一種大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導表達載體pDXW-8及其構建方法

2023-10-31 13:13:02 2

專利名稱：：一種大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導表達載體pDXW-8及其構建方法
技術領域：
：—種大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導表達載體pDXW-8及其構建方法，屬於微生物基因工程領域。
背景技術：
：棒狀桿菌是一類革蘭氏陽性菌，屬於具有中度到高GC含量的放線菌。自人們首次分離穀氨酸棒狀桿菌生產L-穀氨酸以來(Kinoshita等，1957年)，棒狀桿菌的三個主要代表穀氨酸棒狀桿菌，黃色短桿菌，和乳糖發酵短桿菌，已經被廣泛用於生產胺基酸。這裡特別指出，通過DNA-DNA雜交實驗發現，這三個不同物種之間只有很小的差別(Liebl等，1991)。由於已累計了大量的關於穀氨酸棒狀桿菌生理學，生物化學和遺傳學知識(EggelingandBott，2005;Burkovski，2008)，代謝工程已經取代經典的隨機突變，成為棒狀桿菌菌種改良的主要策略。可應用於棒狀桿菌的載體系統的構建，是生產菌株的代謝工程改良以及棒狀桿菌基礎研究的基礎。目前，已經有一些可以應用於棒狀桿菌的表達載體(EggelingandBott，2005)。根據不同的棒狀桿菌複製子，我們把這些表達載體分為四組。第一組包括pEKExl和pXMJ19，其複製子來自質粒pBLl;第二組包括pVWExl和pZ8_l，其複製子來自質粒pHM1519;第三組包括pECTAC-K99，pECTAC-XK99E，pECTAC-XC99E和pECTAC-XT99A，其複製子來自質粒pHM1519;第四組包括pAPE12，其複製子來自質粒pNG2。所有這些載體都有兩個缺點一是在多克隆位點處含有較少的單限制酶酶切位點，另一是基因組成型表達或在laclq的控制下進行誘導表達。應用代謝工程進行菌種改良時，我們將經常要共表達來自同一個生物合成或降解途徑的多個基因。攜帶許多限制性內切酶的多基因大片段DNA可能不能被克隆到含較少單限制酶酶切位點的多克隆位點處(Radmacher等，2002)。此外，在棒狀桿菌中，lacP啟動子不能很有效地行使轉錄功能，從而導致tac啟動子不能被嚴謹控制(Billman-Jacobe等，1994)。在本發明中，我們構建了新型棒狀桿菌表達載體pDXW-8，新的載體改善了多克隆位點的切點數目，並且用laclP，取代了lacP，能對基因的表達進行嚴謹控制。作為一個引用例子，我們在黃色短桿菌中成功地應用pDXW-8表達了編碼透明顫菌血紅蛋白(VHb)的vhb基因(KhoslaandBailey，1988)。
發明內容本發明的目的是構建一種在大腸桿菌和棒狀桿菌中能表達外源基因的表達載體，最終能使外源基因在此載體相關元件的控制下，在大腸桿菌和棒狀桿菌中實現誘導表達。本發明的技術方案一種大腸桿菌_棒狀桿菌穿梭型誘導表達載體pDXW-8，其核苷酸序列為:SEQIDNO:1。4表達載體pDXW-8，含有一個在大腸桿菌和棒狀桿菌中具有轉錄啟動功能的tac啟動子；從79位到18位；含有在大腸桿菌和棒狀桿菌中具有轉錄終止功能的終止子rrnBTlT2，分別從9272到9229位，及從9097到9070位;含有用於棒狀桿菌轉化子選擇的抗性標記卡那黴素標記抗性基因，從413位到1228位；含有使質粒能在棒狀桿菌宿主中複製並穩定存在的r印片段，從1635位到4320位。含有用於嚴謹控制tac啟動子表達的負調控基因lacIPF1°4，從6985到5903位，其攜帶的外源啟動子PF104及SD序列，PF104及SD序列核苷酸序列為ttgaccgatccggacacctgggataatgtgtgg￡tttttgtcg_gjg^g.gga;tggtgaat，其中，戈lj線部分為啟動子PF104序列，加框部分為SD序列。含有用於克隆外源基因的人工合成的74bp多克隆位點MCS，從9546位到9478位，包含如下11個單一的限制性內切酶切點EcoRI，Nhel，Sacl，Ncol，Notl，Xhol，Kpnl，BglII，SaclI，AflII，禾口HindIII，其核苷酸序列為gaattcgctagcgagctcccatgggcggccgcctcgagggtaccagatctccgcggcttaagctgcagaagctt。表達載體pDXW-8的構建方法首先，以質粒pET-28a為模板，kan-F和kan-R為引物，通過PCR擴增1023bp的卡那黴素抗性基因。在擴增產物的5'和3'末端引入限制酶SgrAI酶切位點。PCR產物用SgrAI酶切，pKK223-3同樣用SgrAI酶切，用鹼性磷酸酶CIAP去磷酸化；兩者連接，由此產生的質粒大小為5617bp，命名為pDXW-5。第二步，以質粒pC2為模板，r印-F和r印-R為引物，通過PCR擴增2686bp的r印片段。r印片段與質粒的複製相關，最初來源於乳糖發酵短桿菌(B.lactofermentum)隱蔽質粒pBLI(Fernandez-Gonzalezetal.