乳清脫輔基蛋白在預防或治療微生物或病毒感染中的用途的製作方法

2023-06-26 21:29:46 1

專利名稱：乳清脫輔基蛋白在預防或治療微生物或病毒感染中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及乳汁脫輔基蛋白在預防或治療微生物或病毒對人體或動物體的感染的用途。更具體而言，這些乳汁脫輔基蛋白可以單獨使用，或者與一種或多種短鏈有機酸(例如檸檬酸)和它們的鹽或酯，和/或一種或多種游離脂肪酸和它們的單酯結合使用，來抑制潛在病原體的粘附和/或生長。
背景技術：
乳汁(milk)是一種略帶白色的液體，由生育後的成熟雌性哺乳動物的乳腺產生。哺乳動物是屬哺乳綱的溫血脊椎動物，包括人類。就本發明的目的而言，更優選的哺乳動物是指有蹄的、屬反芻動物亞目的偶蹄類動物，例如牛、綿羊、山羊、鹿和長頸鹿。本發明中，來自牛和山羊的乳汁是乳汁脫輔基蛋白的優選來源，這僅僅是因為這些來源的乳汁在商品規模上較易獲得。
乳清是在奶製品工業中常用的一個詞彙，用來描述懸浮有酪蛋白微團(micelles)和乳脂微滴(globules)的澄清液體基質。來自反芻動物的乳清含有乳糖；包括乳汁抗體、乳鐵傳遞蛋白和酶類在內的多種蛋白；以及包括β-乳球蛋白在內的多種脂蛋白。乳清是乳汁脫輔基蛋白的優選來源。
奶製品工業中，母牛的乳汁被加工以獲得奶油或者奶酪兩者中的一種。機械攪拌用於破碎乳脂微滴獲得奶油，酪蛋白沉澱為凝乳，後者被進一步生產為奶酪。經過這些步驟後所剩餘的殘留液體通常稱為乳漿(milk whey)。乳漿基本上就是乳清，只是脂蛋白的含量稍高，而脂蛋白主要來自於脂肪微滴膜。乳漿是乳汁脫輔基蛋白的優選來源。在這裡，「乳清脫輔基蛋白」這個詞意指來自於乳清或乳漿的乳汁脫輔基蛋白。
乳清中含有多種不同的脂蛋白和糖蛋白，它們的特徵在於都含有一個蛋白骨架，脂類和/或碳水化合物結合在蛋白骨架上。酶水解作用可去除蛋白骨架上的脂類和/或碳水化合物，以製備相應的脫輔基蛋白。儘管乳清脫輔基蛋白已經被分離出來，但是這類乳清脫輔基蛋白的醫學用途仍然未知。
脂類或脂肪，包括相同或不同的脂肪酸和甘油的三酯，也被稱為三醯基甘油或甘油三酸酯。進一步水解可以斷裂這些酯鍵，進而從三醯基甘油中釋放出遊離脂肪酸。Cynthia Q Sun等人報導，使用小牛胃脂肪酶原從乳脂中釋放游離脂肪酸(Chemico-Biological Interactions140(2002)，pp185-198)。該作者報導了各種游離脂肪酸對腸道球菌和大腸菌群(coliform bacteria)的生長抑制特性，腸道球菌是一種革蘭氏陽性的，大腸菌群是革蘭氏陰性菌，但它在乳清脫輔基蛋白作用方面是靜息的。
已知游離脂肪酸顯示出有效的抗微生物和抗病毒的活性。特別地，Schuster等人報導，亞油酸、亞麻酸、辛酸和己酸可以抑制齲齒生物體-變異鏈球菌，並可全面減少齒菌斑(牙科藥理學與治療(Pharmacology and Therapeutics in Dentistry)5pp25-33；1980)。作者指出，革蘭氏陰性菌最為敏感，而革蘭氏陽性菌受影響最小。另外，Halldor Thormar等人(抗微生物藥劑與化學療法(Antimicrobial Agentsand Chemotherapy)；11987，pp27-31)綜述了游離脂肪酸和其單酯的抗病毒特性，顯示出多聚不飽和長鏈脂肪酸和中等鏈長的飽和脂肪酸(和它們的甘油一酸酯)具有抗衣殼病毒的功效，以及它們對於無衣殼病毒的相對惰性，這種殺病毒劑的效果可能是通過病毒衣殼自身的去穩定來達到的。最近，R.Corinne Sprong等人(抗微生物藥劑與化學療法(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)，42001，pp1298-1301)綜述了游離脂肪酸的殺菌活性，發現C10:0和C12:0的脂肪酸是有效的殺菌劑。Gudmundur Bergsson等人描述了C10:0和C12:0游離脂肪酸和它們的甘油一酸酯具有殺真菌的特性(抗微生物藥劑與化學療法(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)，112001，pp3209-3212)。
許多潛在的病原細菌通常是皮膚、毛髮和黏膜的共生生物，它們通過粘附在上皮細胞層的表面來拓殖(colonise)這些區域，但是正常情況下它們被存在於黏膜和汗液中的宿主分泌免疫系統所抑制。這些內源菌所引發的疾病的產生是宿主分泌免疫能力降低的結果，由於免疫能力的降低使得這些內源病原體發生增殖。
通常認為病原菌粘附在宿主組織上是發病的第一個階段，因此阻斷粘附的能力可以有效地防止感染。這種粘附的機制各不相同，許多生物體採用既有特異的又有非特異的因素在內的多種形式。例如，葡萄球菌分泌一種細胞外磷壁酸質，它可以特異結合纖連蛋白；假絲酵母採用一種甘露蛋白糖萼；鏈球菌使用水不溶性的葡聚糖來拓殖牙齒。因為這些因素的多樣性，很久以來人們都認為設計一種可以有效抑制廣範的潛在病原物種的單一抑制劑是不可能的。
很多情況下，已經開始嘗試使用接種一些供體動物而得到的抗體，但是由於抗體固有的特異性，使得這些抗體的治療應用被限制在只能針對產生這些抗體的物種中。
在上文所有已發表的資料中，揭示了使用游離脂肪酸來抑制廣譜的細菌、真菌和病毒的生長，但是還沒有已知的已發表的資料揭示或者提示，在人體和動物體保健中，當游離脂肪酸與一種或多種乳汁脫輔基蛋白結合用藥時，它們具有抑制潛在病原體的粘附和/或生長的功效。
在醫學和獸醫學的感染護理中，常用的措施是運用有針對性的抗生素物質來抑制感染原，感染原可以是真菌、細菌(二者都包含在「微生物」一詞中)或病毒。在長期使用過程中，由於感染原抗藥性的進化，使得許多抗生素物質失去了藥力。術後情況下，抗生素抗性的問題最為尖銳，因為此時感染原是皮膚和呼吸道的常見習居菌，如此一來，感染原可能長時間地暴露在常用的各種抗生素中，從而對這些物質逐漸產生抗性。在外科手術或監護過程中，大量的這些平時無害的感染原可能到處散布，當患者的免疫耐受性由於疾病或長期的醫療幹預減弱的時候，就會產生感染；這種感染經常被稱為醫院感染。
