用於產生l-賴氨酸的方法

2023-06-09 19:06:26 6

專利名稱：用於產生l-賴氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及通過培養微生物產生L-賴氨酸的方法，所述的微生物是通過藉助基於基因工程的技術修飾用於發酵生產胺基酸的棒狀桿菌等獲得的。
作為飼料添加劑的賴氨酸通常通過利用屬於棒狀桿菌的L-賴氨酸-產生突變菌株用發酵法產生。現在已知各種L-賴氨酸-產生菌是從屬於棒狀桿菌的野生型菌株開始經人工突變產生的那些。
就棒狀桿菌而言，公開了載體質粒，這種質粒是在細菌細胞中可自主複製的，並具有藥物抗性標記基因(參見美國專利4,514,502)，並公開了用於把基因引入細菌細胞的方法(例如日本專利申請公開2207791)。也公開了通過利用以上所述的技術培養L-蘇氨酸-或L-異亮氨酸-產生菌的可能性(參見美國專利4,452,890)。培養L-賴氨酸-產生菌的技術是已知的，在其中參與L-賴氨酸生物合成的基因摻入到載體質粒中，以便在細菌細胞中擴增該基因(例如，日本專利申請公開56-160997)。
L-賴氨酸生物合成的已知基因包括，例如，二氫二吡啶甲酸還原酶基因(日本專利申請公開7-75578)和二氨基庚二酸脫氫酶基因(Ishino，S.等，核酸研究，15，3917))(其中參與L-賴氨酸生物合成的基因被克隆)，以及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因(日本專利申請公開60-87788)，二氫二吡啶甲酸合酶基因(日本專利出版物6-55149)和二氨基庚二酸脫羧酶基因(日本專利申請公開60-62994)(其中擴增基因影響L-賴氨酸產量)。
就參與L-賴氨酸生物合成的酶而言，在以野生型使用時，經歷反饋抑制的酶的情況是已知的。在這種情況下，L-賴氨酸產量通過這樣一種方法得到提高，即引入具有脫敏反饋抑制之突變的基因。具體地說，已知這樣的基因包括天冬氨酸激酶基因(國際出版物WO 94/25605)。
如上所述，藉助L-賴氨酸生物合成系統的基因擴增或突變基因的引入獲得了成功的結果。例如，具有突變天冬氨酸激酶基因(脫敏了由賴氨酸和蘇氨酸引起的固有抑制)的棒狀桿菌產生大量的L-賴氨酸(大約25g/L)。然而，這種細菌與不具有突變天冬氨酸激酶基因的細菌比較生長速度降低。也報導了通過除了引入突變天冬氨酸激酶基因之外進一步引入二氫二吡啶甲酸合酶基因可提高L-賴氨酸產量(應用的和環境的微生物學，57(6)，1746-1752(1991))。然而，這種細菌生長速度進一步降低。
也沒有報導通過增強L-賴氨酸生物合成基因改善生長的情況。目前，對棒狀桿菌，沒有出現任何人已成功地通過組合L-賴氨酸生物合成的多種基因明顯改善L-賴氨酸產量而不抑制生長的情況。
本發明的目的是通過在棒狀桿菌中同時增強L-賴氨酸生物合成的多種基因來提高L-賴氨酸的產率，而不障礙棒狀桿菌的生長。
當目標產物經採用微生物發酵產生時，與引入的物質相關的目標產物的產生速度和產率是非常重要的因素。通過增加每單位發酵設備的產生速度，可以廉價地生產目標產物。因此，發酵產率和產生速度相互匹配是工業上非常重要的。為了通過採用棒狀桿菌經發酵產生L-賴氨酸，本發明提出了以上所述問題的一種解決方案。
本發明的原理基於這樣一種事實通過增強編碼天冬氨酸激酶(其中實質上脫敏了L-蘇氨酸L-賴氨酸的反饋抑制)的DNA序列和編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA序列兩者，可以改善棒狀桿菌的生長，並且因此可以改善L-賴氨酸產生速度(與單獨增強這兩種DNA序列之一比較)。
在本發明的第一方面，本發明提供了在棒狀桿菌細胞中可自主複製的重組DNA，該DNA包含編碼天冬氨酸激酶(其中實質上脫敏了L-蘇氨酸L-賴氨酸的反饋抑制)的DNA序列和編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA序列。本發明也提供了還包含編碼磷酸烯醇丙酮酸羧酶的重組DNA。
在第二方面，本發明提供了一種具有天冬氨酸激酶的棒狀桿菌(其中L-蘇氨酸和L-賴氨酸的反饋抑制實質上被脫敏)，該棒狀桿菌包含編碼二氨基庚二酸脫羧酶的增強DNA序列。本發明也提供了還包含編碼磷酸烯醇丙酮酸羧酶的增強DNA序列的棒狀桿菌。
在第三方面，本發明提供了一種用於產生L-賴氨酸的方法，該方法包括以下步驟在適當的培養基中培養以上所述的任何棒狀桿菌使得在所說的細菌的培養物中產生並積累L-賴氨酸，並從培養物收集L-賴氨酸。
此後，需要時天冬氨酸激酶稱為＂AK ＂，編碼AK的基因稱為＂lysC＂)，由L-賴氨酸和L-蘇氨酸產生的反饋抑制被脫敏的AK稱為「突變AK」。編碼突變AK的基因稱為＂突變lysC＂。同樣，需要時二氨基庚二酸脫羧酶稱為＂DDC＂，編碼DDC的基因稱為＂lysA＂)，磷酸烯醇丙酮酸羧酶稱為「PEPC」，編碼PEPC的基因稱為「ppc」。
在本發明中所稱的棒狀桿菌是在Bergey’s細菌學手冊(第8版p.599(1974))中限定的一組微生物，其是無孢子-形成能力的需氧革蘭氏-陽性-非抗酸棒杆狀菌。棒狀桿菌包括屬於棒桿菌屬的細菌，屬於短桿菌短的細菌(迄今為止分類為短桿菌屬但現在與棒桿菌屬細菌合併在一起)和與屬於棒桿菌的細菌密切相關的短桿菌屬的細菌。
按照本發明，棒狀桿菌的L-賴氨酸產生量和產生速度可以得到提高。附圖簡要描述

圖1說明包含突變lysC的質粒p399AK9B和p399AKYB的構建方法圖2說明包含lys4的質粒p299LYSA的構建方法。
圖3說明包含lys4和Brevi.-ori的質粒pLYSAB的構建方法。
圖4說明包含PEPC結構基因的質粒pAKPFds的構建方法。
圖5說明棒狀桿菌的新克隆載體pVKG和pVK7的構建方法。
