一株凝結芽孢桿菌及其在動物消化道中後腸段模擬裝置中厭氧代謝、產乳酸的快捷鑑定的製作方法

2023-12-10 06:37:57 1

一株凝結芽孢桿菌及其在動物消化道中後腸段模擬裝置中厭氧代謝、產乳酸的快捷鑑定的製作方法
【專利摘要】一株凝結芽孢桿菌及其在動物消化道中後腸段模擬裝置中厭氧代謝、產乳酸的快捷定性、定量鑑定法，屬於微生物應用【技術領域】。一株凝結芽孢桿菌，其分類名為：凝結芽孢桿菌（Bacilluscoagulans）PFK1102A，該菌是革蘭氏陽性桿菌，端生芽孢，菌落邊緣整齊，兼性厭氧或者好氧，最適生長溫度37～45℃，最適pH為5.5～7.5。該菌能在有氧條件下產芽孢，也能在發酵過程中代謝乳酸；還在類似動物消化道中後腸段裝置中厭氧代謝、產乳酸。一種模擬動物消化道中後腸厭氧環境的裝置，由密封塞、液體石蠟層、培養基和玻璃瓶4部分組成，可用於微生態製劑菌種的鑑定及微生物在動物消化道中後腸段厭氧代謝、產乳酸的鑑定。
【專利說明】一株凝結芽孢桿菌及其在動物消化道中後腸段模擬裝置中厭氧代謝、產乳酸的快捷鑑定
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物應用【技術領域】，涉及一種能在體外環境下模擬動物消化道中後腸段厭氧環境的並用於微生態製劑菌株鑑定的簡易裝置，特別是涉及一種凝結芽孢桿菌在動物消化道中後腸段模擬裝置中厭氧代謝、產乳酸的快捷篩選和鑑定的定性、定量方法。
【背景技術】
[0002]微生態製劑領域中的活菌製劑類飼料添加劑，具有調節腸道功能紊亂、維持腸道內菌群平衡、促進生長和提高機體免疫力等作用，且能夠減少服用抗生素帶來的耐藥性、二重感染及藥物殘留等問題，已被廣泛地應用於畜牧及水產養殖業。活菌製劑類飼料添加劑所涉及的微生物菌株種類繁多，包括各種芽孢桿菌、乳酸桿菌、糞鏈球菌、屎鏈球菌、雙歧桿菌、酵母菌等；但作為一種飼料添加劑，首先必須對高溫制粒等飼料加工工藝有足夠的抵抗力，而各類有益微生物菌株中只有芽孢桿菌的芽孢製劑才具備此能力，所以，多年來真正得到廣泛應用的活菌製劑類飼料添加劑是枯草、地衣、蠟樣等芽孢桿菌(包海泉，2004 ;付殿國和徐明，2005 ;莊俊峰等，2006 ;曹曉敏，2009)。
[0003]菌株的篩選和活性的測定是活菌製劑類飼料添加劑研究、開發中的關鍵問題之一，決定微生態製劑的使用效果。此領域目前研究工作的現狀是圍繞著菌株是否能耐胃酸、 耐高膽鹽、耐抗生素(趙新海，2003 ;閔鍾熳，2007 ;曹曉敏，2009)，是否具有對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等有害微生物的抑菌圈(閔鍾熳，2007 ;曹曉敏，2009)，是否可以發酵產酶(龍燕，2007 ;曹曉敏，2009 ;羅碧毅等，2009)等方面展開。雖然這些篩選菌株的指標是一株優秀的微生態製劑菌株所必備的，但有一個前提條件無人問津，那就是菌株在動物消化道發揮主要作用的「中後腸段」之厭氧環境中能否進行正常的生理代謝。一株再好的菌株如果不能夠在動物腸道中後段的厭氧環境中進行正常代謝活動，那麼此菌株又怎能去抑制有害菌？怎能產酶去促進消化？怎能去發揮提高免疫力等等益生作用？另一方面，可在動物消化道中後腸段厭氧代謝的益生菌，最好且為行業所公認的代謝產物之一是乳酸等。所以，活菌製劑類飼料添加劑在抗逆性強這一先決條件的基礎上，若要發揮除「微生物奪氧」以外更多的益生作用而實現使用效果得到大幅度提高的產業升級目的，其前提之一是篩選出能夠在動物消化道中後腸段擁有可厭氧代謝、產乳酸等特徵的有益微生物菌株。為此，需要一套能夠模擬動物腸道中後段無氧環境的簡便裝置，並藉此進行益生菌株的厭氧代謝、產乳酸等定性、定量的篩選和鑑定工作。
