使用白蛉唾液免疫原的利什曼原蟲疫苗的製作方法

2023-04-23 23:14:41

專利名稱：使用白蛉唾液免疫原的利什曼原蟲疫苗的製作方法
使用白蛉唾液免疫原的利什曼原蟲疫苗援引加入本申請要求2008年5月8日提交的美國臨時申請系列No. 61/051，635，及2008年 9月30日提交的美國臨時申請系列No. 61/101，345的權利，其引用2003年10月四日提交 的題為「Lutzomyia Longipalpis Polypeptides and Methods of Use」的國際申請No. PCT/ US2003/034453，其要求2002年10月四日提交的臨時申請No. 60/422, 303的優先權。將本文引用或參考的全部文獻(「本文引用的文獻」)，及本文引用的文獻中引用 或參考的全部文獻，以及本文或通過引用併入本文的任何文獻中提及的任何產品的任何廠 商使用說明，說明書，產品說明，及產品手冊通過引用併入本文，及可用於實施本發明。
技術領域：
本發明涉及用於動物或人對抗利什曼原蟲感染的製劑。特異性，本發明提供含及 體內或體外表達誘發動物或人針對利什曼原蟲的免疫應答的白蛉長鬚羅蛉唾液抗原的載 體，包括組合物，其包括所述載體，針對利什曼原蟲免疫接種的方法，及用於此方法及組合 物的試劑盒。
背景技術：
利什曼病是影響人，犬科動物(狗，狼，狐狸，山狗，豺)，及次之為，貓科動物(獅， 虎，家養貓科動物，野生貓科動物，其他大型貓科動物，及其他貓科動物，包括獵豹及猞猁) 的主要及嚴重的寄生蟲疾病。基於分子學，生物化學及免疫學相似性將利什曼原蟲及巴西亞屬分入複合種及亞 種。根據臨床表現命名了幾種形式的疾病，包括皮膚利什曼病，皮膚黏膜利什曼病或內臟利 什曼病。這些形式的疾病中的每一種由見於世界不同地區的不同種的白蛉引發。人皮膚利 什曼病，在舊大陸與衣索比亞利什曼原蟲(L. aethiopica)，碩大利什曼原蟲(L. major)， 及熱帶利什曼原蟲(L. tropica)複合種的成員有關；而在新大陸與墨西哥利什曼原蟲 (L. mexicana)及巴西利什曼原蟲(L. braziliensis)複合種的成員有關。內臟利什曼病，在 舊大陸由杜氏利什曼原蟲(L. donovani)及嬰兒利什曼原蟲引發，而在新大陸，恰加斯利什 曼原蟲主要引發內臟利什曼病。因為嬰兒利什曼原蟲主要與犬科動物利什曼病有關，狗中 的感染常被認為是內臟利什曼病，儘管它們趨於兼引發內臟利什曼病及皮膚利什曼病。內臟利什曼病的病原體是原生動物寄生蟲，且屬於杜氏利什曼原蟲複合種。此寄 生蟲廣泛分布於南歐、非洲，亞洲，南美及中美的溫帶及亞熱帶國家(Desjeux P.等人)。杜 氏利什曼原蟲嬰兒亞種(嬰兒利什曼原蟲)在南歐，非洲，及亞洲引發貓科動物及犬科動物 疾病。在南美及中美，病原體是杜氏利什曼原蟲恰加斯亞種(恰加斯利什曼原蟲)，其與嬰 兒利什曼原蟲緊密相關。人中，病原體是杜氏利什曼原蟲杜氏亞種(杜氏利什曼原蟲)，其 也與嬰兒利什曼原蟲及恰加斯利什曼原蟲(L. chagasi)相關。白蛉(Wilebotomus)屬(舊大陸)及羅蛉(Lutzomyia)屬白蛉(新大陸)是疾病 傳播的主要載體。目前這些是僅知的能傳播的載體；也顯示跳蚤，蜱及其他節肢動物是有能力的載體。但是，通過血液或體液交換，直接接觸及至少一個先天性傳播病例染罕見的 利什曼病病例。尚未確定天然白蛉的重要性，但可與生物的感染性劑量相關。近些年，仍 及在無已知載體的情況下，在全美國的獵狐狗狗舍(Foxhound kennels)有勢不可擋的利 什曼病發病率。仍未知疾病傳播如何發生或此疾病如何在這些狗中維持，因為美國尚未報 道感染的白蛉。但發現，某些羅蛉種(Lsharmoni)，沿著美國東部及至遠北部新澤西，被認 為是潛在有能力的墨西哥利什曼原蟲載體。Phlebotomus ariasi (P. ariasi)及惡毒白蛉 (P. perniciosus), Phlebotomus neglectus (P. neglectus)是在南歐，非洲，及亞洲最常見 的載體，而長鬚羅蛉(Lu. Iongipalpis)是在南美及中美最常見的載體。利什曼病是可需7年才變得臨床上明顯的緩慢進行性疾病(McConkey SE et al.； Slappendel RJ et al.)。儘管如此，體徵常非特異且極少考慮利什曼原蟲診斷。狗最常感 染嬰兒利什曼原蟲(杜氏利什曼原蟲複合種)，其導致人中的內臟營養疾病。但是，達90% 的感染的狗患內臟及皮膚損傷(Slappendel RJ et al.)。另一方面，許多狗顯示出天然抗 此寄生蟲及可保持無症狀，儘管已知感染(GrosjeanNL et al.)。估計僅10%居住在局部 地區的狗實際上發生臨床疾病(Lindsay DS et al.)。此臨床疾病的更低發病率歸因於某 些狗相比體液應答，引發更多保護性細胞介導的免疫應答的遺傳傾向(Lindsay DSet al., McConkey SE et al.，Slappendel RJ, et al.)。而且，報導稱，達20%的感染的狗可引發足 夠的免疫應答，且從臨床病態自發地恢復(McConkey SE et al.)。引發體液應答的動物中， IgGl顯示出與臨床疾病相關，而無症狀狗具有更高的IgG2抗體水平(Lindsay et al.)。一些利什曼病的更常報導的臨床體徵包括伴隨厭食及體重減輕的倦怠，疲勞及 運動不耐，其最終至消耗病(McConkey SE et al.)。這些體徵可伴隨或不伴隨發熱，局部或 全身淋巴結病(90%)及/或肝脾腫大(Grosjean NL et al. ,Lindsay DS et al. ,McConkey SE et al.，Martinez-Subiela S et al.)。關節牽連相當常見，且可呈現為有腫大關節的 跛行或簡單呈現為僵硬步態。欠常見的發現包括眼損傷(< 5% )，慢性腹瀉(30% )及被 稱為甲彎曲的長、變形的脆甲症) (LindsayDS et al.，Slappendel RJ et al.)。皮 膚損傷存在於達89%的感染的狗中，有或無明顯的內臟牽連體徵。身體的任何部位可發生 皮膚利什曼病損傷，但最常見的部位是暴露於環境且因此更易被白蛉咬的部位。初始丘疹 快速產生潰瘍。內臟利什曼病常常致死，如果不及時治療。內臟利什曼病影響身體內部器 官，特別是脾臟及肝臟。狗被認為是主要的利什曼病儲蓄者。疾病的特徵在於發生在少於50%的感染的動 物中的內臟-皮膚體徵的慢性發展(Lanotte G. et al.)。有可檢測的抗體的無症狀及有症 狀狗均可為感染性的(Molina R. etal. ；Courtenay 0. et al.)。貓也可為原生動物寄生蟲 的載體，及因此考慮為第二潛在的儲蓄者。由於多種因素，最好限制狗中利什曼病的治療選項及對治療的反應。由於一些未 確定的理由，狗的內臟利什曼病比人的更難治療。無在清除寄生蟲感染中100%有效的治 療選項，且在停止治療時臨床疾病常重現(Lindsay DS et al.)。在局部地區，最常見的治 療方案是別嘌呤醇與五價銻劑(例如銻酸葡甲胺或葡萄糖酸銻鈉)的組合(LindsayDS et al. , Slappendel RJ et al.)。但是，近些年，此流程由於增加的寄生蟲對藥物的抗性以及 與這些化合物相關的不利的副作用而變得過時(Lindsay DS et al.)。為進一步限制治療 選項，Pentostam (葡萄糖酸銻鈉)是在美國僅可用的銻劑，且其分布由GA，亞特蘭大的疾病控制及預防中心(⑶C)調節(Lindsay DS et al.)。也嘗試了其他流程，但被證明非在清除寄生蟲感染或在預防臨床復發中更有效。 此外，各流程與潛在不利的效果有關。兩性黴素B結合留醇，且破壞細胞膜滲透性，但有腎 毒性(Lindsay DS et al.)。當腸胃外給予時，巴龍黴素(Paramomycin)與銻劑協同作用 導致更高水平的銻劑持續更長時期，但也有腎毒性，且目前不推薦臨床使用(Lindsay DS et al.)。羥乙磺酸噴他咪在抗利什曼病中有效，但要求至少15次肌內注射，且相當痛苦 (Lindsay DS et al.)。酮康唑，咪康唑，氟康唑及伊曲康唑是可有用於含疾病的口服藥物， 但成本受限，且當治療有症狀的患者時有藥物抗性的風險。總之，研究了各種狗中利什曼病 治療方案，但不100%有效；復發是常規的，而非以外。最終，美國的獸醫學實踐者面臨治療 在有風險發展此寄生蟲的藥物抗性株的狗中利什曼病症狀蔓延的困境。大量檢測血清陽性狗之後治癒及/或藥物治療，或大量應用溴氰菊酯-浸漬的 項圈，已顯示對減少南歐，非洲，及亞洲的局部地區的人及犬科動物利什曼病流行有影響 (Maroli M. et al. Mazloumi GavganiA. S. et al.)，儘管已討論消除血清陽性犬科動物的效 力(Dietze R. etal. ；Moreira Jr. Ε. D. et al.)。這些控制方法或被認為不可接受，或被認 為耗資或不有效(Gradoni L. et al.)