圖6說明包含野生型高表達ppc的質粒pPwm的構建方法。
圖7說明包含突變lysC，lysA和Brevi.-ori的質粒pCL的構建方法。
圖8說明包含dapA和Brevi.-ori的質粒pDPSB的構建方法。
圖9說明包含dapB和Brevi.-ori的質粒pDPRB的構建方法。
圖10說明包含ddh和Brevi.-ori的質粒pPK4D的構建方法。
圖11說明包含lysC，dapA和Brevi.-ori的質粒pCRCAB的構建方法。
圖12說明包含突變lysC，dapB和Brevi.-ori的質粒pCB的構建方法圖13說明包含法突變lysC和ddb的質粒pCD的構建方法。
發明的詳盡描述1製備用於本發明的L-賴氨酸生物合成的基因用於本發明的L-賴氨酸生物合成的基因分別通過以下方法獲得從DNA供體細菌染色體DNA用質粒載體或類似物構建染色體DNA文庫，選擇具有所需基因的菌株，和從所選擇的菌株回收已插入了所述基因的重組DNA。對用於本發明的L-賴氨酸生物合成的基因的DNA供體沒有特別的限制，只要L-賴氨酸生物合成的所需基因表達酶蛋白質(其在棒狀桿菌細胞中起作用)。然而，DNA供體優選地是棒狀桿菌。
來源於棒狀桿菌的lysC，dapA和ppc的所有基因具有已知的序列。因此，可以通過按照聚合酶鏈反應方法(PGR；see White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))進行擴增來獲得它們。
用於本發明的L-賴氨酸生物合成的各種基因可以按照以下例舉的方法獲得(1)突變lysC的製備包含突變lysC的DNA片段可以從突變菌株製備，在所述菌株中由L-蘇氨酸和L-賴氨酸產生的AK活性的協同反饋抑制實質上被脫敏(國際出版物WO94/25605)。這樣一種突變菌株可以通過例如用誘變劑如紫外光和N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NTG)對來源於棒狀桿菌野生型菌株的一組細胞進行常規突變處理獲得。AK活性可以通過用由Miyajima，R.等在生物化學雜誌(1968)，63(2)，139-148中描述的方法測量。最優選的這樣的突變菌株由L-賴氨酸-產生菌AJ 3445(FERM 1944)代表，其來源於突變處理乳發酵短桿菌ATCC13869野生型菌株(現在其改變的名稱是Corynebacterium alutamicum)。
另外，突變lysC也可由包含野生型lysC的質粒DNA體外突變處理獲得。另一方面，突變脫敏L-賴氨酸和L-蘇氨酸產生的對AK活性的協同反饋抑制的信息是十分清楚的(國際出版物WO 94/25605)。因此，在該信息的基礎上按照定點突變方法也可以製備突變lysC。
可以按照例如Saito和Miura(H.Saito和K.Miura，生物化學生物物理學報，72，619(1963))的方法通過製備染色體DNA或按照聚合酶鏈反應方法(PCR；參見White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))擴增lysC從棒狀桿菌分離包含lysC的片段。
以單鏈DNA例證性地說明DNA引物，所說單鏈DNA是具有SEQ ID NO1和2所示的核苷酸序列的23鏈節和21鏈節的，以便擴增例如基於穀氨酸棒桿菌已知序列(參見分子微生物學(1991)，5(5)，1197-1204；Mel.Gen.Genet.(1990)，224，317-324)的編碼lysC的約1,643bp的區域。可以通過採用Applied Biosystems生產的DNA合成儀380B型和採用phosphoamidite法(參見Tetrahedron Letters (1981)，22，1859)按照常規方法合成DNA。可以通過用由Takara Shuzo生產的DNA熱循環器PJ2000型按照供給者指定的方法和尾端DNA聚合酶進行PCR。
優選的是將經PCR擴增的lysC與在大腸桿菌和/和/或棒狀桿菌細胞中可自主複製的載體DNA連接製備重組DNA，把重組DNA引入預先的大腸桿菌細胞中。這一過程使隨後的操作容易進行。在大腸桿菌細胞中可自主複製的載體優選地是質粒載體，其是在宿主的細胞中優選的可自主複製的，包括例如，pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398和RSF1010。
當具有使得質粒可以在棒狀桿菌中自主複製的能力的DNA片段插入到這些載體中時，它們可以用作在大腸桿菌和棒狀桿菌中可自主複製的所謂的穿梭載體。
這樣穿梭載體包括以下載體。含有各載體的微生物和其在國際保藏單位中的保藏號(在括號)顯示如下pHC4 大腸桿菌AJ12617(FERM3532)pAJ655 大腸桿菌AJ11882(FERM136)穀氨酸棒桿菌SR8201(ATCC39135)pAJ1844大腸桿菌AJ11883(FERM137)穀氨酸棒桿菌SR8202(ATCC39136)pAJG11 大腸桿菌A511884(FERM138)pAJ3148穀氨酸棒桿菌SR8203(ATCC39137)pAJ440 枯草芽孢桿菌AJ11901(FERM140)這些載體可從其後的保藏的微生物獲得。採用溶菌酶和SDS裂解在對數的生長期所收集的細胞，接著在30,000×g下從裂解物分離以獲得上清液。將聚乙二醇添加到上清液中，藉助氯化銫-溴化乙錠均衡密度梯度離心進行分級分離和純化。
可以通過按照以下方法將質粒引入來轉化大腸桿菌，所述方法例如D.M.Morrison(酶學方法，68，326(1979))的方法或其中用氯化鈣處理受體細胞以增加DNA滲透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物學雜誌，53，159(1970))。
