針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法及其應用的製作方法

2024-04-05 10:06:05 4

專利名稱：針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法及其應用，屬於作物病害診斷和病原菌鑑定的技術領域。
背景技術：
由鐮刀菌(Fusarium spp.)引起的小麥赤黴病(Fusarium head blight, FHB)是一種廣泛流行的世界性病害，主要發生於溫暖溼潤地區，是影響小麥高產、穩產和優質的重要因素之一。19世紀90年代以來，北美、歐洲、亞洲等地大麥、小麥赤黴病災情嚴重。我國南方長江中下遊冬麥區發生嚴重，隨著全球性氣候變暖、耕作制度以及耕作方式的改變，小麥赤黴病正向黃淮麥區、北方麥區以及西南和西北麥區擴展(Ma等，2008)，幾乎蔓延到所有小麥種植區。2003年，長江中下遊地區60-80%的麥區感染赤黴病，減產超過20%。2005 年，江蘇省赤黴病的發生面積為1800萬畝左右，佔全省總種植面積的72%。全國農業技術推廣服務中心預報2011年赤黴病在全國流行面積為6500萬畝。小麥赤黴病的發生與流行還帶來巨大的食品安全性隱患。鐮刀菌可以產生單端孢黴烯毒素(trichothecene)，人畜食用受赤黴病真菌毒素汙染的麵粉會發生嘔吐、腹瀉及食欲不振等急、慢性中毒症狀，嚴重者可導致死亡(陸維忠等，2001)。據美國估計，因此類毒素汙染所造成的直接經濟損失僅1991 1996年間就高達三億美元。我國、歐盟和美國、加拿大均要求麵粉、麵包、餅乾等食品中DON毒素的限量標準為1000 μ g/kg(Ippm) (Buerstmayr等，2009 ;GB 163四_1996)。因此，明確我國小麥赤黴病致病菌的種類與產毒類型，對開展小麥赤黴病防治與抗病育種都有重要的實踐意義。自20世紀40年代中國首次報導小麥赤黴病以來，國內外研究認為，禾穀鐮刀菌 (Fusarium graminearum Schwabe)是小麥赤黴病的主要致病菌之一，也是中國小麥赤黴病的優勢致病菌。近年來的研究表明，F. graminearum是一個含有許多特定種系的複合種 (Fg Complex)，0』 Donnell通過系統發生學分析，將FgComplex劃分成13個特定的正式命名的種。根據該項研究結果，目前中國小麥赤黴病的主要致病菌為禾穀鐮刀菌(Fusarium graminearum)和亞細亞鐮刀菌(Fusariumasiaticum)。其中亞細亞鐮刀菌在長江中下遊麥區、南方麥區和西南麥區均為優勢致病菌，並且不斷向黃淮麥區、北方麥區遷移(aiang， 2010)。研究還表明，產生3AD0N毒素的亞細亞鐮刀菌群日益擴展，並具有更強的致病力，危害性更大(aiang，2oio)。因此，快速、準確鑑定檢測亞細亞鐮刀菌，有利於針對性地加強對小麥赤黴病的防治。傳統的鐮刀菌鑑定方法主要通過形態學，如大分子生孢子、小分生孢子、原膜孢子等的形態來鑑定。但形態學鑑定方法繁瑣，沒有統一的規範標準，並且需要豐富的實踐經驗。隨著遺傳與分子生物學技術的迅速發展，營養體親合群(Vegetative compatibility group VCG)，分子標記也成為鑑定鐮刀菌的主要技術手段。與常規的形態鑑定法相比，分子標記能準確、快速地從混合群體中鑑定出不同病菌類型，為準確、快速分析病菌的群體分布、特點和鑑定診斷提供新方法。
Nicholson等(1998)找到了一對鑑定禾穀鐮刀菌Fg Complex的標記Fgl6F/R，但在擴增來自不同地區的禾穀鐮刀菌株時得到6種PCR產物，不能有效地區分菌株的種類。 Qu等Q008)利用該對引物，並結合AFLP標記，鑑定出Fgl6F/R擴增類型5和AFLP擴增類型B的菌株為亞細亞鐮刀菌。由於AFLP標記操作繁瑣，且涉及到酶切和兩次PCR擴增等步驟，難以在實際檢測中推廣應用。Yang等O008)利用氨連接酶基因的單核苷酸多態性 (SNP)設計了 4個引物試圖來區分Fg complex中的七個種，其中鑑定亞細亞鐮刀菌需要擴增出536bp、388bp、311bp、162bp等4條不同大小的條帶，並且還需要通過條帶的強弱進行輔助判斷，並不能真正滿足快速簡易檢測的要求。目前，一種針對所有亞細亞鐮刀菌具有特異性的引物，未見報導。