。使用數學模型來比較控制利什曼病的各種工具的有 效性提示，犬科動物疫苗可為最有實踐性及有效的方法(Dye C.)。因此，利什曼病控制程序 的實施以及獸醫學社區高度期望開發出能保護犬科動物免於利什曼病及/或預防感染的 動物中的疾病進展的疫苗(Gradoni L. et al.)。之前的研究用於開發通過，例如，施用抗原性多肽來診斷及治療利什曼原蟲的方 法(見，例如，WO 2004/039958，通過引用將其整體併入本文)。但是，至今，尚無疫苗可用 於治療利什曼原蟲。本發明的載體及疫苗製劑滿足了此本領域長期以來的需求。本申請中引用或列出的任何文獻不旨在承認這些文獻為本發明的現有技術。發明概述本發明的目的可為提供重組載體或病毒以及製備此病毒的方法，及提供治療及預 防利什曼原蟲感染的組合物及/或疫苗以及方法中的任何一個或全部。本發明提供重組載體，例如重組病毒，例如重組痘病毒，其含及表達至少一種外源 核酸分子，且所述至少一種外源核酸分子可包括編碼自長鬚羅蛉的白蛉載體的唾液蛋白的 目的免疫原或表位的核酸分子。尤其是，本發明提供重組載體，例如重組病毒，例如重組痘病毒，其含及表達至少 一種外源核酸分子，且所述至少一種外源核酸分子可包括唾液長鬚羅蛉多肽及/或其變體 或片段。這些疫苗可預防宿主中寄生蟲的擴散及/或複製。本發明還提供免疫學(或免疫原性)，或疫苗組合物，其包括此表達載體或此表達 載體的表達產品。本發明還提供誘導抗利什曼原蟲的免疫學(或免疫原性)或保護性應答的方法， 以及預防或治療利什曼原蟲或利什曼原蟲引發的疾病狀態的方法，包括施用表達載體或表 達載體的表達產品，或包括表達載體的組合物，或包括表達載體的表達產品的組合物。本發明也涉及自病毒的表達產品以及從表達產品產生的抗體或其體內表達，及此 產品及抗體在例如診斷性應用中的用途。
這些及其他實施方式被以下詳述公開，或明顯自以下詳述，及被以下詳述涵蓋。
以例給出的下列詳述及附圖不旨在限制本發明於特定實施方式。圖1顯示質粒pVR2001LJM17的一條鏈的核酸序列(SEQ IDNO :9)，其中2個BamHI 限制性內切酶位點以粗體顯示，編碼tPA信號肽的序列加了下劃線，而編碼LJM17的序列以 粗體大寫字母顯示。圖2顯示質粒pVR2001LJL143的一條鏈的核酸序列(SEQ IDNO 10)，其中2個 BamHI限制性內切酶位點以粗體顯示，編碼tPA信號肽的序列加了下劃線，而編碼LJL143的 序列以粗體大寫字母顯示。圖3顯示具有5737個鹼基對的供體載體pALVAC C3H6p_LJM17的圖譜。圖4顯示VCP2390金絲雀痘表達載體的正向及反向互補鏈(SEQID NO 93及SEQ ID N0:92)。SEQ ID NO :93表示以編碼LJM17多肽(SEQ ID NO 5)的方向含密碼子-優化 的LJM17多核苷酸的VCP2390載體鏈。圖5顯示具有MOO個鹼基對的供體載體pALVAC C3H6p_LJL143的圖譜。圖6顯示插入子編碼LJL143的vCP2389金絲雀痘表達載體，及顯示表達載體的一 條鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO 94)。圖7顯示疫苗接種的狗及對照狗中，從Vl施用之前一天到V5施用之後2周的兼 針對LJM17及LJL143的抗-IgG抗體，在405nm處測量吸光度。圖8顯示第五次免疫(V5施用)之後2周的從對應於5組的狗PBMC的幹擾素-Y 分泌(pg/mL)。用 SGH(2 對)，LJL143 (4 μ g)，LJMl7 (4 μ g)，ConA (4 μ g)刺激 PBMC,或用培 養基(med)非刺激。圖9顯示包括結果的體外殺試驗的圖解，以感染的巨噬細胞的百分率表示(NT 無 治療，LPS 脂多糖，conA :刀豆素A)。圖10顯示疫苗接種的狗及對照狗的用蘇木素/曙紅(H&E)，Luna氏，Toludine藍 及就CD3的免疫組織化學過程及巨噬細胞/單核細胞標記物(Mac)染色的白蛉叮咬處的活 組織檢查。圖11顯示質粒pNB0002的一條鏈的核酸序列(SEQ ID NO 19)，其中2個BamHI限 制性內切酶位點以粗體顯示，編碼tPA信號肽的序列加了下劃線，而編碼LJM17的序列以粗
體大寫字母顯示。圖12顯示具有6247個鹼基對的有編碼LJMl7的插入子的pNB0002質粒載體的圖譜。圖13顯示質粒pNB0003的一條鏈的核酸序列(SEQ ID NO :20)，其中2個BamHI限 制性內切酶位點以粗體顯示，編碼tPA信號肽的序列加了下劃線，而編碼LJL143的序列以 粗體大寫字母顯示。圖14顯示具有5899個鹼基對的有編碼LJL143的插入子的pNB0003質粒載體的圖譜。圖15顯示自長鬚羅蛉的LJL143及LJM17的蛋白序列。圖16顯示自長鬚羅蛉的LJL143及LJM17的DNA序列。
圖17顯示序列同一性表。圖18顯示各DNA及多肽指定的SEQ ID NO。圖19是顯示暴露於長鬚羅蛉白蛉叮咬的狗中的抗-唾液免疫的一組坐標圖及照 片。圖19A是顯示暴露的狗中抗-長鬚羅蛉IgG，IgG2，及IgGl抗體效價的早期動力學的 一組坐標圖。圖19B是貫穿暴露實驗的代表性的狗中的延遲型超敏反應的坐標圖。圖19C 是暴露於白蛉叮咬之前(EO)，第一次暴露於白蛉叮咬(El)之後4 時，第二次暴露於白蛉 叮咬(E2)之後4 時及第三次暴露於白蛉叮咬(E3)之後4 時，對皮膚鑽取活組織檢查 進行的H/E組織學分析的一組照片。圖19D是第三次暴露於白蛉叮咬(E3)之後48h時用 對CD3+T淋巴細胞及巨噬細胞的免疫組織化學及用對嗜酸性粒細胞的Lima氏染色表徵炎 症群的一組照片。圖20是顯示狗中cDNA反抗原篩選試驗的一組坐標圖及照片。圖21是顯示狗中蛋白反抗原篩選試驗的一組坐標圖及照片。圖22是顯示用重組唾液蛋白刺激之後自疫苗接種的狗的外周血單核細胞(PBMC) 的幹擾素Y產生的一組2個坐標圖。圖23是顯示自免疫的狗的由PBMC的對恰加斯利什曼原蟲的體外殺試驗的一組4 個柱狀圖(NT，無治療；Ly，淋巴細胞)。發明詳述需知，本公開中及尤其權利要求中，術語例如「包括(comprises)」，「包括 (comprised)」，「包括(comprising) 」等可具有美國專利法規定的含義；例如它們可意指 「包括(includes)」，「包括(included) 」，「包括(including) 」等；且術語例如「基本上 由…組成(consisting essentially of)」及「基本上由…組成(consists essentially of)」具有美國專利法規定的含義，例如它們允許尚未明確敘述的因素的存在，但排除見於 現有技術或影響本發明的基本特徵或新特徵的因素。除非另有說明，根據常規應用使用技術術語。分子生物學中常見的術語的 定義可見於 Benjamin Lewin, Genes V. Oxford University Press 出版，1994(ISBN 0-19-854287-9) ；Kendrew et al. (eds. ), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9)；及 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology :a Comprehensive Desk Reference, VCHPub lisher s, Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。單數術語 「a，，、「an」 及 「the」 包 括複數，除非文中另有明確說明。類似地，詞語「或」旨在包括「及」，除非文中另有說明。詞 語「或」是指特定列表中的任何一個成員，及也包括該列表成員的任何組合。需知，在本公開及隨附的權利要求及/或段落中，術語「唾液長鬚羅蛉多肽」，「長 須羅蛉多肽」，或「唾液多肽」可互換使用，術語「唾液長鬚羅蛉多核苷酸」，「長鬚羅蛉多核苷 酸」，或「唾液多核苷酸」可互換使用。術語「多肽」及「蛋白」在本文可互換使用，指連續胺基酸殘基的聚合物。術語「核酸」，「核苷酸」，及「多核苷酸」指RNA或DNA及其衍生物，例如含修飾的主 鏈的那些。應知，本發明提供包括互補於本文所述的多核苷酸的序列的多核苷酸。本發明的 多核苷酸可用不同方法製備(例如通過化學合成，通過基因克隆等)，且可取各種形式(例 如線性或分支的，單或雙鏈，或其雜交體，引物，探針等)。