當按照以上所述的方法從AK野型菌株分離lysC時，獲得野生型lysC，而從AK突變菌株分離lysC時，獲得突變lysC。
包含野生型lysC的DNA片段的核苷酸序列的例子在序列表中SEQ ID NO3中顯示。野生型AK蛋白質的α亞單位的胺基酸序列是從核苷酸序列推定的，其與DNA序列一起在序列表SEQ ID NO4中顯示。單獨的胺基酸序列在SEQ IDNO5中顯示。野生型AK蛋白質的β亞單位的胺基酸序列是從DNA的核苷酸序列推定的，其與DNA序列一起在序列表SEQ ID NO6中顯示。單獨的胺基酸序列在SEQ ID NO7中顯示。在各亞單位中，GTG用作起始密碼子，相應的胺基酸由甲硫氨酸代表。然而，這種代表涉及到甲硫氨酸、纈氨酸或甲醯甲硫氨酸。
對用於本發明的突變lysC沒有特別的限制，只要其編碼AK(其中由L-蘇氨酸和L-賴氨酸產生的協同反饋抑制被脫敏)。然而，突變lysC的一個例證性例子包括這樣的突變，其中與279位(從N-末端開始計算)丙氨酸殘基相應的胺基酸殘基改變成為非丙氨酸和非非野生型AK胺基酸序列中的β亞單位中的酸性胺基酸的胺基酸殘基，與30位(從N-末端開始計數)丙氨酸殘基相應的胺基酸殘基改變成為非丙氨酸和非野生型AK胺基酸序列中的β亞單位中的酸性胺基酸的胺基酸殘基。野生型AK的胺基酸序列具體來說包括作為α亞單位的在序列表中SEQ ID NO5所示的胺基酸序列，作為β亞單位的在序列表中SEQ ID NO7所示的胺基酸序列。
稱為非丙氨酸和非酸性胺基酸的那些胺基酸殘基優選的包括蘇氨酸、精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸和纈氨酸殘基。
對相應於所要替代的胺基酸殘基的密碼子沒有特別的限制，只要它編碼所說的胺基酸殘基。可以預計，依據細菌物種和細菌菌株的不同，野生型AK的胺基酸序列可以稍微不同。具有基於在一個或多個位置上取代，缺失或插入一個或多個胺基酸殘基而不影響以上所述活性的突變的AK也可以用於本發明中。具有自發突變的編碼AK的DNA可以通過分離這樣一種DNA獲得，該DNA在嚴格條件與例如具有SEQ ID NO3所示的一部分核苷酸序列的DNA雜交。本文所說的＂嚴格條件＂意指形成特異性雜交而不形成非特異性雜交的條件。用數值難於清楚表達所述條件。然而，例舉性的條件是這樣一種條件，在該條件下，具有高同源性的核酸(例如具有不低於90％同源性的DNA)相互雜交或者是這樣一種條件，其溫度是從熔點溫度Tm到(Tm-30)℃，優選地是從Tm到(Tm-20)℃，鹽濃度相當於1x SSC，優選地相當於0.1x SSC。
基於例如，取代、缺失或插入一個或多個胺基酸殘基進行過人工突變的其它AK也可以使用，只要對AK活性實質上沒有影響和對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協同反饋抑制的脫敏沒有影響。可以通過例如定點突變修飾核苷酸序列，產生特定位點的缺失或插入，由此來獲得編碼具有人工突變的AK的DNA。也可以通過已知誘變處理方法獲得具有突變的lysC。誘變處理包括用羥胺或類似物體外處理包含lysC的DNA，用誘變如紫外光或誘變劑(其是用於常規人工誘變的，如N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或硝酸)處理具有包含lysC之DNA的微生物的。誘變處理後，可以通過選擇編碼或產生AK(其具有AK活性，其胺基酸序列從經歷誘變處理的DNA或者經歷誘變處理的微生物突變)的DNA或微生物測定引入了突變或者發生了突變的位點。對所引入突變的位點沒有特定的限制，只要對AK活性實質上沒有影響和對反饋抑制的脫敏沒有影響。所引入的突變的數目隨在蛋白質的立體結構中的胺基酸的位置和種類變化，並且沒有特定的限制，只要對AK活性實質上沒有影響和對反饋抑制的脫敏沒有影響。該數目通常是1至20，優選地是1至10。
通過將突變lysC質粒p399AK9B引入乳發酵短桿菌野生型菌株AJ12036菌株(FERM BP-734)獲得的AJ12691菌株已於1992年4月10日以保藏號FERMP-12918保藏在國際貿易和工業部工業科學和技術機構的國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi L-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，日本)，基於布達佩斯條約於1995年2月10日轉變成國際保藏，以保藏號FERMBP-4999保藏。(2)lysA的製備可以藉助PCR從棒狀桿菌的染色體製備包含lysA的DNA片段。對DNA供體沒有特別的限制，然而，由乳發酵短桿菌ATCC13869菌株所例證。
在棒狀桿菌中，lysA與argS一道形成操縱子(精氨醯-tRNA合酶基因)，lysA存在於argS下遊。lysA的表達由存在於argS上遊的啟動子調節(參見生物技術雜誌，Nov.，7356-7362(1993))。穀氨酸棒桿菌的這些基因的DNA序列是已知的(參見分子微生物學，4(11)，1819-1830(1990)；分子和普通遺傳學，212，112-119(1988))，基於該序列可以製備PCR的DNA引物。這樣的DNA引物由分別具有序列表SEQ ID NO8(相應於在分子微生物學4(11)，1819-1830(1990)中描述的核苷酸序列中的11至33位核苷酸)和SEQ ID NO9(相應於在分子和普通遺傳學，212，112-119(1988)中描述的核苷酸序列中的1370至1392位核苷酸)中所示的核苷酸序列的23-鏈節DNA所具體例證。可以以與以上所述的有關lysC的那些相同的方式進行DNA的合成、PCR和包含獲得的lysA的質粒的製備。