，1994)。在擴增產物的5'和3'末端引入限制酶PshAI酶切位點。PCR產物用PshAI酶切，並連接到同樣用PshAI酶切，且用CIAP去磷酸化後的pDXW-5。由此產生的質粒大小為8313bp，命名為為pDXW-6。為了證明r印片段和卡那基因片段在棒狀桿菌中的功能，我們用質粒pDXW-6轉化黃色短桿菌B.flavum，並選擇卡那黴素抗性克隆。第三步，以質粒pET-28a為模板，攜帶PF104序列正向引物Iacl-F，反向引物Iacl-R為引物，通過PCR擴增1191bp的laclP，基因。在擴增產物的5'和3'末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位點。PCR產物用EcoRI和HindIII雙切，並連接到同樣用EcoRI和HindIII雙切後的pDXW-6。由此產生的質粒大小為9510bp命名為pDXW-7。第四步，人工合成了74bp的多克隆位點MCS的DNA片段5'gaattcgctegcgagctcccatgggcggccgcctcgagggtaccagatctccgcggctteagctgcagaagctt3'，它包含有11個單一的限制性內切酶切點(EcoRI，Nhel，Sacl，Ncol，Notl，Xhol，KpnI，BglII，SacII，AflII，和HindIII)，用EcoRI和HindIII雙切74bp的多克隆位點MCS片段，並連接到同樣用EcoRI和HindIII雙切的pDXW-7上，以取代pDXW-7原有的多克隆位點。對新構建的質粒MCS及其兩翼進行測序，以驗證MCS是否正確連接到pDXW-7上。構建的質粒大小為9548bp，並命名為pDXW-8。最後，以質粒pDXW-8為模板，分別用引物對Kan/r印-D/kan-F，Kan/r印-D/Kan-R，Kan/r印-D/r印-F，Kan/r印-D/r印-R，lacI_D/lacI_F，禾口lacI_D/lacI_R進行DNA片段的PCR擴增，鑑定了質粒pDXW-8上kan插入方向為正向插入，r印和lacIPF1°4片段的插入方向均為反向插入。以上所述的擴增引物，擴增條件詳見實施例1。本發明的有益效果1、本發明表達載體在大腸桿菌和棒狀桿菌中皆具有表達外源基因的能力。2、本發明的表達載體，它的MCS包含多達11個單限制性內切酶切點，能有效地克隆大片段DNA。3、本發明的表達載體，控制基因應用了laclPF，，使外源基因無論是在大腸桿菌，還是在棒狀桿菌中的表達，都受到嚴謹調控。4、本發明的表達載體pDXW-8，其tac啟動子在棒狀桿菌中活性相對較低，尤其適用與棒狀桿菌生產次生代謝產物的代謝工程研究。生物材料樣品保藏大腸桿菌JM109(pDXW-8){EscherichiacoliJM109(pDXW-8)}已保藏於中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏編號CCTCCNO:M209199，保藏日期2009年9月11日。圖1表達載體pDXW-8的構建過程圖。圖2表達載體pDXW-8的物理圖譜。具體實施例方式實施例1表達載體pDXW-8的構建表達載體pDXW-8的構建過程如圖1所示。我們用大腸桿菌表達載體pKK-223-3作為構建目的載體的母質粒，pKK-223-3攜帶tac啟動子，rrnBTlT2終止子，二者在棒狀桿菌中都能有效地行使功能(SrivastavaandDeb，2005)。在大腸桿菌JM109和棒狀桿菌中，在誘導劑IPTG存在的情況下，可失活Lacl阻遏蛋白，pKK-223-3攜帶的靶基因可進行誘導表達。由於棒狀桿菌對氨苄青黴素不敏感，我們向pKK223-3上引進了卡那黴素抗性基因kan作為選擇標記在棒狀桿菌對。以質粒pET-28a為模板，kan-F和kan-R為引物，通過PCR擴增1023bp的卡那黴素抗性基因。在擴增產物的5'和3'末端引入限制酶SgrAI酶切位點。PCR產物用SgrAI酶切，並連接到同樣用SgrAI酶切，且用CIAP去磷酸化後的pKK223-3。由此產生的質粒大小為5617bp，命名為pDXW-5。以質粒pC2為模板，r印-F和r印-R為引物，通過PCR擴增2686bp的r印片段。r印片段與質粒的複製相關，最初來源於乳糖發酵短桿菌(B.lactofermentum)隱蔽質粒pBLI(Fernandez-Gonzalezetal.，1994)。在擴增產物的5'和3'末端引入限制酶PshAI酶切位點。PCR產物用PshAI酶切，並連接到同樣用PshAI酶切，且用CIAP去磷酸化後的pDXW-5。由此產生的質粒大小為8313bp，命名為pDXW-6。為了證明r印片段和卡那基因片段在棒狀桿菌中的功能，我們用質粒pDXW-6轉化黃色短桿菌B.flavum，選擇卡那黴素抗性克隆。6為了在棒狀桿菌中調節耙基因的表達，我們向質粒pDXW-6中引進lacl基因。棒狀桿菌中有關啟動子功能的信息表明，革蘭氏陰性菌啟動子與棒狀桿菌啟動子可能略有不同(P6teketal.，2003)。