一個這種醫院感染的例子通常稱為MRSA(甲氧苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌)。金黃色葡萄球菌是一種存在於許多個體的呼吸道中的常見習居菌，正常情況下它只是無症狀地棲息於呼吸道中而不會導致感染。由於它的這種普遍存在的特性，據認為它曾暴露於許多常用的抗生素物質，現存的株系可以抗包括甲氧苯青黴素在內的所有常用抗生素。萬古黴素是在MRSA症中萬古黴素是「最後求助的藥物」，但最近已出現了抗萬古黴素的株系。而且，萬古黴素抗性的糞便腸球菌(VREF)是消化道的常見習居菌，可在外科手術過程中從腸道中散布出去，從而產生其他的醫院感染。
水平的基因轉移(horizontal gene transfer)是一個生物學詞彙，用於描述遺傳抗性從一個物種向另一物種的潛在轉移。抗生素抗性從諸如VREF的物種，向病原物種例如難辨梭菌(偽膜狀結腸炎)的轉移就是潛在的災難性事件，也是引起醫學行業極大關注的事件。
因此，急需新的抗微生物物質，用於治療這種抗生素抗性感染和其他一些傳統療法無法治療的感染，同時也急需新的抗病毒物質，用於治療那些目前幾乎還沒有有效治療方法的病毒感染。
本發明的一個目的是延緩病原生物體的粘附，優選地阻斷病原生物體的粘附，因而預防或治療人體或動物體的微生物或病毒感染。
本發明進一步的目的是，將延緩或阻斷病原生物體的粘附與抑制其生長結合起來，從而達到更高的效用。
本發明另一個進一步的目的是，通過使用良性物質例如乳清來達到這些效用，但並不只限於乳清，因為相比那些需要謹慎使用的攻擊性的化學藥物，良性物質更加有利於經常性地使用。

發明內容
在第一個實施方案中，本發明涉及使用至少一種乳汁脫輔基蛋白來預防或治療由微生物或病毒引起的人體或動物體的感染。據信這是通過抑制潛在病原物種的粘附來起作用的，但我們不希望束縛於此。尤其是，乳清蛋白骨架(準確地應稱為乳清脫輔基蛋白，它是將結合的脂類和/或碳水化合物從乳汁脂蛋白和乳汁糖蛋白中去除後所殘留的物質)對潛在病原體對人類上皮細胞的粘附顯示出強有力的、廣譜的抑制作用，這一點將在下文中給出例示。當用乳清作為來源，除去其結合的脂肪酸和/或碳水化合物部分，剩餘的脫輔基蛋白是兩性蛋白，可以抑制細菌或其他病原生物體對宿主細胞表面的粘附，因此防止疾病發生的第一個階段。兩性蛋白帶有一個疏水的(脂溶性)末端和一個親水的(水溶性)末端。許多微生物的細胞表面具有一個脂類或糖-脂分子層，兩性蛋白的疏水端可被其吸引。通過這種方式，來自乳清的脫輔基蛋白包被了病原生物體的表面，設立了一個天然的分子屏障，這個分子屏障可以防止病原生物體(例如真菌、細菌或病毒顆粒)足夠接近宿主表面從而建立粘附。
優選地，上述的乳汁脫輔基蛋白與游離脂肪酸或它們的單酯(包括甘油一酸酯)結合使用。眾所周知，游離脂肪酸和它們的甘油一酸酯是強有力的、廣譜的抗微生物和抗病毒製劑，可以抑制微生物和病毒的生長。因此，至少一種乳汁脫輔基蛋白和至少一種游離脂肪酸或它的單酯同時或順序地(任意順序均可)用藥，可以抑制廣譜的微生物和病毒物種的生長以及粘附。通過水解乳清或乳漿得到的製劑同時包含乳汁脫輔基蛋白和游離脂肪酸。
作為選擇，上述的乳汁脫輔基蛋白可與短鏈有機酸或它們的酯或鹽結合使用。因此，至少一種乳汁脫輔基蛋白和至少一種短鏈有機酸或它的酯或鹽同時或順序地(任意順序均可)用藥，可以抑制廣譜的微生物和病毒物種的生長以及粘附。
更加優選地是，上述的乳汁脫輔基蛋白可與游離脂肪酸和它們的單酯，以及短鏈有機酸和它們的鹽和酯結合使用。因此，至少一種乳汁脫輔基蛋白；至少一種游離脂肪酸或它的單酯；和至少一種短鏈有機酸或它的酯或鹽同時或順序地(任意順序均可)用藥，可以抑制廣譜的微生物和病毒物種的生長以及粘附。包含所有這三種成分的製劑可以通過水解乳清或乳漿製備。
在本發明中，使用至少一種乳清脫輔基蛋白或它的混合物，任選地與至少一種游離脂肪酸或它的單酯或它的混合物，和/或任選地與至少一種短鏈有機酸或它的鹽或酯或它們的混合物結合使用，在治療胃腸道和口咽道、黏膜上皮細胞和皮膚的抗生素抗性感染中是有效的。
雖然來自諸如MRSA和VREF的生物體的感染，以及許多病毒感染嚴重威脅著人類的健康，但是有一些表面上危害性較小的病原體，它們是常見的機體的共生物，長期而言它們又可能引發不適或者疾病。一個範例就是由變異鏈球菌引起的齲齒的產生。通常認為齲齒是一種美容的問題，牙科行業也的確是如此對待齲齒問題的。然而有證據提示，口腔中變異鏈球菌的拓殖可能產生抗體，這些抗體在全身的循環中可能與心臟組織產生交叉反應，引起長期的心臟疾病以及對其他器官的自免疫損傷。
本發明中，使用乳清脫輔基蛋白可以抑制變異鏈球菌的粘附，因而提供了一種可以有效預防齲齒並對由此對長期健康有益的添加劑(adjunct)。
白色假絲酵母是一種在很多個體中不顯示症狀的常見的皮膚和黏膜習居菌。假絲酵母拓殖黏膜，通過先粘附在黏膜上皮細胞的表面，從這裡增殖然後滲透到細胞腔(lumen)內導致黴菌性口炎。從這些組織分泌的粘液的成分通常可以抑制粘附和增殖；在某些個體中，正常的分泌功能減弱，致病過程從而建立起來。在那些容易復發黴菌性口炎的個體中，使用乳清脫輔基蛋白(粘附抑制)和游離脂肪酸或它們的單酯和/或有機酸或它們的鹽或酯(均為生長抑制)將提供適當的預防作用。
常規的抗生素對病毒感染無效。雖然特殊的抗病毒藥劑比如「無環鳥苷」是能得到的，例如用於治療單純皰疹，但是總的說來，這些藥劑價格昂貴而且僅限於非常有限範圍的病毒感染。儘管許多病毒感染具有全身效應，可是有些感染則表現出皮膚皮疹、水皰和潰瘍的局部症狀，這種局部症狀經常會導致患者嚴重的不適感。局部使用包含乳清脫輔基蛋白和游離脂肪酸及其單酯的製劑，將會提供局部的抗病毒活性，當這種局部的活性做為全身性抗病毒治療的輔助手段時，將會減輕外部的症狀。