在以下描述的實施例中，包含啟動子、argS和lysA的DNA片段用來增強lysA。然而，argS對本發明不是必要的。其允許使用在其中lysA就連接在啟動子下遊的DNA片段。
包含argS和lysA以及由核苷酸序列編碼的推斷的胺基酸序列的DNA片段的核苷酸序列在SEQ ID NO18中例證。由argS編碼的胺基酸序列的實例在SEQ ID NO19中顯示，由lysA編碼的胺基酸序列的實例在SEQ ID NO12中顯示。除編碼這些胺基酸序列的DNA片段之外，如果對DDC活性實質上沒有影響，本發明可以等同地使用編碼實質上與SEQ ID NO12所示的胺基酸序列相同的胺基酸序列(即具有基於例如取代、缺失或插入一個或多個胺基酸之突變的胺基酸序列)的DNA片段。可以用與編碼具有突變(只要對AK活性實質上沒有影響和對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協同反饋抑制的脫敏沒有影響)的AK的DNA的那些相同的方式獲得具有自發和人工突變的lysA。(2)ppc的製備可以藉助PCR從棒狀桿菌的染色體製備包含ppc的DNA片段。對DNA供體沒有特別的限制，然而，由乳發酵短桿菌ATCC13869菌株所例證。
對乳發酵短桿菌的ppc序列是已知的(參見O′Regan，M.等，基因，77，237-251(1989))，基於該序列可以製備PCR的DNA引物。這樣的DNA引物由分別具有序列表SEQ ID NO13和14中所示的核苷酸序列的23-鏈節DNA所具體例證。可以以與以上所述的有關lysC的那些相同的方式進行DNA的合成、PCR和包含獲得的ppc的質粒的製備。
包含ppc之DNA片段的核苷酸序列和由所述核苷酸序列編碼的推斷的胺基酸序列在SEQ ID NO15中顯示。單獨的胺基酸序列在SEQ ID NO16中顯示。
除編碼這種胺基酸序列的DNA片段之外，如果對PEPC活性實質上沒有影響，本發明可以等同地使用編碼實質上與SEQ ID NO16所示的胺基酸序列相同的胺基酸序列(即具有基於例如取代、缺失或插入一個或多個胺基酸之突變的胺基酸序列)的DNA片段。可以用與編碼具有突變(只要對AK活性實質上沒有影響和對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協同反饋抑制的脫敏沒有影響)的AK的DNA的那些相同的方式獲得具有自發和人工突變的ppc。
棒狀桿菌的ppc與gap(甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)、pgk(磷酸甘油酸鹽激酶基因)和tpi(丙糖磷酸異構酶基因)一道形成操縱子，並且ppc存在於tpi的下遊。ppc的表達由存在於pgk上遊的啟動子調節(參見Schwinde，J.W.等，細菌學雜誌，175(12)，3905-3908(1993))。因此，類似以上提到的lysA，ppc可以與pgk和tpi一道經PCR擴增，以使用包含pgk、tpi和ppc的DNA片段，如以下描述的實施例所示，允許使用在其中合適的啟動子就連接在PEPC編碼區上遊的DNA片段。所述的啟動子包括lysC啟動子、來源於大腸桿菌的tac啟動子和trc啟動子。2.本發明的重組DNA和棒狀桿菌所述重組DNA包含編碼天冬氨酸激酶(其中實質上脫敏了L-蘇氨酸L-賴氨酸的反饋抑制)的DNA序列和編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA序列，並且在棒狀桿菌細胞中可自主複製。在一個優選的實施方案中，所述重組DNA除了包含以上所述的DNA序列外還包含編碼磷酸烯醇丙酮酸羧酶的DNA序列。
本發明的棒狀桿菌含有天冬氨酸激酶(突變AK)，在其中由L-賴氨酸和L-蘇氨酸產生的反饋抑制實質上被脫敏，其中所說的編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA序列被增強。
術語＂增強＂本文指這一事實通過例如，增加基因的拷貝數，用強啟動子，使用編碼具有高比活性的酶的基因或者組合這些方法，由所說DNA編碼的酶的胞內活性得到提高。
含有突變AK的棒狀桿菌可以是作為突變的結果產生突變天冬氨酸激酶的那些或通過引入突變lysC轉化的那些。
用以引入以上所述的DNA棒狀桿菌的例子包括，例如，下列賴氨酸-產生野生型菌株Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870；Corynebacterium acetocrlutamicum ATCC 15806；美棒桿菌ATCC 15991；穀氨酸棒桿菌ATCC 13032；(Brevibacterim divaricatum)ATCC 14020；(乳發酵短桿菌)ATCC 13869；(Corynebacterium lilium)ATCC 15990；(Brevibacterium flavum)ATCC 14067；Corynebacterium melassecola ATCC 17965；Brevibacterium saccharolvticum ATCC 14066；Brevibacterium immariophilum ATCC 14068；Brevibacterium roseum ATCC 13825；Brevibacterium thioaenitalis ATCC 19240；Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354；Corynebacterium thermoaminoaenes AJ12340(FERM BP-1539)除了以上所述的細菌菌株外，其他可用的宿主包括，例如，來源於以上所述菌株的具有L-賴氨酸-產生能力的突變菌株。