術語「基因」廣義指相關於生物學功能的任何多核苷酸區段。因此，基因或多核苷 酸可如在基因組序列中包括內含子及外顯子，或如在cDNA中僅包括編碼序列，例如，始於 起始密碼子(甲硫氨酸密碼子)及終於終止信號(終止密碼子)的開放閱讀框(ORF)。基因 及多核苷酸也可包括調控它們的表達的區，例如轉錄起始，翻譯及轉錄終止。因此，也包括 啟動子及核糖體結合區(通常，這些調控元件位於編碼序列或基因的起始密碼子上遊的約 60 與 250 個核苷酸之間；Doree S Met al. ；Pandher K et al. ；Chung J Y et al.)，轉錄 終止子(通常，終止子位於編碼序列或基因的終止密碼子下遊的約50個核苷酸之內；Ward C K et al.)。基因或多核苷酸也指表達mRNA或功能性RNA，或編碼特異蛋白的核酸片段， 及其包括調控序列。本文使用的術語「免疫原性多肽」或「免疫原性片段」指包括等位基因-特異基序， 表位或其他序列的多肽或多肽片段，由此，多肽或片段將與MHC分子結合，及誘導細胞毒性 T淋巴細胞(「CTL」)應答，及/或B細胞應答(例如，抗體產生)，及/或T-輔助淋巴細 胞應答，及/或針對衍生出免疫原性多肽或免疫原性片段的抗原的延遲型超敏反應(DTH)。 DTH反應是免疫應答，其中T細胞-依賴性巨噬細胞活化及炎症導致組織損傷。對抗原皮下 注射的DTH反應常被用作用於細胞介導的免疫的試驗。據定義，表位是一旦施用於宿主，就能引發體液(B細胞)及/或細胞型(T細胞) 免疫應答的免疫學活躍的抗原決定簇。這些是有抗原性的分子上的特定化學基團或肽序 列。抗體特異性結合多肽上的特定抗原性表位。表位的特定非限制性實施例包括多肽中的 四肽 五肽序列，多糖中的三糖苷 五糖苷序列。動物中，多數抗原將同時呈遞幾種或甚至 許多抗原決定簇。此多肽也可定量為免疫原性多肽，而表位可如下所述鑑定。「分離的」生物學成分(例如核酸或蛋白或細胞器)指已基本上從生物細胞中的 其他生物學成分分離出或純化出的成分，其中成分天然存在，例如，其他染色體及染色體外 DNA及RNA，蛋白，及細胞器。已「分離的」核酸及蛋白包括通過標準純化方法純化的核酸及 蛋白。術語也包括通過重組技術以及化學合成製備的核酸及蛋白。本文使用的術語「純化的」不要求絕對純淨；而是旨在表示相對術語。因此，例如， 純化的多肽製劑是其中多肽比多肽在天然環境中更富含的多肽製劑。多肽製劑是基本上純 化的，由此多肽代表製劑的總多肽含量的至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少 95%，或至少98%的幾個實施方式。多核苷酸也同樣。本文公開的多肽可通過任何現有技 術中已知的手段純化。重組多核苷酸是具有不天然存在的序列或具有通過人工組合2個別樣分離的序 列區段製備的序列的多核苷酸。此人工組合常通過化學合成，或更常通過人工操作分離的 核酸區段，例如，通過遺傳工程技術實現。在一實施方式中，重組多核苷酸編碼融合蛋白。一方面，本發明提供自白蛉物種長鬚羅蛉的多肽。另一方面，本發明提供具有SEQ ID NO :1,3,5,7,11,13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55， 57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或 87，及其變體或片段所示的序列的 多肽。而且，自白蛉物種長鬚羅蛉的多肽同源物旨在本發明的範圍之內。本文使用的術 語「同源物」包括直系同源物，類似物及旁系同源物。術語「類似物」指具有相同或相似功 能，但在不相關的生物中獨立進化的2個多核苷酸或多肽。術語「直系同源物」指自不同物種，但通過物種形成從共同祖先基因進化而來的2個多核苷酸或多肽。通常，直系同源物編 碼具有相同或相似功能的多肽。術語「旁系同源物」指通過基因組內複製而相關的2個多 核苷酸或多肽。旁系同源物常具有不同功能，但這些功能可相關。通過翻譯後修飾，通過氨 基酸序列差異，或兼通過二者，野生型唾液多肽的類似物，直系同源物，及旁系同源物可與 野生型唾液多肽不同。尤其是，本發明的同源物將一般與全部或部分野生型唾液多肽或多 核苷酸序列呈現至少80 85%，85 90%，90 95%，或95%，96%，97%，98%，99%序 列同一性，及將呈現相似功能。另一方面，本發明提供與具有SEQ ID NO :1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29， 31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79， 81，83，85，或87所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少 90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多肽。再一方面，本發明提供上述長鬚羅蛉多肽的片段及變體(SEQ IDNO=I,3,5,7,11, 13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65， 67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87)，其可由本領域技術人員使用熟知的分子生物學 技術容易製備。變體是具有與SEQ ID NO :1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39， 41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或 87 所
示的胺基酸序列具有至少75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%同一性的 胺基酸序列的同源多肽。變體包括等位變體。術語"等位變體"指含多態性的多核苷酸或多肽，所述多態 性導致蛋白的胺基酸序列變化，及存在於天然群(例如病毒物種或變種)內。此天然等位 變異可一般導致多核苷酸或多肽的1 5%方差。等位變體可通過測序許多不同物種的目 的核酸序列來鑑定，其可容易通過使用雜交探針進行，以在那些物種中鑑定相同基因遺傳 座位。天然等位變異的結果及如果感興趣、不改變基因的功能活性的任何及全部此核酸變 異及產生的胺基酸多態性或變異旨在本發明的範圍之內。變體是自長鬚羅蛉唾液的任何分泌的多肽，能在用此多肽疫苗接種的動物(例如 狗)中誘導特異的基於細胞的免疫應答，其特徵在於，通過長鬚羅蛉唾液腺提取化合物刺 激後分泌幹擾素Y (IFN- y )。此IFN- γ分泌可使用體外方法展示(即自R&D Systems Inc. 的Quailtikine immunoassay (貨號 #CAIF00) ；Djoba Siawaya JF et al.)。本文使用的術語"衍生物"或「變體」指多肽，或編碼多肽的核酸，所述多肽具有 一個或多個保守胺基酸變異或其他小修飾，由此(1)相應多肽相比野生型多肽具有基本 上等同的功能，或( 針對多肽產生的抗體與野生型多肽發生免疫反應。這些變體或衍生 物包括具有長鬚羅蛉多肽一級胺基酸序列的小修飾的多肽，所述修飾可產生相比未修飾的 該多肽具有基本上等同的活性的肽。此修飾可有意，如通過定點誘變，或可自發。術語「變 體」還包括對序列的缺失，添加及置換，只要多肽發揮產生本文定義的免疫學反應的功能。術語"保守變異"是指胺基酸殘基被另一生物學相似的殘基取代，或核酸序列中 的核苷酸取代，由此編碼的胺基酸殘基不變化，或是轉變成另一生物學相似的殘基。在這點 上，尤其優選的置換一般將在性質上保守，即，胺基酸家族內發生的置換。例如，胺基酸一般 被分為4個家族(1)酸性一天冬氨酸及穀氨酸；(2)鹼性一賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性一丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及(4) 不帶電的極性一甘氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。苯丙氨 酸，色氨酸，及酪氨酸有時被分類為芳香族胺基酸。保守變異的例包括一個疏水性殘基(例 如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸)被另一疏水性殘基置換，或一個極性殘基被另一 極性殘基置換，例如精氨酸被賴氨酸，穀氨酸被天冬氨酸，或穀氨醯胺被天冬醯胺置換等； 或將對生物學活性無主要影響的胺基酸被結構上相關的胺基酸的相似保守取代。因此，與 參照分子具有基本上相同的胺基酸序列，但加工了少數基本上不影響蛋白的免疫原性的氨 基酸置換的蛋白在參照多肽的定義之內。通過這些修飾產生的全部多肽包括在本文中。術 語"保守變異"也包括代替未取代的原胺基酸使用取代的胺基酸，前提是，針對取代的多 肽產生的抗體也與未取代的多肽發生免疫反應。長鬚羅蛉多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO :1，3，5，7，11，13，15，17，23， 25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，