「Famvir」是無環鳥苷(Smith Kline Beecham)的專賣製劑，它被設計為一種全身性抗病毒藥劑，口服治療水痘帶狀皰疹(帶狀皰疹)的繼發感染。原發性感染中，水痘病毒會導致水痘產生，並伴有大範圍的皮膚發疹，充滿膿液的庖囊破裂然後結疤。該感染會導致強烈的癢感，當用指甲搔刮時，傷口會留下大片的疤痕。痊癒後病毒可以保持休眠多年，還可能被環境壓力或免疫應答情況再次激活，稱為繼發感染。繼發感染即帶狀皰疹，其特徵為劇痛的皮膚皮疹。使用本文描述的包含乳清脫輔基蛋白和游離脂肪酸及其單酯的局部製劑，將會減輕皮膚上的表面症狀，是常規抗病毒療法的有效輔助手段。相同地，其它造成淺層(皮膚)範圍的感染，如風疹(麻疹)和皰疹(感冒瘡)，也是局部用藥適宜的臨床指徵。
下文中描述的標準製劑是水解的乳清或乳漿，預期濃度範圍為0.5-25mg/ml時，它可以有效抵抗病原生物體。當然可以理解的是，所需標準製劑的濃度將依賴於所遇到的病原生物體的數量以及它們的相對濃度。相同地，脫輔基蛋白的期望濃度範圍；游離脂肪酸的期望濃度範圍以及有機酸的期望濃度範圍也將依賴於所遇到的病原生物體的數量和它們的相對濃度。
游離脂肪酸游離脂肪酸是一種有機酸，包括一個烴鏈，其上至少有一個羧酸官能團，後者通常位於末端，儘管這並不是必須的。脂肪酸既可以是飽和的，即烴鏈上所有的碳碳鍵都是單鍵，也可以是不飽和的，即烴鏈上至少有一個碳碳雙鍵或三鍵。優選的游離脂肪酸或它們的單酯是天然存在的，或者，是由天然存在的來源釋放(例如水解)的游離脂肪酸或其單酯，天然存在的來源例如乳清、蛋黃和植物油，但不僅限於這些。
優選地，有效的抗微生物和抗病毒的游離脂肪酸是飽和的或者不飽和的，包括含有偶數碳原子(C4-24)的烴鏈，或其混合物。
適宜的不飽和游離脂肪酸為含C14-24的烴鏈，優選地選自棕櫚油酸(C16:1)、油酸(C18:1)、亞油酸(C18:2)、α和γ亞麻酸(C18:3)、花生四烯酸(C20:4)、二十碳五烯酸(C20:5)和二十四碳烯酸(C24:1)，其中括弧內的數字代表烴鏈中碳原子的數目，冒號後雙鍵(或三鍵)的數目代表不飽和程度。
適宜的飽和脂肪酸為含C4-C18的烴鏈，優選地選自丁酸或異丁酸(C4:0)、琥珀酸(C4:0)、己酸(C6:0)，己二酸(C6:0)、辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)、月桂酸(C12:0)、豆蔻酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)，它們可以有效地抗真菌和革蘭氏陰性菌、大腸菌群和葡萄球菌。
應當理解，游離脂肪酸或它們的單酯，無論是否天然存在，可以通過化學取代來修飾，這些化學取代包括但不僅限於短鏈烷基化，例如甲基化或乙醯化；酯化作用；和許多其它衍生方法以修飾其抗微生物的效力，這種修飾後的游離脂肪酸也構成本發明的一部分。然而為了本發明的目的，優選地使用天然存在的、未經修飾的游離脂肪酸或其混合物或它們的單酯，優選它們的甘油一酸酯，例如由天然存在的脂肪貯存器所釋放的甘油一酸酯，天然存在的脂肪貯存器選自乳清、蛋黃和植物油。
乳清中脂類成分的水解提供了適宜的游離脂肪酸的混合物，由此可獲得對微生物和病毒生長的廣譜抑制作用，用於達到治療或預防的目的。下表給出了乳清脂類中脂肪酸成分的典型細目分類。
表1乳清脂類中的脂肪酸成分丁酸 (C4:0) 4％己酸 (C6:0) 2.1％辛酸 (C8:0) 1.2％癸酸 (C10:0) 2.6％月桂酸 (C12:0) 3.0％豆蔻酸 (C14:0) 10.6％棕櫚酸 (C16:0) 27％棕櫚油酸 (C16:1) 2.3％硬脂酸 (C18:0) 12.8％油酸 (C18:1) 26％亞油酸 (C18:2) 2.3％亞麻酸 (C18:3) 1.6％水 平衡至100％有機酸適宜的有機酸，如果製劑中存在的話，包括一個短烴鏈(例如C2-6)，其上至少有一個羧酸官能團。「酸」這個詞包括它們的鹽或酯。烴鏈可以是飽和或者不飽和的，直鏈或者帶有支鏈的，被取代或者未被取代的。適宜的有機酸包括乙醇酸、草酸、乳酸、甘油酸、羥基丙二酸、羥基丁二酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、丙二酸、戊二酸、丙烯酸、順或反式丁烯酸和檸檬酸。有機酸當中檸檬酸是優選的，它是帶有三個羧酸部分的三碳烴鏈。檸檬酸是在哺乳動物碳水化合物的代謝過程中產生的，它是一種弱有機酸，可以被鹼性溶液(如氫氧化鈉)所中和，產生鈉鹽-檸檬酸鈉。它以這種鹽的形式，低濃度地天然存在於機體內。如本發明中所示並要求保護的，當如上文所述在乳清脫輔基蛋白中加入檸檬酸鈉時，對於特定細菌的體外培養物而言，脂肪酸的效用得到增強。
抗微生物和抗病毒效用由於單獨使用乳清脫輔基蛋白達到的粘附抑制所具有的多特異性特性，或者由於使用乳清脫輔基蛋白結合游離脂肪酸和/或有機酸達到的粘附抑制和生長抑制所具有的多特異性特性，所針對的潛在病原體的範圍非常廣泛。
主要的革蘭氏陽性細菌包括鏈球菌、乳酸菌、棒狀桿菌、丙酸桿菌、放射菌、梭菌、桿菌和腸球菌。
革蘭氏陰性細菌中包括葡萄球菌、腸細菌、埃希氏菌、沙門氏菌和志賀菌，衣原體也是敏感的。
真菌中，除包括毛癬菌屬在內的皮膚真菌之外，白色假絲酵母已顯示也是敏感菌。
原生動物中有顯著敏感性的包括內變形蟲、賈弟鞭毛蟲和新型似隱孢菌。
「微生物」一詞包含細菌、真菌和原生動物。
主要的衣殼病毒顆粒包括，皰疹病毒(單純皰疹病毒、水痘帶狀皰疹和埃-巴二氏病毒)；痘病毒(正痘病毒和禽痘病毒)；囊膜病毒(甲病毒、黃病毒、風疹病毒和瘟病毒)；冠狀病毒(支氣管炎病毒)；反轉錄病毒(人類T細胞白血病和人類免疫缺陷病毒)；流感病毒，狂犬病毒，加利福尼亞腦炎病毒，拉沙病毒，副粘病毒，肺病毒和麻疹病毒。
藥物學和美容學上可接受的給藥系統藥物學上可接受的給藥系統包含藥物學或美容學上有效劑量的、至少一種乳清脫輔基蛋白單獨用藥，或者與藥物學或美容上有效劑量的、至少一種游離脂肪酸和它們的單酯和/或藥物學或美容上有效劑量的、至少一種有機酸和它們的酯或鹽的結合用藥，以達到臨床的療效。
藥膏提供了一種有效的給藥機制，以減輕病毒和細菌感染的皮膚表面症狀，這些症狀表現為皮膚皮疹、水泡和膿庖，其中包括皰疹、帶狀皰疹、痤瘡和感染性皮炎。
繃帶和創傷敷料可以被浸漬，以達到活性物質在患處的持續釋放。
特別地在甲氧苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌的例子中，為排除已知攜帶者的汙染，給藥系統可以包括鼻用噴霧劑。採用皮膚洗液形式的給藥系統可以排除皮膚和毛髮的局部汙染。