這樣的的人工突變菌株包括如下菌株(2-氨乙基)-半胱氨酸(在下文中簡稱為＂AEC＂)抗性突變菌株，如乳發酵短桿菌AJ11082(NRRL B-1147)，日本專利出版物56-1914、56-1915、57-14157、57-14158、57-30474、58-10075、59-4993、61-35840、62-24074、62-36673、5-11958、7-112437和7-112438)；突變菌株，其生長需要胺基酸(如L-高絲氨酸)的突變菌株(日本專利出版物48-28078和56-6499)；顯示出對AEC的抗性並需要胺基酸如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸的突變菌株(美國專利3,708,395和3,825,472)；顯示出對DL-α-氨基-ε-己內醯胺、α-氨基-月桂內醯胺、天冬氨酸-類似物、磺胺類藥、醌型和N-月桂醯亮氨酸抗性的L-賴氨酸-產生突變菌株；顯示出對oxyaloacetate脫羧酶抑制劑或呼吸系統酶抗性的L-賴氨酸-產生突變菌株(日本專利申請公開50-53588、50-31093、52-102498、53-9394、53-86089、55-9783、55-9759、56-32995和56-39778，以及日本專利出版物53-43591和53-1833)；需要肌醇或醋酸的L-賴氨酸-產生突變菌株(日本專利申請55-9784和56-8692)；對氟丙酮酸或不低於34℃的溫度表現出敏感性的L-賴氨酸-產生突變菌株(日本專利申請公開55-9783和53-86090)；屬於短桿菌屬或棒桿菌屬的表現出對乙二醇抗性並產生L-賴氨酸的產生突變菌株(美國專利4,411,997)。
在一個特定的實施方案中，為了如上所述在宿主中增強L-賴氨酸生物合成基因，通過採用質粒載體、轉座子或噬菌體載體或類似物將所述基因引入到宿主中。一旦引入，就預期會有某種程度的增強，即使使用低拷貝型載體。然而，優選地是採用多拷貝型載體。這樣載體包括，例如以上所述的質粒載體，pAJ655、pAJ1844、pAJG11、pAJ3148和pAJ440。此外，在以下文獻中描述了來源於棒狀桿菌的轉座子國際出版物WO02/02627和WO93/18151，歐洲專利出版物445385，日本專利申請公開6-46867；Vertes，A.A.等，分子微生物學，11，739-746(1994)，；Bonamy，C.，等，分子微生物學，14，571-581(1994)；Vertes，A.A.等，Mel.Gen.Genet.，245，397-405(1994)；Jagar，W.等，FEMS微生物學通訊，126，1-6(1995)，日本專利申請公開7-107976；日本專利申請公開7-327680等。
在本發明中，不可缺少的是突變lysC必需被增強。允許使用在染色體DNA上的lysC的突變的那些或者其中突變lysC摻入到染色體DNA中從那些。另外，突變lysC可以通過用質粒載體引入。另一方面，為了有效地產生L-賴氨酸，優選地是增強lysA和ppc。
通過分別採用不同的載體，可以成功地將lysC、dspA和ppc各基因引入宿主中。另外，可以用單一載體將二或三種基因一起引入。當使用不同的載體時，基因可以以任何秩序引入，然而，優選地使用這樣一些載體，它們具有在宿主細胞中的穩定參與和隱藏機制，並且能夠相互共存。
通過例如向宿主棒狀桿菌引入在棒狀桿菌細胞中可自主複製的包含突變lysC、lysA和ppc的重組DNA，獲得含有突變AK並包含增強的lysA的棒狀桿菌。
除了含有突變lysC和lysA之外還含有增強的ppc的棒狀桿菌可以通過將包含突變lysC、lysA和ppc的在棒狀桿菌細胞中可自主複製的重組DNA引入到宿主棒狀桿菌中獲得。含有增強的突變lysC，lysA和ppc的棒狀桿菌也可以通過將包含ppc的在棒狀桿菌細胞中可自主複製的重組DNA引入到含有增強的突變lysC和lysA的宿主棒狀桿菌中獲得。
可以通過例如把以上所述的參與L-賴氨酸生物合成的各基因插入到載體(如質粒載體，轉座子或噬菌體載體)中獲得上述重組DNA。
在其中質粒用作載體情況下，按照電脈衝方法(Sugimoto等，日本專利申請公開2207791)可以將重組DNA引入宿主。用轉座子的基因擴增可以通過引入質粒進行，該質粒把轉座子攜帶至宿主細胞，並誘導轉座子轉座。3用於產生L-賴氨酸的方法通過在合適的培養基中培養棒狀桿菌(包含如上所述的L-賴氨酸生物合成的增強的基因)，使得L-賴氨酸在細菌培養物中產生和積累，並從培養物收集L-賴氨酸，由此可以有效地產生L-賴氨酸。
所用的培養基的例舉性例子是包含碳源、氮源、無機離子和可有可無的其它有機組分的普通培養基。
作為碳源，可以用食糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜和澱粉水解物；和有機酸，如富馬酸、檸檬酸和琥珀酸。
作為氮源，可以用無機銨鹽，如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨；有機氮，如大豆水解物；氨氣和氨水。
作為有機微量營養源，以合適的量包含所需物質(如維生素B1和L-高絲氨酸或酵母提取物等)是合乎需要的。此外，如果需要，少量添加磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。
培養優選地在需氧條件下進行大約30至90小時。在培養期間培養溫度優選地控制在25℃到37℃，pH優選地控制在5至8。無機或有機，酸性或鹼性物質或氨氣等可以用於調節pH。可以用普通的離子交換樹脂法、沉澱法和其它已知方法結合起來從培養物收集賴氨酸。