75，77，79，81，83，85，或87或其變體所示的序列的長鬚羅蛉多肽的至少8，10，15，或20個連 續胺基酸，至少21個胺基酸，至少23個胺基酸，至少25個胺基酸，或至少30個胺基酸。另 一實施方式中，長鬚羅蛉多肽片段包括見於全長長鬚羅蛉多肽的特異抗原性表位。確定多肽片段及表位的方法，例如，產生重疊肽文庫(Hemmer B. et al.)，肽掃描 術(Geysen H. M. et al. , 1984 ；Geysen H. M. et al. , 1985 ；Van der Zee R. et al. ；Geysen H. Μ.)及算法(De Groot A. et al. ；HoopT. et al. ；Parker K. et al.)可在本發明的實踐 中使用，無需過多的實驗。一般而言，抗體特異性結合特定抗原性表位。特異地，表位的非 限制性實施例包括多肽中的四肽 五肽序列，多糖中的三糖苷 五糖苷序列。在動物中，多 數抗原將同時呈遞幾種或甚至許多抗原決定簇。其中表位優選是更大分子的蛋白片段，其 將與總蛋白具有基本上相同的免疫學活性。另一方面，本發明提供編碼自長鬚羅蛉白蛉的多肽的多核苷酸，例如編碼具有SEQ ID NO :1,3,5,7,11,13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55， 57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或 87 所示的序列的多肽的多核苷酸。 再一方面，本發明提供編碼與具有SEQ ID NO :1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33， 35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83， 85，87所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少 95 %，96 %，97 %，98 %或99 %序列同一性的多肽，或者這些多肽之一的保守變體，等位變 體，同源物或包括至少8或至少10個連續胺基酸的免疫原性片段，或者這些多肽的組合的 多核苷酸。另一方面，本發明提供具有SEQ ID NO :2，4，6，8，12，14，16，18，21，22，24，26，28， 30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78， 80，82，84，86，88，89，90，或91，或其變體所示的核苷酸序列的多核苷酸。再一方面，本發明 提供與具有 SEQ ID NO :2,4,6,8,12，14，16，18，21，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42， 44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，89，90，或 91,或其變體所示的序列的多核苷酸之一具有至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %， 至少90%，至少95%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多核苷酸。這些多核苷酸可包括編碼長鬚羅蛉多肽的DNA，cDNA,及RNA序列。需知，編碼長鬚羅蛉多肽全部多核苷酸也包括在本文中，只要它們編碼有指定活性的多肽，所述活性例如， 當施用給暴露於寄生蟲的受試者或經歷利什曼原蟲感染體徵或症狀降低的受試者時，結合 識別多肽的抗體，誘導對多肽的免疫應答，或對利什曼原蟲存活率的影響。本文公開的多核苷酸包括遺傳密碼簡併所致的序列，例如對特異宿主的優化的密 碼子利用。本文使用的，「優化的」指經遺傳工程改造以增加其在給定物種中表達的多核苷 酸。為提供編碼唾液多肽的優化的多核苷酸，唾液蛋白基因的DNA序列可經修飾，以1)包 括優選在特定物種中高度表達的基因的密碼子；幻核苷酸鹼基組成中包括基本上見於所 述物種中的A+T或G+C含量；幻形成所述物種的起始序列；或4)消除導致去穩定化，不恰 當的多聚腺苷酸化，RNA降解及終止的序列，或形成二級結構發卡或RNA剪接位點。所述物 種中唾液蛋白的升高的表達可通過利用真核生物及原核生物中，或特定物種中密碼子利用 的分布頻率來實現。術語「優選的密碼子利用的頻率」指特異宿主細胞在核苷酸密碼子利 用中表現出的指定給定胺基酸的偏好。有20種天然胺基酸，多數指定多於一種密碼子。因 此，全部簡併核苷酸序列包括在本公開中，只要核苷酸序列編碼的長鬚羅蛉唾液多肽氨基 酸序列功能上未變化。2個胺基酸序列之間的序列同一性可使用標準參數通過NCBI (National Center for Biotechnology Information)配對blast 及blosum62 矩陣確定(見，例如"National Center for Biotechnology Information 「上可用的 BLAST 或 BLASTX 算法(NCBI， Bethesda, Md.，USA)伺服器，以及中Altschul et al.中；及因此，此文獻教導使用術語 "blasts」 的算法或 BLAST 或 BLASTX 及 BL0SUM62 矩陣)。2個核苷酸序列之間的序列同一性也可使用Myers及Miller的「Align」程序確 定("Optimal Alignments in Linear Space，，，CABIOS 4，11-17，1988)，及可在 NCBI 上確 定，以及通過網際網路的網站(例如NCBI網站)上的相同或其他程序確定。或者或另外，術語「同一性」(例如，有關核苷酸或胺基酸序列)可表示2個序列之 間的同源性的定量度量。百分率序列同源性可計算為(Nref-Ndif) * 100/Nref，其中 是比對的2個序列中非同一殘基總數，且其中是序列之一的殘基數。因此，DNA序列AGTCAGTC將與序列AATCAATC具有75 %序列同一性(Nref = 8 ；Ndif =2)。或者或另外，「同一性」(有關序列)可指有相同的核苷酸或胺基酸的位置數除以 2個序列中較短者的核苷酸或胺基酸數，其中2個序列的比對可根據Wilbur及Lipman算法 確定(Wilbur及Lipman)，例如，使用20個核苷酸的窗口尺寸，4個核苷酸的字長，及空位罰 分4，及計算機輔助的分析及包括比對的序列數據解讀可使用商業可用程序簡便進行(例 如 htelligenetics Suite, Intelligenetics Inc. CA) 當說道 RNA 序列相似，或與 DNA 序列具有一定程度的序列同一性或同源性時，認為DNA序列中的胸腺嘧啶⑴等同於RNA 序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列在本發明的範圍之內，且可通過考慮DNA序列中的胸 腺嘧啶⑴等同於RNA序列中的尿嘧啶⑶來源於DNA序列。2個胺基酸序列的序列同一性或序列相似性，或2個核苷酸序列之間的序列同一 性可使用 Vector NTI 軟體包確定 Gnvitrogen，1600Faraday Ave.，Carlsbad, CA)。有利地，序列同一性或同源性(例如胺基酸序列同一性或同源性)可使用BlastP程序確定(Altschul et al.)及可在NCBI上確定，以及通過網際網路的網站(例如NCBI網 站)上的相同或其他程序確定。根據文獻提供用於比較序列相對同一性或同源性的算法，及另外或者有關前述， 這些參考文獻中的教導可用於確定同源性或同一性百分率Needleman SB及^msch⑶； Smith TF R Waterman MS ；Smith TF, Waterman MS R Sadler JR ；Feng DF R Dolittle RF ；Higgins DG 及 Sharp PM ；Thompson JD, Higgins DG 及 Gibson TJ -,]^, Devereux J, Haeberlie P及Smithies 0。及無需過多的實驗，本領域技術人員可諮詢許多其他程序或 參考文獻用於確定同源性百分率。長鬚羅蛉多核苷酸可包括重組DNA，其被併入載體，併入自主複製質粒或病毒，或 併入原核生物或真核生物的基因組DNA，或其表現為獨立於其他序列的獨立的分子(例如， cDNA)。本文公開的重組載體可包括編碼多肽，其變體或其片段的多核苷酸。重組載體可 包括質粒及病毒載體，且可用於體外或體內表達。重組載體還可包括信號肽。信號肽是引 導蛋白(其在胞質溶膠中合成)翻譯後轉運到特定細胞器(例如核，線粒體基質，內質網， 葉綠體，質外體及過氧化物酶體)的短肽鏈(3 60個胺基酸長)。一般而言，天然存在的 唾液長鬚羅蛉多肽，例如LJM17及LJL143蛋白，可翻譯為具有N-端信號肽序列及「成熟的」 蛋白結構域的前體。信號肽可在翻譯後快速被切割下。