凝結芽孢桿菌在我國是一種相對新`興的活菌製劑類飼料添加劑可使用菌株，它既具備乳酸桿菌耐酸、厭氧代謝、產乳酸的一切優良特徵，又具備芽孢桿菌耐高溫、耐酸等特徵。凝結芽孢桿菌可以以芽孢形式順利克服飼料制粒的高溫破壞並通過胃酸環境，進入到腸道後會進行腸道繁殖消耗游離氧，還可以厭氧代謝產乳酸而直接抑制有害菌等，較之不產酸的芽孢桿菌更益於恢復腸道微生態平衡。凝結芽孢桿菌還能通過對動物消化道菌群和體內消化酶的影響，提高動物自身對體內營養物質的消化吸收能力。因此它有望成為活菌製劑類飼料添加劑領域的產業升級菌株，代表了一種發展方向。
[0004]本發明提供一株凝結芽孢桿菌，同時提供一種模擬動物腸道中後腸段厭氧環境的簡易裝置，建立一個微生態製劑在動物消化道中後腸段厭氧代謝產物的快捷鑑定方法，並建立一套完整的用於口服微生態製劑菌種篩選和鑑定的定性、定量方法，旨在提高微生態製劑菌種篩選的效率，提高微生態製劑的可實用性，為動物微生態製劑產業升級奠定基礎。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種模擬動物中後腸段厭氧環境的簡易裝置。
簡易裝置如圖1所示，由4部分組成:I密封塞，2液體石蠟密封層，3培養基，4玻璃瓶。 此裝置可有效提供厭氧環境，具體操作如下:密封塞是用矽膠塞和封口膜組成，液體石蠟為無菌液體，培養基為MRS培養基加入0.1~0.2% (w/V)的硫代乙醇酸鈉(HSCH2C00Na)和少量美藍指示劑的混合液，玻璃瓶為醫用點滴瓶。硫代乙醇酸鈉是一種還原劑，加入培養基中，能除去其中的氧或還原性物質，提供厭氧環境。培養基中加入少量美藍液作為氧化還原的指示劑，在無氧條件下，美藍被還原成無色；反之，培養基呈藍色說明有氧氣存在。
本發明與現有技術相比存在以下優點:
1、提供了一種簡易裝置模擬動物消化道中後腸段厭氧環境，本發明成本低廉，操作簡單。
2、本發明是模擬微生物在動物消化道中後腸段的生長代謝活動，可有效檢測微生物在厭氧環境中的代謝產物。
[0006]本發明還提供一株能夠在厭氧條件下發酵葡萄糖生產乳酸的凝結芽孢桿菌。
[0007]本發明提供的凝結芽孢桿菌菌株(Bacillus coagulans)的名稱為PFK1102A。
[0008]本發明提供的凝結芽孢桿菌菌株(Bacillus coagulans)於2012年4月24日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，具體地址位於北京市朝陽區北辰西路I 號院3號，保藏編號為:CGMCC NO 6047。
凝結芽孢桿菌PFKl 102A是一株革蘭氏陽性桿菌，端生芽孢，在YPD和MRS培養基上生長良好，48 hr形成直徑2~3mm大小的圓形菌落，菌落呈白色有光澤，邊緣整齊；好氧或兼性厭氧，最適生長溫度37~45°C,最適pH為5.5~7.5。
[0009]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1是簡易裝置的示意圖。其中I密封塞，2液體石蠟，3玻璃瓶，4培養基。
圖2是凝結芽孢桿菌PFKl 102A在簡易裝置中的生長曲線。
[0010]【具體實施方式】
[0011]實施例1、簡易裝置的設計
(I)簡易裝置的設計
[0012]如圖1所示，此簡易裝置由4部分組成:1密封塞，2液體石蠟密封層，3玻璃瓶，4 培養基。密封塞採用矽膠塞加封口膜密封，液體石蠟為無菌液體，培養基為MRS培養基加入
0.1~0.2% (w/V)的硫代乙醇酸鈉和少量美藍指示劑的混合液，玻璃瓶為醫用點滴瓶。
培養基和液體石蠟分別在115 °C高溫下滅菌20 min，冷卻待用；接種時，先用無菌吸管按3~5%的接種量接種種子液，在加入無菌液體石蠟液封，最後用密封塞密封，置於恆溫培養箱中靜止培養。[0013](2)厭氧條件的發生