實施例以下參照實施例更詳細地解釋本發明。實施例1從乳發酵短桿菌製備野生型lysC基因和突變lysC基因1製備野生型和突變lysC和製備含有它們的質粒將乳發酵短桿菌ATCC 13869菌株和通過突變處理從ATCC 13869菌株獲得的L-賴氨酸-產生突變菌株AJ3445(FERM P-1944)用作染色體DNA供體。AJ3445菌株已經歷突變，使lysC改變得實質上脫敏了由賴氨酸和蘇氨酸產生的協同抑制(生物化學雜誌，68，701-710(1970))。
用PCR法(聚合酶鏈反應；參見White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))從染色體DNA擴增包含lysC的DNA片段，就用於擴增的DNA引物而言，為了擴增編碼lysC的1,643bp的區，基於穀氨酸棒桿菌已知的序列(參見分子微生物學(1991)，5(5)，1197-1204；和Mel.Gen.Genet.(1990)，224，317-324)合成23鏈節和21鏈節(具有SEQ ID NO1和2所示的核苷酸序列)的單鏈DNA序列。經Applied Biosystems生產的DNA合成儀380B型用普通方法和用phosphoamidite法(參見Tetrahedron Letters(1981)，22，1859)合成DNA。
通過用Takara Shuzo生產的DNA熱循環儀PJ2000型按照供給者指定的方法和用尾端DNA聚合酶經PCR擴增所說的基因。由瓊脂糖凝膠電泳確認1,643bp的擴增的基因片段。之後，用普通的方法純化從凝膠上切下的片段，用限制酶NruI(由Takara Shuzo生產)和EcoRI(由Takara Shuzo生產)消化該片段。
將pHSG399(參見，s.等，基因(1987)，6163-74)用作基因片段的克隆載體。用限制酶SmaI(由Takara Shuzo生產)和EcoRI消化pHSG399，將其與擴增的lysC片段連接。按照指定的方法用DNA連接試劑盒(由Takara Shuzo生產)連接DNA。由此製備質粒，其中從乳發酵短桿菌染色體擴增的lysC片段分別與pHSG399連接。包含ATCC 13869(野生型菌株)lysC的質粒命名為p399AKY，包含AJ 3463(L-賴氨酸-產生菌)lysC的質粒命名為p399AK9。
將具有使細菌在屬於棒桿菌屬的細菌中可自主複製能力的DNA片段(在下文中稱為「Brevi.-ori」)分別引入到p399AKY和p399AK9中，以製備攜帶有lysC的在屬於棒桿菌屬的細菌中可自主複製的質粒。從包含Brevi.-ori並且在大腸桿菌和屬於棒桿菌屬的細菌兩種細胞中可自主複製的質粒載體pHK4製備Brevi.-ori。pHK4通過以下方法構建pHK4用KpnI(由Takara Shuzo生產)和BamHI(由Takara Shuzo生產)消化pHC4，提取Brevi.-ori片段，與pHSG298(也已由KpnI和BamHI消化)連接(參見日本專利申請公開5-7491)。pHK4使宿主具有卡那黴素抗性。含有pHK4的大腸桿菌稱命名為大腸桿菌AJ13136，該菌株已於1995年8月1日以保藏號FERM BP-5186保藏在國際貿易和工業部工業科學和技術機構的國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi L-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，日本)。
用限制酶KpnI和BamHI消化pHK4，使切開的末端平端化。按照指定的方法用平端化試劑盒(由Takara Shuzo生產)進行平端的形成。形成平端後，連接上磷酸化BamHI接頭(由Takara Shuzo生產)進行修飾，使相應於Brevi.-ori部分的DNA片段可以僅經BamHI消化從pHK4切下。用BamHI消化這一質粒，將所產生的Brevi.-ori DNA片段與p399AKY和p399AK9(也已分別用BamHI消化)連接，以製備各自含有在屬於棒桿菌屬的細菌中可自主複製的lysC基因的質粒。
包含源於p399AKY的野生型lysC基因的質粒命名為p399AKYB，包含源於p399AK9的突變lysC基因的質粒命名為p399AK9B。p399AK9B和p399AKYB的構建方法在圖1中顯示。通過把突變lysC質粒p399AK9B引入乳發酵短桿菌野生型菌株所獲得的菌株AJ12691(AJ12036菌株，FERM 734)已於1992年4月10日以保藏號FERM P-12918保藏在國際貿易和工業部工業科學和技術機構的國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi L-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，日本)，基於布達佩斯條約於1995年2月10日轉變成國際保藏，以保藏號FERM BP-4999保藏。2測定乳發酵短桿菌野生型lysC和突變lysC的核苷酸序列從各自的轉化體製備包含野生型lysC的質粒p399AKY和包含突變lysC的質粒p399AK9，以測定野生型與突變lysC的核苷酸序列。核苷酸序列測定按照Sanger等(例如F.Sanger等，美國科學院學報，74，5463(1977))的方法進行。
由p399AKY編碼的野生型lysC的核苷酸序列在序列表SEQ ID NO3中顯示。另一方面，由p399AK9編碼的突變lysC的核苷酸序列僅具有一個核苷酸突變，這樣與野生型lysC比較，在SEQ ID NO3中的1051位G改變成A。已知穀氨酸棒桿菌的lysC有兩個在同一DNA鏈上的同一讀框中編碼的亞單位(α，β)(參見，Kalinowski，J.等，分子微生物學(1991)5(5)，1197-1204)。從同源性判斷，假定此處測序的基因也具有兩個在同一DNA鏈上的同一讀框中編碼的亞單位(α，β)。