信號序列可為自唾液蛋白的天然序 列或自分泌的蛋白的肽信號，例如自組織纖溶酶原活化劑蛋白(tPA)(尤其是人tPA)的信 號肽(S. Friezner Degen et al. ；R. Rickles et al. ；D. Berg. etal.),或自胰島素-樣生長 因子 1 (IGFl)(尤其是馬科動物 IGFl (K. Otte et al.)，犬科動物 IGFl (P. Delafontaine et al.)，貓科動物 IGFl (W003/02^86)，牛 IGFl (S. Lien et al.)，豬 IGFl (M. Muller etal.)， 雞 IGFl (Y. Kajimoto et al.)，火雞 IGFl (GenBank accession number AF074980))的信號 肽。自IGFl的信號肽可為天然的或優化的，所述優化可通過除去隱含的剪接位點及/或通 過適應密碼子利用來實現。翻譯後，未加工的多肽可在切割位點切割，產生成熟的多肽。切 割位點可使用Von Heijne (1986)的方法預測。質粒可包括DNA轉錄單位，例如使其在宿主細胞中複製的核酸序列，例如複製原 點(原核或真核)。質粒也可包括一種或多種可選擇的標記物基因及現有技術中已知的其 他遺傳元件。環狀及線性形式的質粒包括在本公開中。還一方面，本發明涉及包括多核苷酸序列的體內表達載體，其含及在宿主中體內 表達唾液長鬚羅蛉多肽及/或其變體或片段。體內表達載體可包括含目的多核苷酸或基因及那些用於其體內表達的必要元件 的任何轉錄單位。這些表達載體可為質粒或重組病毒載體。說到體內表達，啟動子可為病 毒或細胞來源的。在一實施方式中，啟動子可為巨細胞病毒(CMV)早期啟動子(CMV-IE啟 動子)，SV40病毒早期或晚期啟動子或勞斯肉瘤病毒LTR啟動子，細胞骨架基因的啟動子， 例如結蛋白啟動子(Kwissa M. et al.)，或肌動蛋白啟動子(Miyazaki J. et al.)。當幾種 基因存在於相同質粒中，它們可提供於相同轉錄單位或不同單位。本文使用的術語「質粒」可包括任何包括本發明的多核苷酸及用於其在期望宿主 細胞或靶細胞中體內表達的必要元件的DNA轉錄單位；且在這一點，需知超螺旋的或非超 螺旋的，環狀質粒，以及線性形式也旨在包括在本發明的範圍之內。質粒也可包括其他轉錄-調控元件，例如，內含子型穩定序列。幾個實施方式中，質粒可包括CMV-IE的第一內含 子(TO 89/01036)，兔β-珠蛋白基因的內含子II(van Ooyenet al.)，組織纖溶酶原活化 劑編碼的蛋白的信號序列(tPA Montgomery et al.)，及/或多聚腺苷酸化信號(多聚A)， 尤其是牛生長激素(bGH)基因的多聚A(美國5，122，458)或兔β _珠蛋白基因或SV40病 毒的多聚Α。還一方面，本發明涉及疫苗組合物，其包括(a)體內表達載體，其中載體包括編 碼一種或多種多肽的多核苷酸，所述多肽選自唾液長鬚羅蛉多肽，所述唾液長鬚羅蛉多肽 的變體或片段，及它們的混合物；及(b)藥學或獸醫學可接受的媒質，稀釋劑或賦形劑。另一方面，本發明涉及疫苗組合物，其包括(a)第一體內表達載體，其中載體包 括編碼一種或多種多肽的多核苷酸，所述多肽選自唾液長鬚羅蛉多肽，所述唾液長鬚羅蛉 多肽的變體或片段，及它們的混合物；(b)第二體內表達載體，其中載體包括編碼一種或多 種多肽的多核苷酸，所述多肽選自唾液長鬚羅蛉多肽，所述唾液長鬚羅蛉多肽的變體或片 段，及它們的混合物；及(c)藥學或獸醫學可接受的媒質，稀釋劑或賦形劑。術語「疫苗組合物」或「疫苗」包括任何組合物，一旦將其注射給宿主(包括犬科 動物，貓科動物及人)，其保護宿主免於皮膚利什曼病及/或內臟利什曼病，及/或其可預防 寄生蟲植入，及/或其可預防感染的受試者中的疾病進展，及/或其可限制失控的寄生蟲擴 散到內部器官，及/或其可避免或限制通過白蛉叮咬疫苗接種的狗期間的攝取寄生蟲。這 可根據本發明免疫接種後通過誘導細胞因子分泌(顯著地IFN-γ分泌)實現(作為測量 IFN-Y 分泌的方法例，可使用自 R&D SystemsInc.的Quailtikine immunoassay (貨號 #CAIF00)(Dj oba Siawaya JFet al.))。藥學可接受的媒質或賦形劑的使用是常規的。由E.W.Martin，Mack Publishing Co. ,Easton,PA, 15th Edition (1975)的 Remington'sPharmaceutical Sciences 描述了適 宜藥學遞送本文公開的多肽，質粒，病毒載體的組合物及製劑。通常，媒質或賦形劑的性質 將取決於所採用的施用的特定模式。例如，腸胃外製劑常包括可注射的流體，其包括藥學及 生理學可接受的流體，例如水，生理鹽水，平衡的鹽溶液，含水右旋糖，甘油等作為媒質。對 於固體組合物(例如，冷凍乾燥的錠劑，粉末，丸劑，片劑，或膠囊形式)而言，常規非毒性固 體媒質或賦形劑可包括，例如，藥品級的甘露醇，乳糖，澱粉，或硬脂酸鎂。除了生物學中性 媒質或賦形劑之外，待施用的免疫原性組合物可含少量的非毒性輔助物質，例如潤溼劑或 乳化劑，防腐劑，及PH緩衝劑等，例如乙酸鈉或單月桂酸山梨坦。本發明的疫苗可包括編碼任何上述本發明的多核苷酸的載體。可在使用不同插入位點或使用相同插入位點的相同載體中進行多插入。當使用相 同插入位點時，可將各多核苷酸插入子(其可為上述任何本發明的多核苷酸)在相同及/ 或不同啟動子控制下插入。插入可尾-尾，頭-頭，尾-頭，或頭-尾進行。也可使用IRES 元件(內部核糖體進入位點，見EP 0803573)來分離及表達可操作連接到相同及/或不同 啟動子的多個插入子。在一實施方式中，本發明涉及包括上述多核苷酸的表達載體。表達載體可為體內 表達載體，或體外表達載體。更一般而言，本發明包括體內表達載體，其包括任何含及在宿主中體內表達長鬚 羅蛉唾液多肽的多核苷酸或基因，其變體或其片段及用於其體內表達必要的元件的質粒(EP-A2-1001025 ；Chaudhuri P.)。在特異的非限制性實施例中，可將PVR1020或pVR1012質粒(VICAL Inc. ；Luke C. et al. ；Hartikka J. et al.)，pVR2001_T0PA(或pVR2001_T0P0) (Oliveira F. et al.)或 八8110(美國6，852，705)用作用於插入多核苷酸序列的載體。pVR1020質粒源於pVR1012， 且含人tPA信號序列。pVR1020是可從Vical，Inc.獲得的質粒主鏈(SanDiego，CA)，其已 之前使用，見，例如美國專利No. 6，451，769及7，078，507。如Oliveira et al.所述，質粒 PVR2001-T0P0 (或pVR2001-T0PA)是通過添加側翼於克隆位點及含編碼及表達信號分泌肽 (例如，組織纖溶酶原活化劑信號肽(tPA))的拓撲異構酶(其增加產生分泌的蛋白的可能 性)來修飾的pVR1020(見Oliveira F. etal.中的圖1)。各質粒可包括或含或基本上組成於可操作連接到啟動子或在啟動子控制下或依 賴於啟動子的本發明的多核苷酸，其中啟動子可有利地相鄰於期望表達的多核苷酸。通 常，採用在真核細胞中有功能的強啟動子是有利的。有用的啟動子的一例可為人或鼠來源 的立即早期巨細胞病毒啟動子(CMV-IE)，或其可任選具有其他來源，例如自大鼠或豚鼠。 CMV-IE啟動子可包括實際啟動子部分，其可或可不相關於增強子部分。可參考EP 260148， EP 323597，美國 5，168，062，5，385，839，及 4，968，615，以及 WO 87/03905。CMV-IE 啟動子 可有利地為人CMV-IE(Boshart M. et al.)或鼠CMV-IE。更通常而言，啟動子可為病毒或 細胞來源的。可有用地應用於本發明的實施的強病毒啟動子(而非CMV-IE)是SV40病毒 的早期/晚期啟動子或勞斯肉瘤病毒的LTR啟動子。可有用地應用於本發明的實施的強 細胞啟動子是細胞骨架基因啟動子，例如結蛋白啟動子(Kwissa M. et al.)，或肌動蛋白啟 動子(Miyazaki J. et al.)。這些啟動子的功能性亞片段，即，保持足夠的啟動子活性的 這些啟動子的一部分包括在本發明之內，例如根據WO 98/00166或美國6，156，567的截短 的CMV-IE啟動子，且可用於本發明的實施。有用於本發明的實施的啟動子可包括保持足 夠的啟動子活性及因此發揮啟動子功能的全長啟動子的衍生物及/或亞片段，及其可有利 地具有基本上相似於衍生出衍生物或亞片段的實際或全長啟動子的啟動子活性，例如美國 6，156，567的近於截短的CMV-IE啟動子活性，相比全長CMV-IE啟動子活性。因此，本發明 的實施中的CMV-IE啟動子可包括或基本上組成於或組成於全長啟動子的啟動子部分及/ 或全長啟動子的增強子部分，以及它們的衍生物及/或亞片段。有利地，質粒包括或基本上組成於其他表達控制元件。合併穩定序列，例如內含 子序列，例如，hCMV-IE的第一內含子(W089/01036)，兔β -珠蛋白基因的內含子II (van Ooyen et al.)