給藥系統可以包括滴眼液，用於治療或防止眼部的感染。
給藥系統可以包括陰道用的乳膏或凝膠，例如水合和潤滑的凝膠，或通常用於婦女保健的陰道藥栓，可以預防白色假絲酵母的復發感染，同時可以保護婦女不受外部細菌和病毒疾病的感染。
給藥系統可以包括外科術後的創傷敷料，在創傷敷料中活性製劑分散在一個可以持續釋放的多聚體中。該給藥系統可以將由MRSA和其它抗生素抗性細菌所引起的醫院感染降低到最小程度。
給藥系統還可以包括抗氧化劑賦形劑，可以通過非腸道用藥或IV輸注(IV infusion)的方式以達到全身性抗病毒和/或抗微生物的效果。
可選地或者另外地，給藥系統還可以包括奶狀飲料或食品，其中的活性製劑可進行腸溶性包被以利於其由胃向腸道的轉運，在腸道中活性製劑可以用做預防製劑，抵抗包括偽膜性腸炎在內的腸道感染。
給藥系統可以包括口服保健產品，例如口香糖、漱劑、牙膏和假牙粘合劑以及固定劑，以達到減輕齲齒和齒菌斑的效果，以及對齒齦炎、齒根骨膜炎和復發黴菌性口炎提供長期的保護。
給藥系統可以包括加工食品，其中活性製劑可預防微生物和/或病毒所引起的食物變質，以及預防由諸如沙門氏菌和彎曲菌生物體所引起的食物攜帶的疾病的可能性。
附圖簡述

圖1顯示四次分別進行的分子大小排阻色譜法的層析圖，分別標為A、B、C和D。
A)0小時，處理前在280nm波長Rt 7.174分鐘處有一個前導進行峰，其下330nm波長有一個峰。330nm的光吸收來自結合在大分子蛋白上的脂類部分，而這些大分子蛋白則構成了280nm的一級光吸收。
B)處理開始後2小時在7.174分鐘處的一級峰已經降解，同時伴有在Rt 9.7和10.6分鐘的兩個延遲進行級分的光吸收增加。330nm波長下的脂類級分已經降解，在兩個延遲進行峰處330nm的光吸收沒有可見的增加。
C)8小時顯示脂類級分進一步的降解，同時280nm下蛋白的兩個延遲進行峰沒有顯著的變化。
D)16小時持續保溫，280nm和330nm任一波長下未顯示總譜圖的改變。
圖2顯示採用白色假絲酵母對口腔上皮細胞的粘附，以衡量待測物質乳清在酶水解作用前、後的效用。「對照」代表當無抑制物質存在時，所達到的總粘附的平均值(36％)。水解前的乳清，當其濃度為1mg/ml和2mg/ml時，顯示約39％的對照粘附抑制(粘附值由36％下降為22％)。5mg/ml水解前的乳清可達到45％的粘附抑制。圖中還給出相同濃度的酶水解後乳清的效用。濃度為1mg/ml時有效性明顯比水解前的差，然而濃度為2mg/ml時，抑制作用為62％(相比水解前的39％)，而當濃度為5mg/ml時，相比水解前的45％，抑制作用達到100％。
圖3顯示單獨採用標準製劑中的脂類和蛋白級分對假絲酵母粘附抑制的比較。「對照」粘附為45％。1mg/ml蛋白級分顯示19％粘附(即抑制58％)，濃度為2mg/ml時，粘附下降為3％即抑制94％，而當濃度為5mg/ml時，粘附全部阻斷。比較而言，脂類級分在任一濃度時均沒有可見的粘附抑制效果。
圖4顯示，採用圖3所述的相同的脂類和蛋白級分，濃度分別為10、8和6mg/ml的脂類級分對於白色假絲酵母生長抑制特性的比較。脂類級分濃度增加時，其生長抑制特性呈累進式增加，當濃度為10mg/ml時，酵母培養物光密度降低，有可見的破壞。
圖5顯示上述圖3的蛋白級分對白色假絲酵母生長的效果。在檢測的各濃度下，蛋白級分沒有產生明顯的生長抑制。
圖6顯示濃度為0、1和5mg/ml時，標準製劑對假絲酵母的生長抑制特性，最高濃度下達到90％抑制。
圖7顯示幹涉(intervention)生長分析，其中在白色假絲酵母正常生長5小時後加入抑制物質。抑制物質濃度為8和6mg/ml時，加入後抑制作用立刻很明顯。濃度較低時效果較緩慢，但是濃度為4mg/ml時，整體的抑制作用仍是有效的，濃度為2mg/ml時，仍有一些明顯的抑制作用。
圖8顯示濃度為1，2和5mg/ml時，標準製劑對假絲酵母的粘附抑制特性，其中酵母已暴露在待測物質中預處理10分鐘，然後再暴露於口腔上皮細胞。1mg/ml標準製劑的粘附抑制為53％，而當濃度為2和5mg/ml時，沒有粘附發生。本例中蛋白空白為1mg/ml小牛血清白蛋白，僅顯示13％粘附抑制(相對於標準製劑的53％)。
圖9顯示採用上述圖8中同樣的標準製劑預處理口腔上皮細胞10分鐘，然後暴露於假絲酵母培養物中。1mg/ml標準製劑的粘附抑制為55％，而當濃度為2和5mg/ml時，粘附全部抑制。本例中蛋白空白為1mg/ml脫卵清的蛋白，顯示12％粘附抑制。
圖10顯示相對磷酸鹽緩衝液(PBS)空白對照，標準製劑對甲氧苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌的生長抑制約為50％。當在標準製劑中補充加入2、4和5mg/ml檸檬酸鈉，較高濃度時生長逐漸被完全抑制。
圖11顯示相對檸檬酸鈉和BSA，標準製劑對MRSA對口腔上皮細胞的粘附抑制特性。5mg/ml標準製劑達到98％的粘附抑制，而相同濃度的檸檬酸鈉的粘附抑制約為10％，蛋白空白則沒有效果。
圖12顯示在文中所述的檢測條件下，引發齲齒的變異鏈球菌生物體的生長可被5mg/ml標準製劑抑制。
圖13顯示變異鏈球菌粘附於羥基磷灰石小珠，羥基磷灰石小珠在這裡做為牙釉質的替代物。在檢測條件下，0.8mg/ml標準製劑可達到約100％的粘附抑制。0.8mg/ml檸檬酸鈉影響該生物體的粘附約為10％，而在這些檢測條件下，小牛血清白蛋白作為蛋白空白可達到約30％的抑制。
方法和材料乳清蛋白可從新鮮的全奶中提取，優選地從反芻動物的新鮮的全奶中提取，提取的方法包括首先採用離心分離奶油和脂肪。然後將上清酸化至pH4.5，此pH值下酪蛋白沉澱。進一步離心將產生包含乳糖、乳清蛋白和溶解的礦物質的清澈上清。乳糖代表乳清固相的基本成分(可高達50％)，然後通過透析或超濾除去。結果「富含結合蛋白的」級分大約包含如下所示組分(v/v)β-乳球蛋白 56％α-乳白蛋白 11％γ-球蛋白 12％清蛋白6％乳鐵傳遞蛋白 4％粘蛋白2％酶類 1％微量蛋白 1％蛋白結合脂類(脂肪)7％這些蛋白中許多是複合脂蛋白或糖蛋白，並有基本的非蛋白大分子結合在其上，但是來自反芻哺乳動物的乳漿中的主要蛋白成分是β-乳球蛋白，它代表了最高達70％的乳漿和90％的初乳(分娩後首次泌乳)。β-乳球蛋白是一種脂蛋白，並有大量的異戊烯化合物即視黃醇結合在其上，但是脂類和脂肪酸構成了其非蛋白成分的基本部分。
