核酸遞送組合物及其使用方法
2023-11-11 20:28:27
專利名稱：核酸遞送組合物及其使用方法
技術領域：
本公開書涉及用於轉導細胞的組合物和方法。
背景技術：
已經使用各種各樣的重組病毒載體、脂質遞送系統和電穿孔在體外和體內進行核酸至細胞的遞送。這些技術通過敲除基因表達或提供用於基因治療的遺傳構建物設法治療各種疾病和病症或研究不同的生物系統。聚陰離子寡聚物諸如寡核苷酸不容易跨細胞膜擴散。為了克服培養細胞的這個問題，陽離子脂質與陰離子寡核苷酸結合以幫助攝取。不幸的是，該複合物對細胞通常是有毒的，這意味著必須小心地控制陽離子脂的暴露時間和濃度，以保證活細胞的轉染。作為選擇性降解mRNA的細胞機理的RNA幹擾的發現使得可以靶向操作細胞培養物的表型和發展定向治療技術(Behlke, Mol. Ther. 13，644-670，2006 ；Xie等人，Drug Discov. Today 11，67_73，2006)。然而，由於它們的大小和負(陰離子)電荷的性質，siRNA 是不能進入細胞的大分子。實際上，siRNA超過了 Lipinski的用於細胞遞送膜可擴散分子的「k規則」(Rule of 5s)的25倍，在該規則中，通常膜可擴散分子限制為小於500Da的尺寸。因此，在不存在遞送載體或轉染劑時，裸露的siRNA不進入細胞，即使在毫摩爾的濃度下也不能(Barquinero等人，Gene Ther. 11 Suppl 1，S3-9，2004)。重要的關注集中在使用陽離子脂質上，其凝聚siRNA並在細胞膜上打孔來解決siRNA的遞送問題。儘管已經廣泛使用，但轉染劑不能實現有效地遞送到許多細胞類型，尤其是原代細胞和造血細胞系中(T 細胞和B細胞，巨噬細胞)。而且脂質轉染試劑經常導致不同程度的細胞毒性，從腫瘤細胞中的輕度到原代細胞中的高度的細胞毒性。
發明內容
本公開書提供了用於將掩蔽的寡核苷酸或多核苷酸遞送到活細胞中的方法和組合物。本發明提供了短暫保護的寡核苷酸或多核苷酸，其包含陰離子電荷中和部分/基團。 在一個實施方案中，所述電荷中和部分包含鹼性/陽離子電荷。在另一個實施方案中，所述部分包括沿本發明的三酯保護基團的伯胺、仲胺或叔胺。這些化合物可以通過胞吞或大型胞飲機制進入活細胞的細胞胞質。在一個實施方案中，所述磷酸三酯保護/中和基團當暴露於細胞內環境時，被設計成通過酶活性或通過被動的細胞內方法(例如，PH改變)除去， 以提供能夠誘發RNAi應答的寡核苷酸或多核苷酸。因此，本發明提供了可用作治療劑、診斷劑和作為研究工具的寡核苷酸前藥。本公開書提供了 RNAi誘導的單個可溶性核糖核酸鹼(SiRNB)分子。在一些實施方案中，siRNB分子與肽轉導結構域(PTD)細胞遞送肽(PTD-siRNB)綴合，所述肽轉導結構域(PTD)細胞遞送肽(PTD-siRNB) 9. 0)的鹼性(正)電荷，其使RNB可溶於水中，並且不會被PTD遞送肽從溶液中驅除。本公開書提供了在電荷中和的寡核苷酸中使用的修飾核苷酸。核苷酸包含與核苷酸的磷酸基團綴合的氨基烷基S-醯基硫代烷基(「電荷中和部分」或「N-SATE」)。中和基團協助包含所述修飾的核苷酸的寡核苷酸跨細胞膜運輸。一旦被細胞攝取，所述中和基團被例如內源性或外源性硫酯酶去除。在一個實施方案中，用於將N-SATE添加至寡核苷酸(例如，和RNA寡核苷酸)的
結構單元包含電荷中和部分，所述電荷中和部分具有下列通式結構
權利要求
1.一種核苷酸化合物，其包含與所述核苷酸的磷酸基綴合的氨基烷基S-醯基硫代烷基(N-SATE)部分。
2.權利要求1所述的核苷酸，其中所述N-SATE部分包含下述通式結構
3.權利要求1或2所述的核苷酸，其中所述N-SATE部分選自
4.權利要求1或2所述的核苷酸化合物，其中所述N-SATE部分與核酸鹼基A、G、C、T 或U任一個的磷酸基綴合。
5.權利要求1、2或4所述的核苷酸，其中當所述核苷酸通過磷酸鍵與另一核苷酸連接時，連接的主鏈包含下述通式結構
6.權利要求5所述的核苷酸，其中所述N-SATE部分選自
7.一種寡核苷酸或多核苷酸，其包含具有權利要求1所述的N-SATE部分的核苷酸。
8.權利要求7所述的寡核苷酸或多核苷酸，其中與缺少N-SATE部分的相同所述寡核苷酸或多核苷酸相比所述寡核苷酸或多核苷酸包含中性或更多的陽離子電荷。
9.包含氨基烷基S-醯基硫代烷基(N-SATE)部分的寡核苷酸或多核苷酸，所述氨基烷基S-醯基硫代烷基(N-SATE)部分減少所述寡核苷酸或多核苷酸主鏈的淨陰離子電荷。
10.權利要求9所述的寡核苷酸或多核苷酸，其中所述寡核苷酸或多核苷酸包含SiRNA 分子。
11.權利要求9或10所述的寡核苷酸或多核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多個修飾的具有N-SATE部分的核苷酸。
12.權利要求9或10所述的寡核苷酸或多核苷酸，其中所述寡核苷酸或多核苷酸包含多個鄰近的具有N-SATE部分的核苷酸。
13.權利要求9或10所述的寡核苷酸或多核苷酸，其中所述寡核苷酸或多核苷酸包含多個彼此間隔1個或多個核苷酸鹼基的具有N-SATE部分的核苷酸。
14.權利要求9所述的寡核苷酸或多核苷酸，其還包含至少一個與所述寡核苷酸或多核苷酸結構域綴合的或可操作連接的蛋白質轉導結構域(PTD)，所述蛋白質轉導結構域包含膜轉運功能。
15.權利要求14所述的寡核苷酸，其包含多個蛋白質轉導結構域。
16.一種藥物組合物，其包含權利要求9所述的寡核苷酸或多核苷酸。
17.一種在體外或體內將寡核苷酸或多核苷酸遞送至細胞的方法，所述方法包括使所述細胞與權利要求16所述的藥物組合物或權利要求9所述的寡核苷酸或多核苷酸接觸。
18.一種製備權利要求9所述的電荷中性或帶陽離子電荷的寡核苷酸的方法，所述方法包括在合成儀中使用具有下述通式結構的亞磷醯胺化學合成所述寡核苷酸
19.權利要求18所述的方法，其中所述合成儀是RNA合成儀。
全文摘要
本發明涉及經修飾具有減少的淨陰離子電荷的核酸構建物。所述構建物包含磷酸三酯和/硫代磷酸酯保護基團。本發明還提供了製造和使用這種構建物的方法。
文檔編號A61K48/00GK102459302SQ201080034240
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月1日 優先權日2009年6月1日
發明者K·戈戈伊, 史蒂文·F·道蒂, 布萊恩·米德 申請人:加利福尼亞大學董事會