是尤其有利的。對於質粒及除了痘病毒之外的病毒載體的多聚腺苷酸化(多 聚A)信號，可使用牛生長激素(bGH)基因的多聚A信號(見美國5，122，458)，或兔β-珠 蛋白基因的多聚A信號或SV40病毒的多聚A信號。在本發明的一實施方式中，質粒載體是包括LJM17多核苷酸的PVR2001，如本文實 施例1所述。本發明的另一實施方式中，質粒載體是包括LJL143多核苷酸的pVR2001，如本文 實施例2所述。本發明的另一實施方式中，質粒載體是PNB0002，如本文實施例9所述。本發明的又一實施方式中，質粒載體是PNB0003，如本文實施例10所述。更一般而言，本發明包括體內表達載體，其包括任何含編碼一種或多種唾液長鬚羅蛉免疫原及/或其變體或片段的多核苷酸或基因的重組病毒載體，包括任何用於其體內 表達的必要元件。所述重組病毒載體可選自，例如，痘病毒，尤其是禽痘病毒，例如雞痘病毒或金絲 雀痘病毒。在一實施方式中，雞痘病毒是TROVAC (見WO 96/40241)。另一實施方式中，金絲 雀痘病毒載體是ALVAC。使用這些重組病毒載體及插入目的多核苷酸或基因完整描述於， 對於雞痘是美國5，174，993 ；美國5，505，941及美國5，766，599，及對於金絲雀痘是美國 5，756，103。病毒基因組內多於一個插入位點可用於插入多個目的基因。在一實施方式中，病毒載體是腺病毒，例如人腺病毒(HAV)或犬科動物腺病毒 (CAV)。另一實施方式中，病毒載體是人腺病毒，特異為血清型5腺病毒，通過病毒基因組 的El區缺失而無能力複製，尤其是從約核苷酸459至約核苷酸3510 (參照Genbank中登錄 號M73260及參考的出版物Chroboczek et al，1992中公開的hAd5序列)。缺失的腺病毒 在表達El的293細胞(Graham et al.，1977)或PER細胞，尤其是PER. C6細胞(Falloux et al. ,1998)中繁殖。人腺病毒可另外缺失E3區，尤其是從約核苷酸觀592至約核苷酸 30470。缺失El區可與缺失E3區組合進行(見，例如Shriver et al. ；Graham et al. ；Ilan et al.；美國專利 No. 6，133，028 及 6，692，956 ;Tripathy et al. ；Tapnell ；Danthinneet al. ；Berkner ；Berkner et al. ；Chavier et al.)。部分或完全缺失 El 及 / 或 E3 區之後， 插入位點可最終為El及/或E3座位(區)。有利地，當表達載體是腺病毒，插入待表達的 多核苷酸在真核細胞中有功能的啟動子控制下，所述啟動子例如為強啟動子，有利地為巨 細胞病毒立即-早期基因啟動子(CMV-IE啟動子)，尤其是從約核苷酸-734至約核苷酸+7 的增強子/啟動子區(Boshart et al.)，或自！Iomega Corp的pCI載體的增強子/啟動 子區。CMV-IE啟動子有利地為鼠或人來源的。也可使用延伸因子Ia啟動子。也可使用 肌肉特異啟動子(Li et al.)。有關質粒載體，本文也討論強啟動子。在一實施方式中，剪 接序列可位於增強子/啟動子區下遊。例如，內含子1分離自CMV-IE基因(Stenberg et al.)，分離自兔或人珠蛋白基因的內含子，尤其是自珠蛋白基因的內含子2，分離自 免疫球蛋白基因的內含子，自SV40早期基因的剪接序列或分離自自Promege Corp的pCI 載體的嵌合內含子序列。可將多聚A序列及終止子序列插入到待表達的多核苷酸下遊，例 如牛生長激素基因，尤其是Genbank登錄號B0VGHRH的從約核苷酸2339至約核苷酸2550， 兔珠蛋白基因或SV40晚期基因多聚腺苷酸化信號。另一實施方式中，病毒載體是犬科動物腺病毒，尤其是CAV_2(見，例如Fischer et al.；美國專利No. 5，529，780及5，688，920 ；W095/14102)。對於CAV而言，插入位點可在E3 區內及/或位於E4區與右ITR區之間的區(見美國專利No. 6，090，393及6，156,567)。在 一實施方式中，插入子在啟動子控制下，例如巨細胞病毒立即-早期基因啟動子(CMV-IE啟 動子)或已描述的人腺病毒載體啟動子。可將多聚A序列及終止子序列插入到待表達的多 核苷酸下遊，例如牛生長激素基因或兔珠蛋白基因多聚腺苷酸化信號。另一實施方式中，病毒載體是皰疹病毒，例如犬科動物皰疹病毒(CHV)或貓科動 物皰疹病毒(FHV)。對於CHV而言，插入位點可在胸腺嘧啶激酶基因內，在0RF3內，或在 UL430RF內(見美國6，159，477)。在一實施方式中，插入待表達的多核苷酸到在真核細胞 中有功能的啟動子的控制下，有利地為CMV-IE啟動子(鼠或人)。可將多聚A序列及終止子序列插入到待表達的多核苷酸下遊，例如牛生長激素或兔珠蛋白基因多聚腺苷酸化信號。就基於痘病毒載體的重組載體而言，可使用牛痘病毒或減毒的牛痘病毒，(例 如，MVA，安卡拉疫苗株在雞胚胎成纖維細胞上傳多於570代後獲得的修飾的安卡拉株； 見 Mickl&Hochstein-Mintzel ；Sutter et al.；可獲自 ATCC VR-1508 ；或 NYVAC，見美 國5，494，807，及美國專利No. 5，494，807，其中討論了 NYVAC的構建，以及用從哥本哈根 株牛痘病毒基因組缺失額外的ORF的NYVAC變異，以及異源編碼核酸分子插入到此重組 位點，而且，使用匹配的啟動子；也見WO 96/40241)，禽痘病毒或減毒的禽痘病毒(例如金 絲雀痘，雞痘，斑鳩痘，鴿痘，鵪鶉痘，ALVAC或TROVAC ；見，例如美國專利No. 5，505, 941， 5，494，807)。減毒的金絲雀痘病毒描述於美國5，756，103 (ALVAC)及WO 01/05934。也參考 涉及減毒的雞痘株TROVAC的美國5，766，599。參考可獲自ATCC登錄號VR-Ill的金絲雀 痘。也可用多種雞痘病毒免疫接種株，例如MERIAL出售的DIFTOSEC CT株及INTERVET出 售的NOBILIS VARI0LE疫苗。就用於產生其重組體及如何施用其重組體的方法信息而言， 本領域技術人員可參考本文引用的文獻及參考WO 90/12882，例如就牛痘病毒而言，以上美 國專禾Ij No. 4，769，330，4，722，848，4，603，112，5，110，587，5，494，807，及 5，762，938 有提 及；就雞痘而言，以上美國專利No. 5，174，993，5，505，941及5，766，599有提及；就金絲雀 痘而言，以上美國專利No. 5，756，103有提及。當表達載體是牛痘病毒時，多核苷酸或待表 達的多核苷酸的插入位點有利地在胸腺嘧啶激酶(TK)基因或插入位點，血凝素(HA)基因 或插入位點，編碼A型包含體的區(ATI)；也見本文引用的文獻，尤其是涉及牛痘病毒的那 些。對於金絲雀痘情況，插入位點有利地為ORF C3，C5及/或C6;也見本文引用的文獻，尤 其是涉及金絲雀痘病毒的那些。對於雞痘的情況，插入位點有利地為ORF F7及/或F8;也 見本文引用的文獻，尤其是涉及雞痘病毒的那些。MVA病毒的插入位點有利地見於各種出版 物，包括 Carroll Μ. W. et al. ；Stittelaar K. J. et al. ；Sutter G. et al.；及,在這一點， 也需知，完整的MVA基因組描述於Antoine G.，Virology，其能使本領域技術人員使用其他 插入位點或其他啟動子。有利地，將待表達的多核苷酸插入到特異痘病毒啟動子控制下，例 如以上牛痘啟動子7. 5kDa(Cochran et al.)，牛痘啟動子I3L (Riviere et al.)，牛痘啟動 子 HA (Shida)，牛痘啟動子 ATI (Funahashi et al.)，牛痘啟動子 H6 (Taylor J. et al. ；Guo P. et al. J. ；Perkus Μ. et al.)。進一步實施方式中，重組病毒載體是表達長鬚羅蛉唾液LJM17多肽的重組ALVAC 金絲雀痘病毒vCP2390-SEQ ID NO :6，如實施例3所述。進一步實施方式中，重組病毒載體是表達長鬚羅蛉唾液LJM17多肽的重組ALVAC 金絲雀痘病毒VCP2390，如實施例11所述。進一步實施方式中，重組病毒載體是表達長鬚羅蛉唾液LJL143多肽的重組ALVAC 金絲雀痘病毒vCP2389-SEQ ID NO :2，如實施例4所述。進一步實施方式中，重組病毒載體是表達長鬚羅蛉唾液LJL143多肽的重組ALVAC 金絲雀痘病毒VCP2389，如實施例12所述。進一步實施方式中，重組病毒載體是表達長鬚羅蛉唾液LJM17多肽的重組MVA病 毒MVA-LJMl7，如實施例5所述。進一步實施方式中，重組病毒載體是表達長鬚羅蛉唾液LJL143多肽的重組MVA病毒MVA-LJL143，如實施例6所述。