從DNA的核苷酸序列推斷的野生型AK蛋白質α-亞單位的胺基酸序列與DNA序列一起在SEQ ID NO4中顯示。單獨的胺基酸序列在SEQ ID NO5中顯示。從DNA的核苷酸序列推斷的野生型AK蛋白質β-亞單位的胺基酸序列與DNA序列一起在SEQ ID NO6中顯示。單獨的胺基酸序列在SEQ ID NO7中顯示。在每一亞單位中，GTG用作起始密碼子，相應的胺基酸由甲硫氨酸代表。然而，這種代表指甲硫氨酸、纈氨酸或甲醯甲硫氨酸。
另一方面，在突變lysC序列上的突變指出現胺基酸殘基取代，以便在野生型AK蛋白質胺基酸序列中α-亞單位的279位丙氨酸殘基改變成為蘇氨酸殘基，β-亞單位的30位丙氨酸殘基改變成為蘇氨酸殘基(SEQ ID NO5、7)。實施例2從短桿菌屬製備lysA1製備lysA和構建含有lysA的質粒乳發酵短桿菌野生型菌株ATCC13869用作染色體DNA供體。按照普通方法從ATCC13869菌株製備染色體DNA。按照PCR從染色體DNA擴增包含argS、lysA和操縱子的啟動子的DNA片段。就用於擴增的DNA引物而言，為了擴增編碼精氨醯-tRNA合酶和DDC的3.6kb的區，基於穀氨酸棒桿菌已知的序列(參見分子微生物學，4(11)，1819-1830(1990)；分子和普通遺傳學，212，112-119(1988))，使用23鏈節(分別具有序列表中SEQ ID NO8和9所示的核苷酸序列)的合成DNA，DNA合成和PCR以與實施例1所描述的相同的方式進行。將pHSG399用作擴增3,579bp的基因片段的克隆載體，用限制酶SmaI(由Takara Shuzo生產)消化pHSG399，該質粒與包含擴增的lysA的DNA片段連接。具有源於ATCC13869的lysA的如上所述獲得的質粒命名為p399LYSA。
通過以KpnI(由Takara Shuzo生產)和BamHI(由Takara Shuzo生產)消化p399LYSA提取包含lysA的DNA片段。將這一片段與pHSG299(已由KpnI和BamHI消化)。構建p399LYSA的方法在圖2中顯示。
將Brevi.-ori引入到製備的p399LYSA中以構建在棒狀桿菌中可自主複製的攜帶lys4的質粒。用限制酶KpnI和BamHI消化pHK4，使切開的末端平端化。按照指定的方法用平端化試劑盒(由Takara Shuzo生產)進行平端的形成。形成平端後，連接上磷酸化KpnI接頭(由Takara Shuzo生產)進行修飾，使相應於Brevi.-ori部分的DNA片段可以僅經KpnI消化從pHK4切下。用KpnI消化這一質粒，將所產生的Brevi.-ori DNA片段與p299LYSA(也已用KpnI消化)連接，以製備含有在棒狀桿菌中可自主複製的lysA基因的質粒。所製備的質粒命名為pLYSAB。pLYSAB的構建方法在圖3中顯示。2測定乳發酵短桿菌lysA的核苷酸序列製備質粒p299LYSA的DNA，以與實施例1中描述的相同的方式測定其核苷酸序列。所測定的核苷酸序列和從該核苷酸序列推斷的胺基酸序列在SEQ ID NO10中顯示，有關核苷酸序列，由lysA編碼的胺基酸序列和由argS編碼的胺基酸序列分別在SEQ ID NO11和12中顯示。實施例3從短桿菌屬製備ppc1製備ppc乳發酵短桿菌野生型菌株ATCC13869用作染色體DNA供體。按照普通方法從ATCC13869菌株製備染色體DNA。按照PCR從染色體DNA擴增包含ppc的DNA片段。就用於擴增的DNA引物而言，為了擴增編碼PEPC的3.3kb的區，基於穀氨酸棒桿菌已知的序列(參見O′Regan，M.等，基因，77，237-251(1989))，使用23鏈節的分別具有序列表中SEQ ID NO13和14所示的核苷酸序列的合成DNA，DNA合成和PCR以與實施例1所描述的相同的方式進行。
由瓊脂糖凝膠電泳確認3,300bp的擴增的基因片段。之後，用普通的方法純化從凝膠上抽提的片段，用限制酶SalI(由Takara Shuzo生產)消化該片段。將pHSG399用作ppc的克隆載體。以限制酶SalI(由Takara Shuzo生產)消化pHSG399，將其與包含擴增的DNA片段的質粒連接，具有來源於ATCC13869的ppc的如上所述的獲得的質粒命名為ppcF。2將ppc與具有lysC啟動子的基因連接用限制酶DraI(由Takara Shuzo生產)消化如上所述的所獲得的ppcF。在除去PEPC結構基因上遊的約150bp的DNA片段後，進行自連接，以獲得質粒ppcFds。以限制酶SalI(由Takara Shuzo生產)消化ppcFds，使切開的末端平端化。按照指定的方法經採用DNA平端化試劑盒(由Takara Shuzo生產)完成平端形成。
用限制酶ApaLI和PstI(兩者都由Takara Shuzo生產)消化實施例1中所獲得的含有野生型lysC的p399AKYB，以與以上類似的方式使切開的末端平端化。在所獲得的兩個DNA片段中的較小的一個含有Brevi.-ori和lysC啟動子。將這一片段與以上提到的片段(通過用SalI消化ppcFds並經採用DNA連接試劑盒(由Takara Shuzo生產)平端化獲得)連接。