發明內容
本發明的目的在於針對目前對亞細亞鐮刀菌的鑑定方法過於複雜，或只能針對個別亞細亞鐮刀菌，在預防亞細亞鐮刀菌對農作物和飼料汙染，以及在鑑別病原菌等一系列實際應用中存在明顯的局限性的實際問題，提供一種由新的特異性引物組成的針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法及其應用。本發明的目的是這樣實現的一種針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法，是利用對亞細亞鐮刀菌的一對特異性引物對樣本提取的DNA進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳凝膠成像分析，其特徵在於所述的一對特異性引物為上遊引物SEQ ID NO. 1和下遊引物 SEQ ID N0. 2;對PCR擴增產物進行電泳凝膠成像分析中，根據172bp處是否出現特異條帶來判斷樣本提取的DNA是否與亞細亞鐮刀菌相關；所述的一對特異性引物是基於亞細亞鐮刀菌相關序列擴增多態性SRAP標記， SRAP標記的序列為SEQ ID N0. 3，其大小為172bp0在本發明中DNA是通過改良CTAB法或改良SDS法從樣本中提取的。在本發明中所述樣本提取的DNA是指從農作物籽粒或飼料樣本中提取的農作物或飼料DNA。在本發明中所述的農作物是指麥類農作物。在本發明中所述樣本提取的DNA是指病原菌基因組樣本提取的DNA。在本發明中PCR擴增，反應體系 20yL，包括 DNA 10-20ng,2y L 10 X buffer, 1. 6μ L 2. 5mmol/L dNTP, 1. 2 μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5 μ mol/L 上遊及下遊引物各 2 μ L，1. 0 U Taq酶，ddH20補齊至20 μ L ；PCR擴增條件為第一循環95°C預變性5min ；然後95°C變性 45sec，60°C退火30sec，72°C延伸45sec，共；35個循環；最後一個循環為72°C延伸lOmin，擴增產物4°C保存。在本發明中所述的電泳是指在2%瓊脂糖凝膠中用IXTAE緩衝液中電泳 30min,電壓為4-5V/cm的條件下凝膠成像。一種上述檢測方法的應用，其特徵在於用於對亞細亞鐮刀菌的鑑別，或用於監控亞細亞鐮刀菌對農作物或飼料的汙染。在所述檢測方法的應用中所述的用於對亞細亞鐮刀菌的鑑別是指從病原菌基因組樣本中提取的DNA，當電泳後的凝膠成像中172bp處存在特異條帶，該病原菌為亞細亞鐮刀菌。
在所述檢測方法的應用中所述的用於亞細亞鐮刀菌對農作物汙染的監控是指 從農作物籽粒或飼料樣本中提取的農作物或飼料DNA ；當電泳後的凝膠成像中172bp處存在特異條帶，該農作物籽粒或飼料樣本已經被亞細亞鐮刀菌汙染。本發明的優點在於1. 一對特異性引物能夠針對目前所知的各中亞細亞鐮刀菌都能夠擴增一個特異性產物，對鑑定亞細亞鐮刀菌具有特殊的意義。2.採用一對引物進行 PCR擴增，操作步驟少，操作方法簡單；3. PCR擴增產物為一個特異性產物，不需要通過幾個產物或者多條條帶來鑑定菌株，利用本方法，能擴增出產物的即為亞細亞鐮刀菌，擴增不出的即為其他菌株，測定結果簡單明了 ；4.本方法所需的DNA量較少，10-20ng的DNA即可檢測到結果，以確保從麥穗、種子、飼料中檢測出亞細亞鐮刀菌。


圖1 對已知種型的菌株的PCR擴增鑑定結果，其中M 分子量標準50bp ； 1_5泳道為公知的亞細亞鐮刀菌株的DNA ；6-10泳道為公知的禾穀鐮刀菌株(非亞細亞鐮刀菌株) 的 DNA。圖2 對中國採集菌株的PCR擴增鑑定結果，其中M 分子量標準IOObp ； 1_20泳道為採集的鐮刀菌株樣本的DNA。圖3 對不同小麥產區麥粒受亞細亞鐮刀菌汙染的鑑定結果，其中M 分子量標準 IOObp ； 1-20泳道為小麥籽粒樣本的DNA。