本文公開的任何多核苷酸可通過DNA轉移或表達載體到適宜宿主細胞中來體外 表達。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。術語"宿主細胞"也包括任何受試者宿主 細胞的後代。現有技術中已知穩定轉移的方法，意指在宿主細胞中連續維持外源多核苷 酸。宿主細胞可包括細菌(例如，大腸桿菌)，酵母，昆蟲細胞，及脊椎動物細胞。現有技 術中熟知在真核細胞中表達DNA序列的方法。就體外表達方法而言，可將重組杆狀病毒 載體用於本文公開的核酸(例如，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV))。例如，可在昆 蟲細胞(例如，草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞，如ATCC登錄號CRL 1711的 Sf9細胞，或Sf21細胞)中利用多角體蛋白啟動子(見例如，Smithet al. ；Pennock et al. ；Vialard et al. ；Verne. ；O' Reilly et al. ；Kidd I. M. &Emery V. C. ；EP 0370573 ； EP 0265785 ；美國 4，745，051)。對於表達，可使用自 Pharmingen 的 BaculoGold Starter Package (Cat#21001K) (Becton Dickinson)。就體外表達方法而言，可將重組大腸桿菌用於 載體。例如，當在細菌系統中克隆時，可使用可誘導的啟動子，例如阿拉伯糖啟動子，λ噬 菌體的pL，plac, ptrp，ptac (ptrp-lac雜交體啟動子)等。用重組DNA轉化宿主細胞可通 過本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主是原核宿主，例如大腸桿菌時，能攝取DNA 的感受態細胞可從指數生長期之後收穫、及隨後通過使用現有技術中已知的過程的CaC12 方法處理的細胞製備。或者，可使用MgC12或Rb Cl。轉化也可通過電穿孔進行。當宿主是 真核生物時，可使用的DNA轉導方法例如有磷酸鈣共沉澱，常規機械過程，例如微注射，電 穿孔，插入包裝進脂質體的質粒，或病毒載體。真核細胞也可與長鬚羅蛉多核苷酸序列，及 編碼可選擇的表型的第二外源DNA分子(例如單純皰疹胸腺嘧啶激酶基因)共轉化。另一 方法是使用真核病毒載體(見上)，例如皰疹病毒或腺病毒(例如，犬科動物腺病毒2)，以 瞬時轉導真核細胞及表達蛋白(Gluzman EA)。此外，可利用轉染劑，例如二油醯基-磷脂醯 基-乙醇胺(DOPE)。重組表達的多肽的分離及純化可通過常規手段進行，包括製備性層析(例如，大 小排阻層析，離子交換層析，親和層析)，選擇性沉澱及超濾。可使用現有技術中的例，但不 限於，可見於 Simon Roe 編輯的 「Protein Purification Applications」，第二版，且及可 從Oxford University Press得到。此重組表達多肽是本公開的一部分。也包括本發明的 上述任何多肽的產生方法，尤其是使用包括本文公開的多核苷酸的重組表達載體及宿主細 胞。含本發明的重組病毒載體的疫苗可有利地為與穩定劑冷凍乾燥的。冷凍乾燥可 根據熟知的標準冷凍乾燥過程進行。藥學或獸醫學可接受的穩定劑可為碳水化合物(例 如山梨醇，甘露醇，乳糖，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖，海藻糖)，穀氨酸鈉(Tsvetkov T et al.； Israeli E etal.)，蛋白，例如蛋白腖，白蛋白，乳清蛋白或酪蛋白，含蛋白的劑，例如脫脂 乳(Mills C K et al. ；Wolff E et al.)，及緩衝液(例如磷酸緩衝液，鹼金屬磷酸鹽緩衝 液)。佐劑可用於製備可溶性冷凍乾燥的製劑。本發明的任何疫苗組合物也可有利地含一種或多種佐劑。基於質粒的疫苗可與陽離子脂質配製，有利地與DMRIE (N- (2-羥基乙基)_N，N- 二 甲基-2，3-雙(十四氧基)-1-戊烷銨；W096/34109)配製，及有利地與中性脂質相關，例如 DOPE(二油醯基-磷脂醯基-乙醇胺；Behr J. P.)，以形成DMRIE-DOPE。在一實施方式中，臨時製備混合物，及對於合適的混合物絡合而言，在施用之前，等待約10分鐘至約60分鐘 是有利的，例如，約30分鐘。當使用DOPE時，DMRIE/D0PE摩爾比可為95/5 5/95，及有利 地為1/1。質粒/DMRIE或DMRIE-D0PE佐劑的重量比為例如，50/1 1/10，10/1 1/5或 1/1 1/2。可任選將細胞因子添加到組合物，尤其是誘導Thl的GM-CSF或細胞因子(例 如IL12)。可將這些細胞因子添加到組合物作為編碼細胞因子蛋白的質粒。在一實施方 式中，細胞因子為犬科動物來源的細胞因子，例如犬科動物GM-CSF，其基因序列已登錄在 GenBank資料庫(登錄號S49738)。此序列可用於以類似於WO 00/77210中所述的方式構 建所述質粒。基於重組病毒載體的疫苗可與fMLP(N_甲醯基-甲硫氨醯基-亮氨醯基-苯丙氨 酸；美國 6，017，537)及 / 或卡波姆佐劑(Phameuropa Vol. 8，No. 2，June 1996)組合。本領 域技術人員也可參考美國2，909，462，其中描述了與聚羥基化的化合物交聯的此丙烯酸聚 合物，所述聚羥基化的化合物具有至少3個羥基基團，有利地不多於8個羥基，至少3個羥 基的氫原子被不飽和的具有至少2個碳原子的脂肪族自由基取代。例如，自由基是含2 4 個碳原子的自由基，例如乙烯，烯丙基及其他烯類(ethylenically)不飽和的基團。不飽和 的自由基可本身含其他取代基，例如甲基。商品名為Carbopol 的產品(BF Goodrich, Ohio，美國)是合適的。產品與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇交聯。其中，可有利地具有 提及的Carbopol 974P，934P 及 971P。
權利要求
1.疫苗組合物，其包括(a)表達載體，其中所述載體包括編碼一種或多種多肽的多核苷酸，所述多肽選自唾液 長鬚羅蛉多肽，所述唾液長鬚羅蛉多肽的變體或片段，及它們的混合物；及(b)藥學或獸醫學可接受的媒質，稀釋劑或賦形劑。
2.權利要求1的疫苗，其中所述表達載體選自pVR2001-T0P0、pVR2001-TOPA, PVR1020、pVR1012、pABllO、ALVAC、TROVAC, MVA、及杆狀病毒載體。
3.權利要求1的疫苗，其中所述多核苷酸編碼與具有SEQID N0:l、3、5、7、ll、13、15或 17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽。
4.權利要求1的疫苗，其中所述多核苷酸與編碼具有SEQID N0:l、3、5、7、ll、13、15或 17所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性。
5.權利要求1的疫苗，其中所述多核苷酸與具有SEQID N0:2、4、6、8、12、14、16、18、 21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。
6.權利要求1的疫苗，其中所述載體選自pVR2001LJM17(SEQIDNO :9)、 pVR2001LJL143(SEQ ID NO :10)、vCP2390 (SEQID NO :93 或 SEQ ID NO :92)、vCP2389 (SEQ ID NO :94)、MVA-LJM17、MVA-LJL143、pNB0002(SEQ ID NO : 19)、pNB0003 (SEQ ID NO :20)、 vCP2390-SEQ ID NO :6、vCP2389_SEQ ID NO :2、及它們的混合物。
7.疫苗組合物，其包括(a)第一表達載體，其中所述載體包括編碼一種或多種多肽的多核苷酸，所述多肽選 自唾液長鬚羅蛉多肽，所述唾液長鬚羅蛉多肽的變體或片段，及它們的混合物；(b)第二表達載體，其中所述載體包括編碼一種或多種多肽的多核苷酸，所述多肽選 自唾液長鬚羅蛉多肽，所述唾液長鬚羅蛉多肽的變體或片段，及它們的混合物；及(c)藥學或獸醫學可接受的媒質，稀釋劑或賦形劑。
8.權利要求7的疫苗，其中所述表達載體選自pVR2001-T0P0、pVR2001-TOPA, PVR1020、pVR1012、pABllO、ALVAC、TROVAC, MVA、及杆狀病毒載體。
9.權利要求7的疫苗，其中所述多核苷酸編碼與具有SEQID NO :1、3、5、7、11、13、15或 17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽。