乳清蛋白的一個可供選擇的方便來源是奶製品工業的乳漿粉末，它可從許多不同的來源獲得商業化的商品。很多情況下，商品供應者已經除去乳糖成分，提供脂肪含量為6-10％的」富含結合蛋白的」物質，這種物質是本發明的優選來源物質。儘管一些商品供應者採用超高溫(UHT)技術來增加液態乳漿的儲藏期限，但是這種處理會使蛋白骨架變性，從而使其無法用於本發明所述的目的。當為本發明所述的酶水解作用而重新構成乳漿粉末時(在純水中(通過反向滲透純化的水))，若脂肪含量低於6％，可以通過向中添加乳脂來得到補充。
標準化的低乳糖乳漿粉末的適宜商品來源是「Carbelac80」，它是一種乳漿蛋白，濃縮自Carbery奶製品(Ballineen，County Cork，愛爾蘭)。
生長抑制分析各種細菌或酵母的生長抑制可以通過以下方法得到示範，在含有或不含有待測物質的適宜介質中生長細菌或酵母生物體，待測物質為諸如乳清脫輔基蛋白、游離脂肪酸/單酯和/或有機酸/鹽/酯；構建適宜的附帶介質空白和對照的測試通式。採用微量滴定平板分析來增加測試點的數量，採用光密度決定法來測量生長。
為了確保加入不同濃度的待測物質時不會引入稀釋效果，測試溶液的製備方法，是在該細菌或酵母的適宜新鮮生長介質中溶解或懸浮合適量的待測物質。代表性地，測試溶液由濃度為20mg/ml的儲液製備而來，而該儲液的製備方法，舉例來說，是在終體積為10ml的新鮮生長介質中溶解200mg待測物質。然後儲液於6000rpm離心10分鐘以除去懸浮的固體。再於無菌條件下以適當體積的儲液和新鮮培養介質混合來稀釋儲液，舉例來說，達到10、8、6、4、2mg/ml的測試濃度。
在本發明中，由例如20mg/ml儲液獲得10mg/ml測試液的稀釋步驟稱為1∶2稀釋，這意味著一倍體積的儲液以一倍體積的稀釋液稀釋，獲得兩倍體積的終體積。這裡將採用這一約定指代本發明中所有稀釋步驟。
製備好的溶液預熱至37℃。按要求在加入100μl製備好的接種物之前，迅速向每孔中加入100μl製備好的溶液。因此在測試孔中10mg/ml的測試濃度又進一步1∶2稀釋，所以「10mg/ml」實際上在測試孔中是5mg/ml。「Multiskan Ascent」配備自動的振搖循環，用於確保每個OD讀數前培養物是均勻分布的。
關於白色假絲酵母的生長抑制，採用「Nunc」96孔微量滴定平板(Nalge Nunc International，哥本哈根，丹麥)，它的每個孔可容納上述200μl的體積。測試點被重複測試四次。接種物由100μl新鮮長成的菌體或酵母組成，製備方法將在下文中描述。每孔中的終體積為200μl，由100μl適當稀釋的待測物質和100μl新鮮介質中的接種物組成。
接種後的平板置於「Multiskan Ascent」(LabSystems，赫爾辛基，芬蘭)中保溫的微量滴定平板讀數器上，37℃放置最多達18小時，這段時間中孔內光密度的改變在600nm每小時檢測一次。生長周期結束時，結果取四次測試的平均值，並做圖顯示變化值。
酵母白色假絲酵母12小時(過夜)培養物，培養基為添加5％(w/v)葡萄糖的Oxoid酵母基本培養基(Oxoid是商標)，37℃以新鮮培養基1∶10稀釋(一倍體積比十倍終體積)(v/v)，每孔加入100μl。
白色假絲酵母生長最適pH為4.0-4.5，這個pH範圍對它的多數致病過程也是最適的。上述生長分析可做如下修正，用50mM pH4.0的乳酸鈉緩衝液製備酵母基本培養基和測試溶液，以便更加準確地反應出體外的環境，標準製劑正是在這種體外環境中生效的。
類似的方法可用來檢測細菌(和真菌)的生長和生長抑制，包括相應的改性生長介質。舉例來說，在變異鏈球菌和金黃色葡萄球菌的情況中，生長介質為Oxoid心腦灌流液(Oxoid是商標)。
粘附分析粘附及其抑制的檢測要求選擇合適的底物，以及粘附(或未粘附)該底物的生物體的計數方法。大多數潛在病原生物體粘附於黏膜上皮細胞，代表性黏膜上皮細胞的一個方便來源是從面頰內側輕鬆地獲得。口腔上皮細胞(BEC’s)的獲得是使用木質舌頭壓器刮擦口腔黏膜，具體方法如下。
口腔上皮細胞的獲得標準木質舌頭壓器如口腔臨床檢查所用，包裹於錫紙中並經過高壓滅菌。含0.9％(w/v)氯化鈉的0.1M磷酸鉀溶液(即PBS)，將其pH調至6.8後，取5.0ml等分液置於無菌25ml樣品瓶中。然後用舌頭壓器刮擦志願者兩頰內側，將收集到的刮擦物轉移至PBS容器中。收集的樣品於1000rpm離心3分鐘以沉澱口腔上皮細胞，而細菌和其他口腔碎屑遺留在懸液中。緩緩倒出這些試管中的上清，再加入5ml新鮮無菌PBS，重懸並且重新離心口腔上皮細胞兩次，得到「洗過的細胞」。
有許多不同的方法可用來計數細菌和酵母，它們都為本領域的技術人員所熟知，這些方法包括各種平板計數、直接顯微計數、放射-閃爍標記和螢光標記。任何有效的計數方法都是適宜的，假設該方法不會干擾生物體對所選定的底物的粘附能力。
在下文給出的例子中，選擇直接顯微計數法來計數假絲酵母，螢光標記法計數細菌。然而更加重要的是，標準群體中未發生粘附的酵母和細菌也被計數了，這與致力於計數粘附細胞是顯著不同的，因為底物通常幹擾未發生粘附的酵母和細菌的計數。
該技術的基礎包括將標準化(已知)數量的酵母或細菌暴露於標準化的底物中(口腔上皮細胞的數量)，給予60分鐘保溫時間使細胞發生粘附，然後將混合群體過濾通過10μm的尼龍網膜。網膜會截留口腔上皮細胞和那些粘附於其上的酵母或細菌，未發生粘附的酵母或細菌將衝洗通過網膜，在濾出液中它們可以被計數，並以原初未粘附群體的百分比來表示；發生粘附的酵母或細菌的百分比與之相反(inverse)。
酵母和口腔上皮細胞的直接顯微計數是採用帶有刻度的血球計數載玻片來進行的，該法為本領域的技術人員所熟知。