載體pET-28a的lacl是laclq版本，在大腸桿菌中，其Lacl阻遏蛋白產量足以抑制tac啟動子的表達；但在棒狀桿菌中，laciq啟動子不能非常有效的轉錄，從而導致在棒狀桿菌中，tac啟動子不能被嚴謹地控制(Billman-Jacobeetal.，1994)。分離自棒狀桿菌噬菌體①GA1的啟動子片段PF104(GenBank登錄號X90367)可以在棒狀桿菌中很好地工作(P(5teketal.，1996)。在這裡，我們提出lacIPF1°4版的lacl，lacIPF1°4使用啟動子PF104。以質粒pET-28a為模板，攜帶PF104序列正向引物Iacl-F，和反向引物Iacl-R為引物，通過PCR擴增1191bp的laclP，基因。在擴增產物的5'和3'末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位點。PCR產物用EcoRI和HindIII雙切，並連接到同樣用EcoRI和HindIII雙切後的pDXW_6。由此產生的質粒大小為9510bp命名為pDXW_7。插入kan，r印和lacIPF1°4片段後，pKK223_3上的多克隆位點只包含EcoRI和HindIII兩個單限制酶切點。為了改善單限制性內切酶切點數，我們人工合成了74bp的多克隆位點DNA片段5'gaattcgctagcgagctcccatgggcggccgcctcgagggtaccagatctccgcggcttaagctgcagaagctt3'，它包含有11個單一的限制性內切酶切點(EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，KpnI，BglII，SacII，AfIII，和Hindi11)，用EcoRI和Hindi11雙切74bp的多克隆位點MCS片段，並連接到同樣用EcoRI和HindIII雙切的pDXW_7上，以取代pDXW-7原有的多克隆位點。我們對新構建的質粒MCS及其兩翼進行測序，以驗證MCS是否正確連接到pDXW-7上，構建的質粒大小為9548bp，並命名為pDXW-8。以質粒pDXW-8為模板，分別用引物對Kan/r印-D/kan-F，Kan/r印-D/Kan-R，Kan/r印-D/r印-F，Kan/r印-D/r印-R，lacI_D/lacI_F;禾口lacI-D/lacI-R進行DNA片段的PCR擴增，鑑定了質粒PDXW-8上kan插入方向為正向插入，r印和lacIPF1°4片段的插入方向均為反向插入。構建過程中使用的引物序列見表l，PCR反應條件見表2，表達載體pDXW-8的物理圖譜見圖2。表1.本發明所用引物及其序列(劃線部分為酶切位點)tableseeoriginaldocumentpage8441bpvhb基因的開放閱讀框。在擴增產物的5'和3'末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位點。PCR產物用EcoRI和Hindi11雙切，並連接到同樣用EcoRI和Hindi11雙切後的pDXW-8，產生的重組質粒pDXW-8-vhb。lmL過夜培養的大腸桿菌JM109接種到30mL的LB培養基中，JM109(pDXW_8)及JM109(pDXW-8-vhb)分別接種到30mL的含卡那黴素的LB培養基中。同樣地，lmL過夜培養的黃色短桿菌B.flavum接種到30mL的LBG培養基中，黃色短桿菌B.flavum(pDXW-8)和黃色短桿菌B.flavum(pDXW-8-vhb)分別接種到補充卡那黴素的30mLLBG培養基中。上述30mL培養物生長到在600nm光密度為0.6時，加入終濃度為lmmol/L的誘導劑IPTG。4h後，離心收穫細胞並懸浮在5mL磷酸鹽緩衝液(100mmol/L、pH7.8)中。在1%的SDS條件下，細胞煮沸5分鐘，裂解物用於SDS-PAGE分析。用ConstantCellDisruptionSystems(ConstantSystems,Daventry，UK)，在20KPSI條件下，破碎細胞，離心除去細胞碎片，粗提物用於VHb蛋白的生物活性分析。此外，為了檢查tac啟動子是否被lacIPF1°4嚴謹控制，在不添加誘導劑條件下，30mL黃色短桿菌B.flavum(pDXW-8-vhb)生長。收穫細胞和製備粗提物方法同上。大腸桿菌JM109,JM109(pDXW-8)，JM109(pDXW-8-vhb)，黃色短桿菌B.flavum，B.flavum(pDXW-8)和B.flavum(pDXW-8-vhb)細胞裂解液分別進行SDS-PAGE分析(Ausubeletal.，1995)。大腸桿菌細胞裂解液SDS-PAGE分析結果表明，存在著一個特異性的蛋白帶，其分子量約為16kD，這和據胺基酸序列預測的VHb分子量相一致。但在B.flavum(pDXW-8-vhb)的SDS-PAGE中，沒有呈現出特異性的VHb蛋白條帶。為了進一步證明vhb基因的表達，我們應用CO差光譜法(WebsterandLiu，1974)，分別對上述六個菌株粗提物進行了VHb的生物活性檢測。對IPTG誘導的大腸桿菌JM109,大腸桿菌JM109(pDXW-8)，B.flavum和B.flavum(pDXW-8)粗提物的VHb活性進行CO差光譜分析，我們沒有觀察到VHb活性的CO差光譜。