苄青黴素500mg/L，潮黴素50mg/L pH 5.8)培養21天後繼代第一次，以後每14天繼代一次，一個月左右，在褐色或黑色的愈傷組織上長出白色的抗性愈傷組織；該抗性愈傷組織經過常規培養分化出芽與根，得到幼苗。對得到的幼苗利用dCAPS標記D5/XhoI進行PCR鑑定，得到37株轉xa5基因植株。將轉xa5基因植株分別接種白葉枯病菌P1和P2，結果顯示轉基因植株葉片病斑長度遠小於對照(未轉入xa5基因的Nipponbare)，說明轉xa5基因高表達植株對白葉枯病菌P1和P2均具有抗性。
實施例5、培育抗白葉枯病能力增強的水稻按照實施例2將來自BAC克隆30N9的13.2kb DNA片段插入pCAMBIA1300，構建成pCAMBIA1300-xa5質粒；然後將其導入抗病材料IRBB4，IRBB3，IRBB13和IRBB21，得到轉xa5基因植株。將轉xa5基因植株分別接種白葉枯病菌P1，P2，T3和P6，結果表明轉基因植葉片病斑長度明顯小於對照，說明轉xa5基因植株對白葉枯病菌P1、P2、T3和P6均具有抗性，且抗病力更強的，抗譜更寬。
序列表1606210121113228212DNA213水稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)4001agcttcctat ctcgactata acgctttgga tttgttaaaa aaaacttgaa tcgtgggata 60cgctattttt aaatgagaac tggaacatct gagttgaatg cttgacaaat tgagttgtaa 120gttttcttga gttataagat gacatctaaa ggtttagttt ttttttcttt taatttgaat 180ttcctcgcta aaaataaggt tgaatttaat ctcaaatttt agctgaacat tgcaccgcta 240cccattcatt gtatcaaatt agactgctac atacagctac tgtagtgtga caatgcccat 300ctgttttctg aagaagaaac aaaagaatgc ttagctgtct gtcgtttctt aatcaccctc 360ttcgtttatc cagctttatc tttctccaaa ttctcatcac ctgataaaat ccgtatgttg 420gatttcatgc atgagcctgc aaattacagg cgtatgtttt ccttgaaaac actcaattcc 480tttctgatta gaatttcaca gaattctata aaaccctgca gaattcatat taaatcgatg 540gcttaaactg ctgaccgcta attaatgctt cataattgga agtgcttatt gtatgacaaa 600aatgacaata gcgatggctg gtactggagc ttccaactac aatccttgaa catggttagt 660tgcctaatac ctcccctgat gtgcctctgc gatctaattg cttgcctgca gtgaccatct 720aattattcaa gtgtatatac accttgtcgg tcggctatat ctctatttag tttatatttt 780gcaaccttaa ttacacgtaa cacatatacg aacacgcaac catatcatca agcacagggc 840ggcacgcatc tacagcctgc agttcatgct gtgttgttta agaaggaaaa tgattttttt 900ttaaaaaaaa agaagaggaa gaagatatga ttatctatct actgtagtga aagtgtcaac 960atgacgacgt gcagcggaat agtacatcaa acataaagta gtacacctaa ttatattggt 1020accaaaagat aacccgtagc agtaacaagt tgttaattgt tgattctaaa ttttgaggac 1080atatgccgtg aaaacgagtt aagtattgaa aactcgtgaa aaatcatgaa aaaaattaca 1140ttctcaccga atcttatgtt caaacttagc tttattcgag agtaaaaata aatatttttt 1200aggtgaatag taactatttt caggtgaatg gtaaaaaaga caaataaact caactttatt 1260tgggaatgaa aatccacttg aaatttgtca tttttattac tctcaaatga agctgagttt 1320ggacttgaca tttggtgaga atgtacttca aatctacaca tatctctagc aaatgtttca 1380tgaatttact aaacttttag gtatgatttc acgagttttc aacacttagc tcgttttcac 1440agagtatttc cctagtcgtc gctatgcccg cgtatacttc gtcccccctg gatgtcaagg 1500tctccatgga tgtgcacaga tgataaactg tagtgtgctt agcatatcgc gagactatcg 1560ggtaatggac aactcatatt taattgtgct agagaaaaaa aaaagataaa ttgcagtttg 1620tactatatat tcttgaaagt gttcatatta tatcatcgtt taaccatttt tttcatatac 1680acaacatcta actttacatt tcattttgga ctaccccatt ctatccatct tcaaggccgg 1740
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1.白葉枯病抗性相關蛋白，它是具有序列表中SEQ ID №3胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID №3的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且與白葉枯病抗性相關的由SEQ ID №3衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述的白葉枯病抗性相關蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特徵在於所述編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據權利要求2所述的基因，其特徵在於所述編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權利要求2或3或4所述基因的表達載體，細胞系和宿主菌。
6.培育抗白葉枯病植物的方法，是將權利要求2或3或4所述白葉枯病抗性相關蛋白編碼基因導入目的植物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述植物為水稻。
8.一種獲得抗白葉枯病水稻的方法，是利用抗白葉枯病水稻品種IRBB5和感病水稻品種雜交得到F1代植株，F1代植株自交得到F2代植株，對得到的F2代植株接種白葉枯病致病菌進行抗性鑑定和利用分子標記K5或K8或SSR3進行PCR檢測，確定含有來自IRBB5中較大的漸滲片段的抗性植株，所述含有來自IRBB5材料中較大的漸滲片段的抗性植株自交產生的F3代抗性植株，即為xa5基因純合型的抗白葉枯病水稻。
9.檢測植物白葉枯病抗性的方法，是用由序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列組成的一對引物對待測植物的基因組DNA進行PCR擴增，然後對得到的PCR擴增產物進行下述1)和2)中的至少一種檢測1)對所述PCR擴增產物進行單核苷酸多態性檢測，確定自序列表中SEQ ID NO6的5′端第21-22位鹼基是否為AG；2)用XhoI酶切所述PCR擴增產物，確定酶切片段中是含有一條145bp條帶。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述植物為水稻。
全文摘要
本發明公開了一種白葉枯病抗性相關蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的白葉枯病抗性相關蛋白，它是具有序列表中SEQ ID №3胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID №3的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且與白葉枯病抗性相關的由SEQ ID №3衍生的蛋白質。可利用該白葉枯病抗性相關蛋白編碼基因的片段檢測植物白葉枯病抗性，如用由序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列組成的一對引物對待測植物的基因組DNA進行PCR擴增，然後對得到的PCR擴增產物進行檢測。本發明對培育抗病植物品種，擴大作物種植範圍，提高農作物產量具有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK1807453SQ200510002390
公開日2006年7月26日 申請日期2005年1月19日 優先權日2005年1月19日
發明者翟文學, 朱立煌, 江光懷, 夏志輝 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所