具體實施例方式實施例1 根據已確定的42個亞細亞鐮刀菌和30個非亞細亞鐮刀菌，通過相關序列擴增多態性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)標記，對亞細亞鐮刀菌和非亞細亞鐮刀菌進行擴增和比對分析。所擴增出的SRAP標記是基於基因序列中內含子與外顯子的SRAP多態性標記，這種多態性標記往往代表的是基因之間的多態性(也就是差異)。我們從近400個標記中找到只在亞細亞鐮刀菌中能夠擴增，而在非亞細亞鐮刀菌中不能夠擴增的SRAP標記，SRAP標記的序列為SEQ ID NO. 3，其大小為172bp。通過對這個標記進行測序，並在NCBI的GeneBank裡進行比對，發現這是一個新的基因，只在亞細亞鐮刀菌中存在，目前在其他鐮刀菌的序列中都沒有找到同源序列。我們針對這個標記，重新進行了引物設計。設計針對亞細亞鐮刀菌的分子具有特異性的引物對(委託上海生工公司合成)上遊引物SEQ ID NO. 15' -TGAGTCCAAACCGGATAGCAAGGTA-3『，下遊引物SEQ ID NO. 25' -GACTGCGTACGAATTTGCACTTCCT-3『。對特異性引物的驗證已知菌株的來源亞細亞鐮刀菌株w316，w346, B156, B592, B755 (湖北省農業科學院植保土肥研究所喻大昭研究員提供)。禾穀鐮刀菌(非亞細亞鐮刀菌株)菌株Fg820，M101, M83，M129，G12(荷蘭國際植物研究所Lee博士提供)。對已知種型菌株的PCR擴增鑑定過程1.菌株DNA樣本的提取分別挑取各菌株的菌絲在PDA培養基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g， 蒸餾水1000ml)上，24°C培養3天，挑取新鮮菌絲用液氮凍幹並研磨粉碎，用改良CTAB法 (Zhang, 2004)提取 DNA。適量菌絲中加入 200 μ L CTAB 提取緩衝液(80mM Tris-HCl，117M NaCl, 16. 7mM EDTA, 16. 7mg/ml CTAB)，65°C溫浴 40min，加入 200 μ L 氯仿-異戊醇 Q4 1) 抽提液振蕩混勻，12000rpm離心5min，上清液加入120 μ L異丙醇沉澱DNA，ddH20溶解DNA。 取10-20ng DNA加入到PCR反應體系中。2. PCR擴增反應及擴增程序反應體系20 μ L，包括 DNA 10-20ng,2y L 10 X buffer, 1. 6μ L 2. 5mmol/L dNTP, 1. 2μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5 μ mol/L 上遊及下遊引物各 2 μ L，1. OU Taq 酶，ddH20 補齊至 20 μ L ；PCR擴增條件為第一循環95預變性5min ；然後95°C變性45sec，60°C退火30sec， 72°C延伸45sec，共35個循環；最後一個循環為72°C延伸lOmin，完成擴增，擴增產物4°C保存。3. PCR擴增產物的鑑定泳道分配M 分子量標準50bpw316, w346, B156, B592, B755 依次列入 1-5 泳道；Fg820, MlOl，M83, M129, G12 依次列入 6-10 泳道。取8yL PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中用1X TAE緩衝液電泳分析，電壓為 4-5V/cm,電泳分離30min，經溴化乙錠染色後用凝膠成像系統分析擴增產物的大小判斷結果，實驗結果見圖1。表1本發明所採用的已知種型的鐮刀菌菌株
權利要求
1.一種針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法，是利用對亞細亞鐮刀菌的一對特異性引物對樣本提取的DNA進行PCR擴增，再對擴增產物進行電泳凝膠成像分析，其特徵在於一對特異性引物為上遊引物SEQ ID NO. 1和下遊引物SEQ ID NO. 2 ；對PCR擴增產物進行電泳凝膠成像分析中，根據172bp處是否出現特異條帶來判斷樣本是否與亞細亞鐮刀菌相關；所述的一對特異性引物是基於亞細亞鐮刀菌相關序列擴增多態性SRAP標記，SRAP標記的序列為SEQ ID NO. 3，其大小為172bPo