細菌的螢光標記是在粘附後進行的(標記濾出液中的那些細胞)，採用諸如BCECF/AM(Calbiochem Biosciences Inc.，La Jolla，加州)和Syto 13(分子探針，俄勒岡州，美國)螢光染色劑。標記方法如染色劑廠商所述。螢光數量用螢光計(Fluroscan，Lab-System，赫爾辛基，芬蘭)來檢測，與存在的細菌數量有直接關係。
下面這個常用方法可用於檢測白色假絲酵母對口腔上皮細胞的粘附，以及檢測採用上述乳清脫輔基蛋白製劑後得到的粘附抑制。同一方法還適用於檢測金黃色葡萄球菌對口腔上皮細胞的粘附抑制，以及變異鏈球菌的粘附抑制，區別僅在於變異鏈球菌的底物是粉末狀的羥基磷灰石，這種羥基磷灰石可從Merck購得，用做牙釉質的替代物。
白色假絲酵母的新鮮臨床分離物是優選的，由於許多典型菌種在菌種收集過程中喪失了其致病力。如果無法得到臨床分離物，白色假絲酵母典型菌株ATCC 10231可用來獲得有代表性的結果(ATCC是指位於美國馬裡蘭州的美國典型培養物保藏中心)。
酵母常規培養於Oxoid麥芽抽提物瓊脂上(Oxoid是商標)。Oxoid酵母蛋白腖右旋葡萄糖抽提物流體用於液態培養物，這些培養物是從新鮮的瓊脂平板上接種而來，然後在37℃振蕩溫育10小時。10小時後，離心收穫酵母，並以無菌的、pH6.8的PBS清洗。
清洗過的口腔上皮細胞和新鮮長成的、清洗過的酵母細胞均進行顯微計數，調整濃度使得酵母約為1×105，口腔上皮細胞約為1×103。當兩種溶液以相同體積混合時，將產生每個口腔上皮細胞對100個酵母細胞的比例。
在檢測待測物質的各種不同濃度時，例如乳清脫輔基蛋白，待測物質以所需濃度加入到PBS(pH6.8)中做為酵母或口腔細胞二者中任一個的終懸液。典型的是採用濃度為5、2和1mg/ml待測物質，試驗用來測定該製劑對於粘附抑制的有效性，它是通過預對包被口腔上皮細胞或預包被酵母來達到粘附抑制的。在與兩種懸液中的另一種混合以開始粘附之前，僅給予10分鐘作為預包被的時間。該製劑顯示無論是預包被口腔上皮細胞或是預包被白色假絲酵母，都可以有效地抑制粘附。因此，通過在口腔上皮細胞表面或酵母表面中的任一方或兩者都形成一個保護性的分子屏障，可以達到更佳的抑制效用。尤其是，預包被的口腔上皮細胞會防止粘附的建立，而病原生物體的預包被，在酵母的例子中，可以防止一個已建立的群體向其它區域延伸。
相同體積的兩種溶液/懸液混合，輕柔振搖溫育60分鐘，然後將混合物濾過一個固定孔徑為10μm的尼龍網膜。濾出液中酵母的數量經顯微計數得到，並以原初群體的百分比表示。當使用高致病力的臨床分離物時，達到高達40％的粘附並不罕見。
實施例1乳清游離脂肪酸和乳清脫輔基蛋白的製備無乳糖的乳漿粉末(來自Carbery奶製品的Carbelac80)做為起始原料。Carbelac80是典型的100％乳漿，典型的Carbelac80中脫脂乳含量為0％，蛋白80％，水分5％，脂肪8％以及粉塵3％。該起始原料30g溶於pH6.8、終體積為1升的磷酸鹽緩衝液(PBS)。向其中加入各種酯酶(主要是脂酶，但也有澱粉酶和蛋白酶)的適當組合物1g，例如，「來自豬胰臟的二類酯酶粗提物」可從Sigma獲得。混合物於37℃溫育18小時；60℃熱處理10分鐘滅活酶；並噴霧乾燥。
其他適當的酯酶包括，但不僅限於，來自諾和諾德公司(哥本哈根，丹麥)的商品「Palatase」和「Novozyme」，用時兩種酶以50∶50(w/w)混合1g加入每30g無乳糖的乳漿中。
如圖1所示，脫輔基蛋白和游離脂肪酸/甘油一酸酯的形成過程可用色譜法監測。採用Sephacryl S-200凝膠過濾(分子大小排阻法)HPLC，並以PBS(pH6.8)做為洗脫緩衝液，會以精確的解析度顯示出酶水解過程中發生的主要事件。採用雙波長來監測洗脫液是有利的；在280nm顯示蛋白，而在330nm波長顯示結合在這些蛋白上的脂類/碳水化合物成分。Rt(保持時間)7.174分鐘處的前導進行峰(圖1A)代表大蛋白的早期洗脫物，在蛋白峰下可見脂類成分的一個峰。水解過程中(圖1B(2小時)和1C(8小時))，前導峰及它所結合的脂類/碳水化合物消失，同時伴有在9.7和10.6分鐘的兩個延遲進行級分的吸收值與濃度成比例的增加(280nm)，這些是小蛋白和來自前導峰的脫輔基蛋白。圖1D顯示持續水解作用(16小時)，未見雙波長中任一波長下峰對應Rt的進一步改變。
採用以上概述的過程，經酶的典型組合物處理過的無乳糖乳漿(或富含脫輔基蛋白和游離脂肪酸的組分)將由以下「典型製劑」組成。
成分 ％(v/v)β-乳球蛋白的脫輔基蛋白 25-35脂肪滴的脫輔基蛋白 5-15游離脂肪酸 15-25(見表1)殘留脂類(包括膽固醇) 5-15α-乳球蛋白的脫輔基蛋白 5-15γ-球蛋白的脫輔基蛋白6-10乳清(serum)白蛋白1-3α-生育酚2-6檸檬酸鈉 2-6磷酸鈉 1-3脫輔基蛋白的製備過程可以通過以下方法促進，加入表面活性劑例如膽汁鹽純化成分，膽酸鹽如膽汁酸，和/或加入適當的酶的輔因子如鈣鹽，和/或加入適當的緩衝液如檸檬酸鈉。在一些應用中，例如MRSA的生長抑制，殘留的檸檬酸鈉也可促進生長抑制的特性，但不能促進粘附抑制。游離脂肪酸和它們的單酯的穩定性可通過加入抗氧化劑來增強，如α-生育酚(維生素E)。
乳漿中的γ-球蛋白(免疫球蛋白)成分可以通過免疫接種供體動物來控制。免疫接種過程已為大家所熟知，免疫球蛋白的特異性可以針對任何特定生物體來度身定製以及放大，通過在疫苗中採用該生物體的經過滅活的株系。儘管在本發明的範圍內使用這種免疫乳漿失敗，但是使用非免疫乳漿是優選的，其中的「天然」γ-球蛋白對任何生物體都沒有特定的特異性。
如下面的例子所示，採用齲齒生物體變異鏈球菌、白色假絲酵母和甲氧苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌時，水解後的物質顯示生長抑制和粘附抑制。
下文中所述以及例示的標準製劑包含(v/v)β-乳球蛋白的脫輔基蛋白 32％脂肪滴膜的脫輔基蛋白 8％
游離脂肪酸22％(見表1)殘留脂類(包括膽固醇) 8％α-乳球蛋白的脫輔基蛋白 10％γ-球蛋白的脫輔基蛋白 8％乳清白蛋白2％α-生育酚 5％檸檬酸鈉 3％磷酸鈉2％水解過程激活了粘附抑制的特性，而這種性質在激活前的乳漿中不存在。圖2比較了水解前和水解後的乳清(後者即標準製劑)對於白色假絲酵母對口腔上皮細胞的粘附抑制效果。可觀察到，儘管未水解的乳清顯示一些粘附抑制，但是當水解後的乳清存在時，可見顯著的、濃度依賴的粘附抑制，以至於當其濃度為5mg/ml時，未檢測到白色假絲酵母的粘附。