10.權利要求7的疫苗，其中所述多核苷酸與編碼具有SEQIDNO :1、3、5、7、11、13、15或 17所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性。
11.權利要求7的疫苗，其中所述多核苷酸與具有SEQID N0:2、4、6、8、12、14、16、18、 21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。
12.權利要求7的疫苗，其中所述第一或第二表達載體選自pVR2001LJM17(SEQID NO :9)、pVR2001LJL143(SEQ ID NO 10)、vCP2390 (SEQ ID NO :93 或 SEQ ID NO :92)、 vCP2389 (SEQID NO :94)、MVA-LJMl7, MVA-LJL143, pNB0002 (SEQ ID NO :19)、pNB0003 (SEQ ID NO :20)、vCP2390-SEQ ID NO :6、vCP2389_SEQ ID NO :2、及它們的混合物。
13.疫苗組合物，其包括(a)唾液長鬚羅蛉多肽，所述唾液長鬚羅蛉多肽的變體或片段，或者它們的混合物；及(c)藥學或獸醫學可接受的媒質，稀釋劑或賦形劑。
14.權利要求13的疫苗，其中所述長鬚羅蛉多肽包括與具有SEQIDNO :1、3、5、7、11、 13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
15.權利要求1 14中任一項的疫苗，其中所述疫苗還包括至少一種利什曼原蟲抗原。
16.權利要求15的疫苗，其中所述利什曼原蟲抗原是KMP11。
17.權利要求15的疫苗，其中所述利什曼原蟲抗原是滅活的利什曼原蟲。
18.載體，其包括選自下列的一種或多種多核苷酸(a)編碼與具有SEQID N0:l、3、5、7、ll、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80% 序列同一性的多肽的多核苷酸；(b)與編碼具有SEQID N0:l、3、5、7、ll、13、15或17所示的序列的多肽的多核苷酸具 有至少70%序列同一性的多核苷酸；及(b)與具有 SEQ ID N0:2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90 或 91 所示的序列的多核 苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；其中所述載體是體內表達載體或體外表達載體。
19.權利要求18的載體，其中所述載體是杆狀病毒載體。
20.權利要求18的載體，其中所述載體是質粒。
21.權利要求18的載體，其中所述載體是病毒載體。
22.宿主細胞，其被權利要求18的載體轉化。
23.疫苗接種易感利什曼原蟲的受試者的方法，包括施用至少一次權利要求1 17中 任一項的疫苗。
24.權利要求23的方法，其中所述受試者是人、犬科動物或貓科動物。
25.疫苗接種易感利什曼原蟲的受試者的方法，包括初次-助推施用方案；之後助推施 用疫苗。
26.權利要求25的方法，其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在藥學或獸醫學可接受的媒質，稀釋劑 或賦形劑中包括含多核苷酸的質粒，所述多核苷酸用於體內表達唾液長鬚羅蛉多肽，所述 唾液長鬚羅蛉多肽的變體或片段，或者它們的混合物；及其中所述助推施用疫苗，所述疫苗在藥學或獸醫學可接受的媒質或賦形劑中包括含多 核苷酸的重組病毒載體，所述多核苷酸用於體內表達相同唾液長鬚羅蛉多肽、其變體、其 片段，以保護所述受試者免於利什曼病及/或預防感染的受試者的疾病進展。
27.權利要求25的方法，其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在藥學或獸醫學可接受的媒質，稀釋劑 或賦形劑中包括含多核苷酸的重組病毒載體，所述多核苷酸用於體內表達唾液長鬚羅蛉 多肽，所述唾液長鬚羅蛉多肽的變體或片段，或者它們的混合物；及其中所述助推施用疫苗，所述疫苗在藥學或獸醫學可接受的媒質或賦形劑中包括含多 核苷酸的質粒，所述多核苷酸用於體內表達相同唾液長鬚羅蛉多肽、其變體、其片段，以保護所述受試者免於利什曼病及/或預防感染的受試者的疾病進展。
28.權利要求25的方法，其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在藥學或獸醫學可接受的媒質，稀釋劑 或賦形劑中包括含多核苷酸的重組病毒載體，所述多核苷酸用於體內表達唾液長鬚羅蛉 多肽，所述唾液長鬚羅蛉多肽的變體或片段，或者它們的混合物；及其中所述助推施用疫苗，所述疫苗在藥學或獸醫學可接受的媒質或賦形劑中包括相 同唾液長鬚羅蛉多肽，其變體，其片段，以保護所述受試者免於利什曼病及/或預防感染的受試者的疾病進展。
29.權利要求23 觀中任一項的方法，其中所述唾液長鬚羅蛉多肽是LJL143多肽或 LJMl7多肽。
30.診斷受試者的利什曼原蟲感染的方法，包括(a)接觸包括至少3、6或10個多肽的固體基材，其中所述多肽中的每一種包括SEQID NO :1、3、5、7、11、13、15或17所示的一種胺基酸序列，或其免疫原性片段；(b)使所述固體基材與獲自所述受試者的樣品接觸；及(c)檢測所述樣品成分與所述固體基材上的至少一個多肽的結合，其中所述成分與所 述基材的結合的檢測指示所述受試者感染利什曼原蟲，由此診斷所述受試者的利什曼原蟲 感染。
31.分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(a)與具有SEQ ID N0:2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90 或 91 所示的序列的多核 苷酸具有至少70%序列同一性的核苷酸序列；(b)編碼與具有SEQID NO :1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80% 序列同一性的多肽的核苷酸序列；或(c)與編碼具有SEQID N0:l、3、5、7、ll、13、15或17所示的序列的多肽的多核苷酸具 有至少70%序列同一性的多核苷酸。
32.權利要求31的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括與具有SEQIDNO :2、4、6、8、12、 14、16、18、21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的核苷酸序 列。
33.權利要求31的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括編碼與具有1、3、5、7、11、13、15或 17所示的序列的多肽具有至少90%序列同一性的多肽的核苷酸序列。
34.基本上純化的唾液長鬚羅蛉多肽，其中所述多肽包括(a)與具有SEQID N0:l、3、5、7、ll、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列 同一性的胺基酸序列；(b)SEQID NO :1、3、5、7、11、13、15或17所示的胺基酸序列的保守變體;(c)包括SEQID NO :1、3、5、7、11、13、15或17所示的胺基酸序列的至少8個連續氨基 酸的免疫原性片段，其與特異性結合SEQ ID N0:l、3、5、7、ll、13、15或17所示的胺基酸序 列的抗體特異性結合；或(d)SEQID N0:l、3、5、7、ll、13、15或17所示的胺基酸序列，且其中給受試者施用所述多肽產生對長鬚羅蛉的免疫應答。
35.權利要求34的多肽，其中所述多肽包括與具有SEQID NO :1、3、5、7、11、13、15或 17所示的序列的多肽具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
36.權利要求34的多肽，其中所述多肽包括免疫原性片段，其包括SEQID NO :1、3、5、 7、11、13、15或17所示的胺基酸序列的至少8個連續胺基酸的，其與特異性結合具有SEQ ID NO :1、3、5、7、11、13、15或17所示的胺基酸序列的多肽的抗體特異性結合。
37.抗體，其與權利要求34的多肽特異性結合。
全文摘要
本發明提供含及體內或體外表達誘發動物或人針對利什曼原蟲的免疫應答的白蛉長鬚羅蛉唾液抗原的載體，包括所述載體及/或長鬚羅蛉唾液多肽的疫苗組合物，針對利什曼原蟲免疫接種的方法，及用於此方法及組合物的試劑盒。
文檔編號C07K16/18GK102066411SQ200980123626
公開日2011年5月18日 申請日期2009年5月6日 優先權日2008年5月8日
發明者J·G·瓦倫祖埃拉, L·B·費希爾 申請人:梅裡亞有限公司, 由衛生與公眾服務部代表的美利堅合眾國政府