2.根據權利要求1所述的針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法，其特徵在於DNA是通過改良CTAB法或改良SDS法從樣本中提取的。
3.根據權利要求1所述的針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法，其特徵在於所述樣本提取的DNA是指從農作物籽粒或飼料樣本中提取的農作物或飼料DNA。
4.根據權利要求3所述的針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法，其特徵在於所述的農作物是指麥類農作物。
5.根據權利要求1所述的針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法，其特徵在於所述樣本提取的DNA是指病原菌基因組樣本提取的DNA。
6.根據權利要求1 5之一所述的針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法，其特徵在於 PCR 擴增，反應體系 20 μ L，包括 DNA 10-20ng,2y L 10Xbuffer, 1. 6 μ L2. 5mmol/L dNTP, 1. 2μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5 μ mol/L 上遊及下遊引物各 2 μ L，1. OU Taq 酶，ddH20 補齊至 20 μ L ；PCR擴增條件為第一循環95°C預變性5min ；然後95°C變性45sec，6(TC退火30sec， 72°C延伸45sec，共35個循環；最後一個循環為72°C延伸lOmin，擴增產物4°C保存。
7.根據權利要求6所述的針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法，其特徵在於所述的電泳是指在2%瓊脂糖凝膠中用IXTAE緩衝液電泳30min，電壓為4-5V/cm的條件下凝膠成像。
8.—種如權利要求1所述檢測方法的應用，其特徵在於用於對亞細亞鐮刀菌的鑑別， 或用於監控亞細亞鐮刀菌對農作物或飼料的汙染。
9.根據權利要求8所述檢測方法的應用，其特徵在於所述的用於對亞細亞鐮刀菌的鑑別是指從病原菌基因組樣本中提取的DNA，當電泳後的凝膠成像中172bp處存在特異條帶，該病原菌為亞細亞鐮刀菌。
10.根據權利要求8所述檢測方法的應用，其特徵在於所述的用於亞細亞鐮刀菌對農作物汙染的監控是指從農作物籽粒或飼料樣本中提取的農作物或飼料DNA，當電泳後的凝膠成像中172bp處存在特異條帶，該農作物籽粒或飼料樣本已經被亞細亞鐮刀菌汙染。
全文摘要
本發明涉及一種針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法和應用，是利用對亞細亞鐮刀菌的一對特異性引物對樣本提取的DNA進行PCR擴增，再對擴增產物進行電泳凝膠成像分析，其中所述的一對特異性引物為上遊引物SEQ ID NO.1和下遊引物SEQ ID NO.2；對PCR擴增產物進行電泳凝膠成像分析中，根據172bp處是否出現特異條帶來判斷樣本是否與亞細亞鐮刀菌相關；所述的一對特異性引物是基於亞細亞鐮刀菌相關序列擴增多態性SRAP標記，SRAP標記的序列為SEQ ID NO.3，其大小為172bp。本發明可以用於對亞細亞鐮刀菌的鑑別，或用於監控亞細亞鐮刀菌對農作物或飼料的汙染。
文檔編號C12Q1/04GK102559873SQ20111042214
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者餘桂紅, 周永進, 孫曉波, 張旭, 王磊, 邢錦城, 馬鴻翔 申請人:江蘇省農業科學院