乳清脫輔基蛋白的分離標準製劑可用氯仿進行分級分離通過甲醇抽提過程來分離脂類和脫輔基蛋白成分。
該過程採用在pH6.8的磷酸鹽緩衝液中濃度為10mg/ml的標準製劑。將1ml該溶液加入到含有5ml氯仿和2.5ml甲醇的玻璃管中。混合物漩渦混勻30秒，然後振搖30分鐘，之後靜置直到溶劑層達到完全分離。用一個巴斯德吸液管移去上層的甲醇。每個溶劑級分等分後真空乾燥。任何極性的複合物(蛋白)存在於極性溶劑(甲醇)級分，非極性的(脂肪酸)則保留在氯仿層中。乾燥後的甲醇級分僅佔其在pH6.8的磷酸鹽緩衝液中原初體積的1/10，乾燥後的氯仿級分佔其乙醇原初體積的1/10，後者由於試驗目的稀釋於PBS。
圖3顯示富含脫輔基蛋白的級分和富含脂類的級分二者的粘附抑制特性，富含脫輔基蛋白的級分顯示濃度依賴的粘附抑制，而富含脂類的級分則沒有此效果。實際上，當濃度為5mg/ml時，未檢測到白色假絲酵母的粘附。
圖4顯示富含脂類的級分對白色假絲酵母的濃度依賴的生長抑制特性，而圖5則顯示了富含脫輔基蛋白的級分對其生長沒有影響(實際上濃度為10mg/ml時，可見蛋白級分濃度的增加引起酵母生長的增加)。
實施例2採用上文方法和材料中所述的生長分析，評估標準製劑對白色假絲酵母新鮮臨床分離物的生長抑制特性。該分析採用微量滴定格式，每個測試濃度都重複測試四次。酵母的生長在600nm下監測超過20小時，結果如圖6所示。相對於加入0mg/ml標準製劑的對照，標準製劑(5mg/ml)顯示幾乎90％的生長抑制。1mg/ml的標準製劑的結果介於二者之間。
採用相似的分析過程，不同之處是在酵母正常生長5小時後加入待測物質，此處稱為幹涉分析。加入的標準製劑濃度範圍為0-8mg/ml。如此設定檢測濃度是為了確保加入預熱(至37℃)的待測溶液時，所有孔中的稀釋效果相近。對白色假絲酵母新鮮臨床分離物的幹涉分析結果見圖7，數據已經過處理，去除了5小時處由於加入待測物質而引起的光密度改變。在濃度為8、6、4、和2mg/ml時，標準製劑對白色假絲酵母的生長抑制效果明顯，而且該抑制效果在標準製劑加入後立即發生且十分顯著，呈濃度依賴性。
實施例3標準製劑除了抑制生長外還抑制粘附。粘附分析方法在上文方法和材料中已描述過。採用與實施例2中相同的製劑，其對相同的白色假絲酵母新鮮臨床分離物對口腔上皮細胞的粘附抑制效果示於圖8和圖9。
圖8中，在加入口腔上皮細胞前，酵母細胞已暴露於標準製劑10分鐘。圖9中，在加入酵母懸液前，口腔上皮細胞已暴露於標準製劑10分鐘。
這兩個分析中的「對照」代表在測試條件下無抑制物質存在時所達到的粘附；分別為41％和35％。在假絲酵母的預處理中加入1mg/ml標準製劑可降低粘附至20％(53％抑制)，而在口腔上皮細胞預處理中加入相同濃度的標準製劑可降低粘附至16％(55％抑制)。在酵母和口腔上皮細胞的預處理中同時加入2mg/ml和5mg/ml標準製劑，在本測試條件下顯示100％粘附抑制。
圖8中的「蛋白空白」是小牛血清白蛋白，圖9採用脫卵清的蛋白，濃度均為1mg/ml，均用來意指標準製劑的效果不「簡單地」是由於蛋白濃度而引起的效果。
實施例4標準製劑抗甲氧苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)粘附和生長的效用見圖10和11。
MRSA常規在血瓊脂培養基上進行次培養，其單克隆接種於Oxoid心腦灌流液試管，見上文方法和材料所述。8小時後，接種物用於生長和粘附分析，方法見上文所述。
MRSA對游離脂肪酸/甘油一酸酯不如其它生物體那樣敏感，加入檸檬酸鹽，如標準製劑中所含，對有效抑制這一特定生物體的生長是至關重要的。
圖10顯示5mg/ml標準製劑的效果，標準製劑中含有逐漸增加濃度的檸檬酸三鈉(0、2、4和5mg/ml)，當4或5mg/ml檸檬酸三鈉加入到5mg/ml的標準製劑中時，可達到完全的生長抑制。檸檬酸三鈉加入到測試溶液中，測試溶液如「生長分析」方法中所述在生長介質中製備。特別地是，如上文所述，標準製劑的儲液(濃度為20mg/ml)與相同體積的檸檬酸三鈉溶液(濃度為20mg/ml)混合。因此，在包含10mg/ml標準製劑和10mg/ml檸檬酸三鈉的溶液中，達到1∶2的稀釋。在上文中已解釋過，在檢測孔中這一組合製劑是5mg/ml標準製劑和5mg/ml檸檬酸三鈉。當然相同的是，20mg/ml標準製劑的儲液可以與相同體積的16mg/ml或8mg/ml檸檬酸三鈉溶液混合，從而分別獲得補充有4mg/ml和2mg/ml檸檬酸三鈉的標準製劑，如圖10所示。
MRSA粘附於口腔上皮細胞，此處採用它們的模式與白色假絲酵母試驗中所述的模式相似。儘管檸檬酸鈉自身對MRSA對口腔上皮細胞的粘附沒有作用，但是如圖11所示，在本測試條件下，5mg/ml標準製劑(未加入檸檬酸鈉)可達到幾乎完全的粘附抑制。小牛血清白蛋白用作「蛋白空白」，此物質對MRSA對口腔上皮細胞的粘附沒有作用。
實施例5變異鏈球菌生物體被認為是齲齒的病原物，因為它貪婪地粘附在牙釉質的表面。碳水化合物的發酵作用導致乳酸的分泌，致使局部pH降低從而引起牙釉質分解以及齲齒的發作。
圖12顯示5mg/ml標準製劑對變異鏈球菌生長的效果。此試驗採用上文所有生長分析中所描述的模式。5mg/ml標準製劑可完全抑制變異鏈球菌生物體的生長，並長達整個分析的15小時。在同一時間段中，加入pH6.8磷酸鹽緩衝液而不是標準製劑的對照的生長，顯示出預期的對數增長。
在檢測變異鏈球菌的粘附抑制時，Merck產的羥基磷灰石粉末用作牙釉質的替代物。測試過程如上文方法和材料所述，除了以下少許修正1ml新鮮培養物，調整其在600nm的光密度為0.1，加入5mg唾液包被的羥基磷灰石小珠；允許粘附1小時；然後低速離心沉澱粘附有細菌的羥基磷灰石。上清中留有的細菌數是原初未粘附群體的百分數，表示為原初群體的一個百分比；其倒數是粘附抑制的百分比。