硫代乙醇酸鈉(HSCH2C00Na)是一種還原劑，加入培養基中，能除去其中的氧或還原性物質，提供厭氧環境。培養基中加入少量美藍液作為氧化還原的指示劑，在無氧條件下，美藍被還原成無色；反之，培養基呈藍色說明有氧氣存在。
在MRS培養基中加入0.1 %的硫代乙醇酸鈉，再加入少量美藍作為指示劑，115 °C滅菌 20 min待用。
[0014]實施例2、菌種的篩選與分離
在湖南長沙某屠宰場採取豬腸道糞便樣品。將樣品製成懸浮液，37 °C經富集培養24 hr後，置於80 °C水浴中加熱15 min，殺死不形成芽孢的菌體。搖勻後稀釋塗平板，並利用芽孢生長培養基進行劃線法分離純化，根據菌落大小選取生長良好的菌落反覆接種篩選， 直至得到均勻單個菌落，命名為PFKl 102A。
[0015]實施例3、菌株PKF1102A在簡易厭氧裝置中的培養
斜面種子培養:取一環菌泥劃線於營養肉汁瓊脂培養基上，於42°C下培養24 hr ； 種子搖瓶培養:取一環斜面接種裝有25 ml MRS培養基的250 ml三角瓶中，42 °C, 150 r/min培養24 hr，成為一級種子液；
[0016]搖瓶發酵培養:以5%接種量將一級種子液接入裝有100 ml MRS培養液的500 ml 三角瓶中，42°C，200 r/min培養24 hr，成為二級種子；
[0017]厭氧發酵培 養:將二級種子以3~5%的接種量接入裝有200 ml發酵培養基的簡易厭氧裝置中，接種後，加入適量滅菌的液體石蠟密封，杜絕空氣與培養基接觸。用密封塞將培養瓶的瓶口密封后，將裝置置於42 °C培養箱中靜止培養，定時取樣測定其0D600，結果如圖2所示，靜止培養24 hr後，菌株PFK1102A有明顯的生長現象，靜止培養168 hr後 0D600超過1，菌株PFK1102A能夠在動物消化道中後腸厭氧環境中生長。
本實施中涉及到培養基的構成是:
[0018]營養肉汁瓊脂培養基:蛋白腖10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂粉15.0 g,水 1.0 L, pH 7.0 ；
[0019]MRS培養基:蛋白腖10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，吐溫80 I ml，檸檬酸二胺 2.0 g, K2HP04 2.0 g,葡萄糖 20.0 g,乙酸鈉 5.0 g, MgS04 ? 7H20 0.1 g, MnS04
0.05 g，水 1.0 L, pH 7.0 ；
厭氧發酵培養基=MRS培養基加入0.1~0.2%的硫代乙醇酸鈉和少量美藍指示劑，pH
7.0。
實施例4、菌種鑑定
[0020](I)形態特徵
在YPD和MRS培養基上生長良好，培養48 hr後形成直徑2_3mm大小的圓形菌落，菌落呈白色有光澤，邊緣整齊，不透明；顯微鏡下菌株細胞呈直杆狀，芽孢端生。
[0021](2)生化特徵
菌株PFK1102A革蘭氏染色陽性，不能分解澱粉、乳糖，能分解葡萄糖產酸不產氣。
[0022](3) 16S rRNA 序列分析