對IPTG誘導的大腸桿菌JM109(pDXW-8-vhb)和B.flavum(pDXW-8-vhb)粗提物的VHb活性進行CO差光譜分析，都觀察到了VHb活性的CO差光譜，二者在420nm處都呈現出一個峰。峰值表明，在大腸桿菌JM109(pDXW-8)中，vhb基因誘導表達水平非常高，在所述測定條件，每mLlOOmg溼重菌體含量的細胞裂解液上清液在600nm條件下光吸收達0.522;在B.flavum(pDXW-8)中，vhb基因誘導表達水平相對較低，為0.012。對非IPTG誘導的B.flavum(pDXW-8-vhb)粗提物，我們沒有觀察到VHb活性的CO差光譜，這證明了在B.flavum(pDXW-8-vhb)中lacIPF1°4嚴格控制了tac啟動子的表達。序列表〈210>SEQIDNO:1〈211>9548〈212>DNA〈213〉質粒pDXW-8全長DNA〈400〉1ttctgtttcctgtgtgaaattgttetccgctcacaattccacacattetecgagccgatg60atteattgtcaacagctcatttcagaatetttgccagaaccgttetgatgtcggcgcaaa120aaacattetccagaacgggagtgcgccttgagcgacacgaattetgcagtgatttecgac180ctgcacagccateccacagcttccgatggctgcctgacgccagaagcattggtgcaccgt240gcagtcgateagetceggatcctctecgccggaegcategtggceggcatcaccggcgct300ttgatcttttcteeggggtctgacgctcagtgg皿cga皿3ctcacgtte360ate^actgtctgettecat皿3C3gteatac皿ggggtgttetgagcca420tettcaacgggaaaegtettgctcteggccgcgatte皿ttcc皿catggatgctgattt■atetgggteta皿tgggctcgcgateatgtcgggc皿tcaggtgcgac皿tctetcgatt540gtetggg皿gcccgatgcgccagagttgtttctg皿3catggca皿ggtegcgttgccaa600tgatgttecagatg卿tggctggctgacggaatttetgcctcttccgac660catcaagcattttetccgtectcctgatgatgcatggttectcaccactgcgatccccgg720ttccaggtetttgttgatgc780gctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgteattgtcctttteacag840cgatcgcgtetttcgtctcgctcaggcgcaatc3cg皿tg皿teacggtttggttgatgc■gagtgattttgatgacgagcgt皿tggctggcctgttg皿c皿gtctgga960teaacttttgccattctcaceggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgatea1020ccttetttttgacg郷gga朋tteateggttgtettgatgttggacgagtcggaatcgc1080agaccgateccaggatcttgccatcctetggaactgcctcggtgagttttctccttcatt11403C3g皿3Cggctttttcaaatgat朋tcctgatetg皿teaattgcagtt1200tcatttgatgctcgatgagtttttctaagaatteattratgagcggatec1260ateggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctg1320acaccggcgcC3C3ggtgCggttgctggcgcctetatcgccgacatcaccgatgggg皿g1380atcgggctcgccacttcgggetcatgagegcttgtttcggcgtgggtetggtggcaggcc1440ccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcgg1500tgctcaacggcctcaacctectectgggctgcttccteatgcaggagtcgC3t朋ggg3g1560agcgtcgaccgatgeccttgagagectteaacccagtcagctccttccggtgggcgcggg1620gcatgactetcgtcgtctecgtctgatgetttgaatcggacggacttgccgatcttgtet1680gcggtgatttttccctcgtttgcccacttttt皿tggtggccggggtgagagetecgegg1740gcggcgacctgctgcgctgtgatccaatettcggggtcgttcactggttcccctttctga1800tttctggcatag皿g朋cccccgtgaactgtgtggttccgggggttgctgatttttgcga1860gacttctcgcgcaattccct賜ctteggtg皿皿c3cratg皿3cacteggg3朋C3CCC1920atgaleaeccattegggcagtegggeggettcttcgtctagggcttgcatttgggcggt1980gatctggtctttegcgtgtg皿agtgtgtcgteggtggcgtgctc^tgc3ctcg^cgt2040caegtcatttaccgggtcacggtggg咖agagaactegtgggttegacattgttttcct2100cgttgtcggtggtggtgagcttttctageegctcggteaacgcggcgatcatgaactctt2160ggaggttttcaccgttctgcatgcctgcgcgcttcatgtcctcacgtegtgccaaaggaa2220cgcgtgcggtgaccacgacgggcttegectttgcctgcgcttctagtgcttcgatggtgg2280cttgtgcctgcgcttgctgcgcctgtegtgcctgttgagcttcttgtegttgctgttcte2340gctgtgccttggttgccatgctttaagactctagtegctttcctgcgatetgtcatgcgc2400atgegtegeaaacattgtcctgcaactcattcattetgtgcagtgctcctgttectagtc2460gtacatactcatatttacctagtctgcatgcagtgcatgcacatgcagtcatgtcgtgct252010朋tgtgte朋acatgtacatgcagattgctgggggtgcagggggcggagccaccctgtcc25803tgCggggtgtggggcttgccccgccggtagcaccggggcacctagtcgc2640ggatacccccccteggtetcggacacgteaccctcccatgtcttteacat2700tgagtecgggteagctggcacgcategccaagcteggcggccactaaaaa2760ttaategtccca皿cccccgtgcgagctaccaactcatatgC3CgggggC2820cacateacccgaaggggtttccatagcact3CgggC3C朋2880C3CCCgC3C3aactcgcactgcgcaaccccgcacaacatcgggtctaggt2940teg朋gtg朋cacctcteagg33CCgC3ggt固tg郷gttctaaggtcactcgcgcte3000gggcgtggcgteggc朋朋cgtcatgtecategt皿ggctctggcggggt3060gccateggtggcgcagggacg啷ctgttgcggtgtcctggtcgtcteacggtgcttcgc3120agtttgagggtctgcaaaactctcactctcgctgggggtcacctctggctg￡l￡lttgg￡l￡lg3180tcatgggcgaacgccgcattgagctggctettgctectaagaatcacttggcggcgggtg3240gcgcgctcatgatgtttgtgggcactgttcgacac^ccgctcacagtcatttgcgcagg3300ttgaagcgggtettaagactgcgtactcttcgatggtg皿aacatctcagtgg朋g朋3g3360朋cgtgcacggtecggggtggagcacacctgactcttggg3420cg朋cggttggcacttgcaccgcaacatgctgttgttcttggatcgtccactgtctgacg34803tg朋ctc朋ggcgtttgaggattccatgttttcccgctggtctgctggtgtggttaagg3540ccggtetggacgcgccactgcgtgagcacggggtca皿cttgatraggtgtctecctggg3600gtgg卿cgctgcg朋朋tggcaacctecctcgcte郷gcatgtctcagg朋ctgactg3660gctccgctecte朋accgcgtcte郷ggtcgtecacgccgtttcagatgttggatatgt3720tggccgatca朋gcgacgccggcg郷atetggacgctgttttggtggctcggtggcgtg37803gtetg3ggttggttcteaaaacctgcgttcgtcctggtcacgtggggctaagcgtgctt3840tgggcattgattacatagacgctgatgtecgtcgtg皿atctgtacaagc3900tcgccggtctggaagcaccgg咖gggtcgaatcaacccgcgttgctgttgctttggtga3960agcccgatgattgg朋actgattcagtctgatttcgcggtteggcagtecgttctegatt4020gcgtgg3te3ggctaaggacgtggccgctgcgcaacgtgtcgct皿tgaggtgctgg固4080gtctgggtgtggattccaccccgtgcatgatcgttetggatgatgtggacttggacgcgg4140ttctgcctectcatggggacgctectaagcgtgatctg皿tgcggcggtgttcgcgggte42003tg3gC3g3Ctettcttcgcagcggcateaaccccgttcgatattttgtg4260cgatgaatttatggtc朋tgtcgcgggggc皿actetgatgggtcttgttgttgac朋tg4320gactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgcc4380ggcagcgctctgggtcattttcggcg郷accgctttcgctgg鄉gcgacgatgatcgg4440cctgtcgcttgcggtettcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcc4500CgCC3CC朋3cgtttcggcg3g皿gC3ggCcattatcgccggratggcggccgacgcgct4560gggctecgtcttgctggcgttcgcgacgcg郷ctggatggccttccccattatgattct4620tctcgcttccggcggcatcgggatgcccgcgttgcaggccatgctgtccaggc郷t卿4680tgacgaccatcagggacagcttcaaggatcgctcgcggctctteccagccteacttcgat4740cactggaccgctgatcgtcacggcgatttatgccgcctcggcgagcacatggaacgggtt4800ggcatggattgtaggcgccgccctataccttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgc48603tgg3gCCgggccacctcgacctg皿tggaagccggcggcacctcgctaacggattcacc4920actcc^g^tcaattcttgCgg3g33Ctgtg皿tgcgca皿cc皿ccct4980tggC3g皿C3tetccatcgcgtccgccatctccagcagccgcacgcggcgcatctcgggc5040agcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggcte5100ggctggcggggttgccttectggttegragcgatecgcgagCg33Cgtg35160agcgactgctgCtgC33皿Cgtctgcgacccatg皿tggtcttcggtttc5220cgtgtttcgt皿3gtctgga皿cgcgg皿gtcagcgccctgcaccattatgttccggatc5280tgcatcgcaggatgctgctggcteccctgtgg皿cacctecatctgtett皿cg皿gcgc5340tggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccateccgccagttgttte5400ccctcac皿cgttccagteaccgggcatgttcatcatcagteacccgtatcgtgagcatc5460ctctctcgtttcatcggtetcattacccccattccccctt3C3Cgg3ggC5520atc^gtgac皿皿ccgcccttaacatggcccgctttetc3g皿gCC3g35580cattaacgcttctggag皿actcaacgagctggacgcggatg皿C3ggC3gacatctgtg5640aatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatg5700cctctgacacatgcagctcccgg卿cggtcacagcttgtctgt皿gcgg57603tgCCggg3gC3g3C^gCCcgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcg5820cagccatgacccagtcacgtagegategeggagtgtetecggtgccteatgagtgagcte5880acttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcggga皿cctgtcgtgcca5940gctgcatteatgaatcggcc咖gcgcgggg卿ggcggtttgcgtattgggcgcc郷g6000tggtttttcttttcaccagtg卿cgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccct6060gag卿gttgcagc皿gcggtccacgctggtttgccccagC3ggCg皿皿tcctgtttga6120tggtggtteacggcgggateteacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccg6180agatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggt皿tggcgcgcattgcgcccagcgcca6240tctgatcgttggC33CC3gCatcgragtggg33Cg3tgCCctcattcagcatttgcatgg6300tttgttgaaa3CCgg3C3tggcactccagtcgccttcccgttccgctetcggctgaattt6360gattgcgagttgccagccagCC3g3CgC3g3CgCgCCg3g3cag皿ctte6420atgggcccgcteacagcgcgatttgctggtgacccaatgcg3CC3g3tgCtccacgccca6480gtcgcgteccgtcttcatggtectgttgatgggtgtctgg6540c^g皿ateaCgCCgg皿C3ttegtgc郷cagcttccac3gC^tggC3tcctggtcat6600ccagcggategtteatgateagcccactgacgcgttgcgcg卿卿ttgtgcaccgccg6660ctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagtt6720gatcggcgcgagatttaatcgCCgCg3C33tttgcgacggcgcgtgcagggccagactgg6780gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgg6840g^tgt皿ttcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgC3g皿3Cgt6900ggctggcctggttcaccacgCggg3咖ggg3C3CCggC3tectctgcga6960catcgtateacgttactggtttcatettcaccatcctttcccacacatte7020tcccaggtgtccggatcggtcaaatecgctggtetectggctteactetgCggC3tC3g37080ctg卿gtgcaccatetgcggtgtga皿teccgcacagatgcgt皿ggag7140皿皿teccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgt7200tableseeoriginaldocumentpage13ctagcgaa9548kan_F:agcacaccggcggtttgatcttttctacggggtckan-R:agcacaccggcgtcaggtggcacttttcggggaarep_F:agtagactatcgtccattgtcaacaacaagacccatcarep-R:agtagactatcgtcgtctacgtctgatgctttgaatcglacI-F:gctgtataccagcgtatttgaccgatccggacacctgggataatgtgtggattttgtcggg^aggatggtg^tetg^3ccagteacg33tclacI-R:gtatacggtgcctaatgagtgagctaacttKan/rep_D:ctcacaattccacacattatacgalacI—D-acacggaggcatcaagtgaccaaa權利要求一種大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導表達載體pDXW-8，其核苷酸序列為SEQIDNO1。2.根據權利要求1所述的表達載體pDXW-8，其特徵在於含有用於嚴謹控制tac啟動子表達的負調控基因laCIPF1°4JA6985到5903位，其攜帶的外源啟動子PF104及SD序列，PF104及SD序列核苷酸序列為cagcgtatttgaccgatccggacacct匿ataatgtetggattttgtcgg逛aaaggajtggtgaat，其中劃線部分為啟動子PF104序列，加框部分為SD序列；含有用於克隆外源基因的人工合成的74bp多克隆位點MCS，從9546位到9472位，包含如下11個單一的限制性內切酶切點EcoRI，Nhel，Sacl，Ncol，Notl，Xhol，Kpnl，BglII，SaclI，AflII，禾口HindIII，其核苷酸序列為gaattcgctagcgagctcccatgggcggccgcctcgagggtaccagatctccgcggcttaagctgcagaagctt。3.