圖13顯示標準製劑的粘附抑制效果是劑量依賴的；濃度為0.8mg/ml時達到幾乎完全的抑制。此實施例中，小牛血清白蛋白還是用作「蛋白空白」，在此測試系統中，0.8mg/ml BSA顯示約30％的抑制效果，而檸檬酸鈉顯示約10％粘附抑制。
權利要求
1.乳汁脫輔基蛋白或其混合物在抑制潛在病原體粘附於人體或動物體表面內或表面上的應用。
2.乳汁脫輔基蛋白或其混合物在生產可用於抑制潛在病原體粘附於人體或動物體表面內或表面上的藥物中的應用。
3.一種藥物學上可接受的給藥系統，包括存在於藥用載體中的至少一種乳汁脫輔基蛋白或其混合物。
4.上述權利要求任一項中的應用或給藥系統，其中的乳汁脫輔基蛋白是乳汁脫輔基脂蛋白。
5.權利要求4中的應用或給藥系統，其中乳汁脫輔基脂蛋白來自一種乳汁脂蛋白，所述乳汁脂蛋白選自β-乳球蛋白、脂肪滴膜和α-乳白蛋白或它們的混合物。
6.上述權利要求任一項中的應用或給藥系統，其中乳汁脫輔基蛋白或其混合物是通過以下方法製備的用酶水解乳清或乳漿，所述酶優選是脂酶；將酶變性；分離富含脫輔基蛋白的級分。
7.權利要求1-5中任一項中的應用或給藥系統，其中乳汁脫輔基蛋白或其混合物是通過以下方法製備的用酶水解乳清或乳漿，所述酶優選是脂酶。
8.上述權利要求中任一項中的應用或給藥系統，其中乳汁是母牛或山羊的乳汁。
9.上述權利要求中任一項中的應用或給藥系統，還包括至少一種游離脂肪酸或其混合物；或其甘油一酸酯，或它們的混合物。
10.權利要求9中的應用或給藥系統，其中脂肪酸是飽和的或不飽和的，具有含C4-C24偶數碳原子的烴鏈，或其混合物。
11.權利要求10中的應用或給藥系統，其中不飽和脂肪酸具有C14-C24的烴鏈，優選地選自棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α和γ亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十四碳烯酸，及它們的甘油一酸酯，或其混合物。
12. 權利要求10中的應用或給藥系統，其中飽和脂肪酸具有C4-C18的烴鏈，優選地選自丁酸、異丁酸、琥珀酸、己酸，己二酸、辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸，以及它們的甘油一酸酯，或其混合物。
13.上述權利要求任一項中的應用或給藥系統，進一步結合至少一種有機酸或它的鹽或酯，或它們的混合物。
14.權利要求13中的應用或給藥系統，其中有機酸選自乙醇酸、草酸、乳酸、甘油酸、羥基丙二酸、羥基丁二酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、丙二酸、戊二酸、丙烯酸、順或反式丁烯酸和檸檬酸或它們的鹽或酯，或它們混合物。
15.上述權利要求任一項中的應用或給藥系統，進一步結合一種抗氧化劑，優選α-生育酚。
16.權利要求2-15任一項中的應用或給藥系統，其為腸胃外的輸注的溶液形式，用於全身性治療或防止感染。
17.權利要求2-15任一項中的應用或給藥系統，其為藥膏的形式，用於防止或治療皮膚感染的局部應用。
18.權利要求2-15任一項中的應用或給藥系統，其為陰道用乳膏或凝膠或藥栓形式，用於防止或治療白色假絲酵母的復發感染。
19.權利要求2-15任一項中的應用或給藥系統，其為外科用的敷料形式，用於防止或治療感染。
20.權利要求2-15任一項中的應用或給藥系統，其為用於眼、鼻、口、腸或生殖器的黏膜的藥物形式，。
21.權利要求20中的應用或給藥系統，其為滴眼液形式，用於防止或治療眼部的感染。
22.權利要求20中的應用或給藥系統，其為鼻用噴霧劑的形式，用於抑制抗生素抗性生物體從攜帶者轉移。
23.權利要求20中的應用或給藥系統，其為食品或飲料的形式，用作抵抗腸道感染的預防製劑。
24.權利要求20中的應用或給藥系統，其為口服保健製劑的形式，所述製劑選自牙膏、口香糖、漱劑或其他潔齒劑，用於增進牙齒衛生或作為口腔疾病的預防劑。
25.權利要求7-24任一項中的應用或給藥系統，當其從屬於權利要求1-5任一項時，其中水解的乳清或乳漿的濃度範圍為0.5-25mg/ml。
26.上述權利要求任一項中的應用或給藥系統，其中乳汁脫輔基蛋白或其混合物的濃度範圍為0.5-10mg/ml，優選3-7mg/ml。
27.權利要求9-12中任一項的應用或給藥系統，其中游離脂肪酸或其甘油一酸酯，或它們的混合物的濃度範圍為0.5-5mg/ml。
28.權利要求13或權利要求14中的應用或給藥系統，其中有機酸或它的鹽或酯，或它們的混合物的濃度範圍為0.5-5mg/ml。
29.權利要求9-12和權利要求27任一項中的應用或給藥系統，其中乳汁脫輔基蛋白或其混合物；以及游離脂肪酸或其甘油一酸酯，或它們的混合物，可同時用藥或在6個小時內以任意順序用藥。
30.權利要求13、14和28中的應用或給藥系統，當從屬於權利要求1-8中任一項時，其中乳汁脫輔基蛋白或其混合物；以及有機酸或它的鹽或酯，或它們的混合物，可同時用藥或在6個小時內以任意順序用藥。
31.權利要求13、14和28中的應用或給藥系統，當從屬於權利要求9-12中的任一項時，其中乳汁脫輔基蛋白或其混合物；游離脂肪酸或其甘油一酸酯或它們的混合物；以及有機酸或它的鹽或酯或它們的混合物，可同時用藥或相互間隔6個小時內以任意順序用藥。
32.權利要求2-15中的應用或給藥系統，用於美容性皮膚護理。
全文摘要
本發明涉及使用乳汁脫輔基蛋白或它的混合物，預防或治療由微生物或病毒引起的人體或動物體的感染。據信這一目的是通過抑制潛在病原體的粘附來達到的。更優選的是，至少一種乳汁脫輔基蛋白或它的混合物，同時或順序地與下述二者或其中一種用藥至少一種游離脂肪酸或其混合物或其甘油一酸酯；和/或至少一種有機酸或其鹽或酯或它們的混合物。活性製劑可以通過藥物學上可接受的給藥系統來輸送，包括非腸道使用的溶液、軟膏、滴眼液、鼻用噴霧劑、陰道內用裝置、外科敷料、醫用食品或飲料、口服保健製劑和應用於黏膜的藥劑。
文檔編號A61P1/02GK1578670SQ02821078
公開日2005年2月9日 申請日期2002年8月20日 優先權日2001年8月23日
發明者M·A·福蘭, D·布拉迪 申請人:韋斯特蓋特生物有限公司