對分離得到的菌株PFK1102A進行進一步的16S rRNA序列分析與對比。鑑定採用通用性引物 27F 和 1492R。引物序列如下，27F:5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3 '和 1492R:5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由上海英俊合成。以篩選得到的菌株的總DNA為模板進行PCR擴增，擴增條件:95 °C預變性5 min, 94 °C變性45 sec, 49 °C退火45 sec, 72 V 延伸90 sec，反應30循環。目的片段按照常規方法進行測序，測定結果提交到GenBank中進行序列比對分析，基因同源性達到99.4%以上。根據《Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology》(Holt, J.G.Gibbons, N.E., 1"4)和《常用細菌系統鑑定手冊》(東秀珠和蔡妙英等，2001)，通過形態特徵、生化特徵和16S rRNA基因序列分析，確定菌株 PFKl 102A為凝結芽孢桿菌。該菌株進行保藏於。
[0023](4)培養特徵
菌株1102A適宜的生長溫度範圍為37~45 °C，最適pH範圍為5.5~7.5，兼性厭氧或者好氧。
實施例5、發酵液中乳酸的檢測
按實施例3中對菌株PFKl 102A進行培養，培養24 hr後對厭氧發酵產物進行檢測。[0024](I)乳酸的定性檢測
取發酵液上清10 ml於試管中，加入10% H2S04 1.0 ml，再加2% KMn04 1.0 ml，混勻， 把事先在含氨的硝酸溶液中浸泡的濾紙條搭在試管口上，微火加熱試管至沸。濾紙變黑，說明有乳酸存在，並可以聞到乙醛的特殊氣味。培養24 hr後用，培養基的pH由最初的7.0 下降到5.3。
[0025](2)乳酸的定量檢測
吸取一定量培養24 hr後的發酵液高速離心後，精確吸取上清20 ml，加入2.0 ml鹽酸溶液(1+4)定容至50 ml，再加5 ml氫氧化鈉溶液(100 g/L)和0.1 g鈣紫紅素指示劑， 用0.05 mo I/L EDTA標準滴定溶液滴至藍色為終點。滴定到終點時，總共消耗掉EDTA標準液1.8 ml，計算得到發酵液中乳酸的含量為3.3 mg/ml。
【權利要求】
1.一株凝結芽抱桿菌(Bacillus coagulans) PFK1102A。
2.根據權利要求1所述的凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans) PFK1102A,其特徵在於:所述的凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans) PFKl 102A是革蘭氏陽性桿菌,端生芽孢， 在YPD和MRS培養基上生長良好，48 hr形成直徑2~3mm大小的圓形菌落，菌落呈白色有光澤，邊緣整齊；兼性厭氧或者好氧，最適生長溫度37~45°C，最適pH為5.5~7.5，其16S rRNA基因的核苷酸序列如Seq.1102A所示。
3.根據權利要求1所述的凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)PFKl 102A是一株能厭氧代謝葡萄糖產乳酸的菌株。
4.根據權利要求1所述的凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)PFKl 102A生長所需的氧化還原電勢比較寬泛。
5.一種模擬動物中後腸段厭氧環境的簡易厭氧裝置，此厭簡易厭氧裝置及其功能以及在此基礎上的簡單改造均屬於保護範圍。
6.根據權利要求5所述的簡易厭氧裝置可用於微生態製劑菌種的篩選。
7.根據權利要求5所提供的簡易厭氧裝置可實現微生物在厭氧條件下代謝產物的定性、定量的快捷鑑定。
【文檔編號】C12Q1/04GK103589654SQ201210287843
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月14日 優先權日:2012年8月14日
【發明者】羅國升, 劉亞力, 張煌 申請人:湖南普菲克生物科技有限公司