如權利要求1或2所述的表達載體pDXW-8的構建方法，其特徵是以質粒pET-28a為模板，kan-F和kan-R為引物，通過PCR擴增1023bp的卡那黴素抗性基因，在擴增產物的5'和3'末端引入限制酶SgrAI酶切位點，PCR產物用SgrAI酶切；pKK223-3同樣用SgrAI酶切，用鹼性磷酸酶CIAP去磷酸化；兩者連接，由此產生的質粒大小為5617bp，命名為pDXW-5;以質粒pC2為模板，r印-F和r印-R為引物，通過PCR擴增2686bp的r印片段，在擴增產物的5'和3'末端引入限制酶PshAI酶切位點，PCR產物用PshAI酶切，並連接到同樣用PshAI酶切，且用CIAP去磷酸化後的pDXW-5，由此產生的質粒大小為8313bp，命名為為pDXW-6;為了證明r印片段和卡那基因片段在棒狀桿菌中的功能，我們用質粒pDXW-6轉化黃色短桿菌B.flavum，並選擇卡那黴素抗性克隆；以質粒pET-28a為模板，攜帶PF104序列的正向引物Iacl-F，和反向引物Iacl-R為引物，通過PCR擴增1191bp的lacf基因，在擴增產物的5'和3'末端引入限制酶EcoRI和Hindi11酶切位點，PCR產物用EcoRI和Hindi11雙切，並連接到同樣用EcoRI和Hindi11雙切後的pDXW-6，由此產生的質粒大小為9510bp，命名為為pDXW-7;人工合成的74bp多克隆位點MCS的DNA片段5'gaattcgctagcgagctcccatgggcggccgcctcgagggtaccagatctccgcggcttaagctgcagaagctt3，，它包含有11個單一的限制性內切酶切點EcoRI，NheI，Sacl，Ncol，Notl，Xhol，Kpnl，BglII，SacII，AfIII，和HindIII;用EcoRI和HindIII雙切74bp的多克隆位點MCS片段，並連接到同樣用EcoRI和HindIII雙切的pDXW-7上，取代pDXW-7原有的多克隆位點，對該構建質粒的MCS及其兩翼進行測序，以驗證MCS正確連接到pDXW-7上，構建的質粒大小為9548bp，並命名為pDXW-8;以質粒pDXW-8為模板，分別用引物對kan/r印-D/kan-F，kan/r印-D/kan-R，kan/r印-D/r印-F，kan/r印-D/r印-R，lacI_D/lacI_F，及lacI_D/lacI_R進行DNA片段的PCR擴增，鑑定了質粒PDXW-8上kan插入方向為正向插入，r印和lacIPF1°4片段的插入方向均為反向插入；以上所述的PCR擴增所需引物序列kan_F:agcacaccggcgctttgatcttttctacggggtckan_R:agcacaccggcgtcaggtggcacttttcggggaarep_F:agtagactatcgtccattgtcaacaacaagacccatcarep_R:agtagactatcgtcgtctacgtctgatgctttgaatcglacI-F:gctgtataccagcgtatttgaccgatccggacacctgggataatgtgtggattttgtcggg朋3gg3tggtg朋tetg朋3cc3gt朋cg朋tclacI—R:gtatacggtgcctaatgagtgagctaacttPCR反應條件擴增kan基因PCR反應所用引物為kan-F，kan-R;退火溫度57。C，延伸時間75s;擴增r印片段PCR反應所用引物為r印-F，r印-R，退火溫度6rC，延伸時間165s;擴增lacf基因PCR反應所用引物為Iacl-F，Iacl-R，退火溫度69°C，延伸時間75s;確定kan基因正向插入PCR反應所用引物為Kan/r印-D，Kan-R，退火溫度57°C，延伸時間75s;確定kan基因反向插入PCR反應所用引物為Kan/r印-D，Kan-F，退火溫度57°C，延伸時間75s;確定r印片段正向插入PCR反應所用引物為Kan/r印-D，r印-R，退火溫度57。C，延伸時間255s;確定r印片段反向插入PCR反應所用引物為Kan/r印-D，r印-F，退火溫度57。C，延伸時間255s;確定laclPF鵬基因正向插入PCR反應所用引物為Iacl-D，lacI-R，退火溫度59。C，延伸時間105s;確定laclP"M基因反向插入PCR反應所用引物為Iacl-D，Iacl-F，退火溫度59"，延伸時間105s。全文摘要一種大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導表達載體pDXW-8及其構建方法，屬於基因工程
技術領域：
。本發明的表達載體pDXW-8，能在大腸桿菌和棒狀桿菌中複製並穩定存在，含有一個在大腸桿菌和棒狀桿菌中皆具有轉錄啟動功能的tac啟動子，及轉錄終止功能的終止子rrnBT1T2；含有一個用於棒狀桿菌轉化子選擇的抗性標記卡那黴素標記抗性基因；含有一個用於嚴謹控制tac啟動子表達的負調控基因lacIPF104；含有一個包含11個單一的限制性內切酶切點的多克隆位點MCS。在棒狀桿菌中，該載體表達外源蛋白的水平適中，尤其適用於棒狀桿菌代謝工程的研究。文檔編號C12N15/77GK101693901SQ200910233618公開日2010年4月14日申請日期2009年10月26日優先權日2009年10月26日發明者徐大慶,李燁,王小元,譚延振申請人:江南大學;