用電脈衝法(Sugimoto等，日本專利申請公開2-207791)將在連接溶液中的DNA引入到乳發酵短桿菌ATCC13969中。在含有5μg/ml氯黴素的完全培養基上選擇轉化體。從轉化體收集質粒DNA，用EcoRI消化以獲得其中lysC啟動子以正常的方向與ppc的結構基因連接的質粒。所獲得的質粒命名為pAKPFds。pAKPFds的構建方法在圖4中顯示。與lysC啟動子連接的ppc此後稱為＂野生型高表達ppc＂。3將野生型高表達ppc插入到載體中以上獲得的野生型高表達ppc經PCR擴增，以便將其插入到具有在棒狀桿菌中可自主複製的複製起點而不是Brevi.-ori的載體中。就DNA引物而言，其是相應於在穀氨酸棒桿菌已知的lysC序列(參見分子微生物學，5(5)，1197-1204(1991)；Mel.Gen.Genet.，224，317-324(1990))基礎上合成的lysC啟動子部分的寡核苷酸(SEQ ID NO7)，和相應於在穀氨酸棒桿菌已知的ppc序列(參見O』Regan，M.等，基因，77，237-251(1989))基礎上合成的ppc部分的寡核苷酸(SEQ ID NO8)。設計這些引物，以便可以擴增含有野生型高表達ppc的約3,150bp的片段，並且可以用限制酶KpnI消化最終的擴增DNA片段。DNA合成和PCR可以以與實施例1所描述的相同的方式進行。
作為用於把野生型高表達ppc引入棒狀桿菌的載體，使用新構建的棒狀桿菌的克隆載體pVK7。如以下描述通過將大腸桿菌的載體pHSG299(Kmr；Takeshita，S.等，基因，61，63-74(1987))與乳發酵短桿菌的隱蔽性質粒pAM330構建pVK7。以形成一個切割位點的限制酶AvaII(由Takara Shuzo生產)消化pHSG299，用T4 DNA聚合酶平端化，並與已用HindIII(由Takara Shuzo生產)消化和用T4 DNA聚合酶平端化的pAM330連接。根據在pHSG299中所插入的pAM330的方向，兩個獲得的質粒命名為pVK6和pVK7，pVK7用於下列實驗中。pVK7是在大腸桿菌和乳發酵短桿菌兩者中可自主複製的，並且具有來源於pHSG299和lacZ』的多克隆位點。pVKG和pVK7的構建方法在圖5中顯示。
由瓊脂糖凝膠電泳確認3,150bp的擴增的基因片段。之後，用普通的方法純化從凝膠上切下的片段，用限制酶KpnI(由Takara Shuzo生產)消化該片段。將該DNA片段與已由限制酶KPnI消化的pVK7連接。所製備的質粒命名為pPwm。pPwm的構建方法在圖6中顯示。實施例4製備包含組合突變的lysC和lysA的質粒從含有突變lysC和Brevi.-ori的質粒p399AK9B和含有lysA的質粒p299LYSA製備含有lysC、lysA和棒狀桿菌的複製起點的質粒。以限制酶BamHI和KpnI(兩者都由Takara Shuzo生產)消化p299LYSA，並平端化。按照指定的方法用DNA平端化試劑盒(由Takara Shuzo生產)進行平端形成。將所獲得的DNA片段與p399AK9B(已由SalI消化並平端化)連接。由此製備在棒狀桿菌中可自主複製的含有突變lysC和lysA的質粒。該質粒命名為pCL。pCL的構建方法在圖7中顯示。比較實施例1從乳發酵短桿菌製備dapA、dapB和ddh按如下方法獲得L-賴氨酸生物合成相關的非lysC，lysA和ppc的基因dapA(二氫二吡啶甲酸合酶基因)、dapB(二氫二吡啶甲酸還原酶基因)和ddh(二氨基庚二酸脫氫酶基因)。1製備dapA和構建含有dapA的質粒乳發酵短桿菌野生型菌株ATCC13869用作染色體DNA供體。按照普通方法從ATCC13869菌株製備染色體DNA。按照PCR從染色體DNA擴增包含dapA的DNA片段。就用於擴增的DNA引物而言，為了擴增編碼DDPS的1.5kb的區，基於穀氨酸棒桿菌已知的序列(核酸研究，18(21)，6421(1990)；EMBL保藏號X53993)合成23鏈節的分別具有序列表中SEQ ID NO19和20所示的核苷酸序列的DNA，DNA合成和PCR以與實施例1所描述的相同的方式進行。將pCR-1000(由Invitrogen生產，參見生物技術，9，657-663(1991))用作擴增1,411bp的基因片段的克隆載體，將其與擴增的dapA片段連接。DNA的連接按照指定的方法用DNA連接試劑盒進行。由此構建質粒，其中從乳發酵短桿菌染色體擴增的1,411bp dapA片段與pCR-1000連接。具有源於ATCC13869的dapA的如上所述獲得的質粒命名為pCRDAPA。
基於布達佩斯條約，通過把pCRDAPA引入大腸桿菌JM109菌株獲得的轉化菌株AJ13106已從1995年5月26日以保藏號FERM BP-5113國際保藏在國際貿易和工業部工業科學和技術機構的國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi L-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，日本)。
將Brevi.-ori引入到製備的pCRDAPA中以構建在棒狀桿菌中可自主複製的攜帶dapA的質粒。用限制酶KpnI和BamHI(由Takara Shuzo生產)消化pHK4，使切開的末端平端化。按照指定的方法用平端化試劑盒(由Takara Shuzo生產)進行平端的形成。形成平端後，連接上磷酸化SmaI接頭(由Takara Shuzo生產)進行修飾，使相應於Brevi.-ori部分的DNA片段可以僅經SmaI消化從pHK4切下。用SmaI消化這一質粒，將所產生的Brevi.-ori DNA片段與pCRDAPA(也已用SmaI消化)連接，以製備含有在棒狀桿菌中可自主複製的dapA基因的質粒。所製備的質粒命名為pDPSB。pDPSB(Kmr)的構建方法在圖8中顯示。2製備dapB和構建含有dapB的質粒乳發酵短桿菌野生型菌株ATCC13869用作染色體DNA供體。按照普通方法從ATCC13869菌株製備染色體DNA。按照PCR從染色體DNA擴增包含dapB的DNA片段。就用於擴增的DNA引物而言，為了擴增編碼DDPR的2.0kb的區，基於乳發酵短桿菌已知的序列(參見細菌學雜誌，175(9)，2743-2749(1993))分別合成23鏈節(分別具有序列表中SEQ ID NO21和22所示的核苷酸序列)的DNA，DNA合成和PCR以與實施例1所描述的相同的方式進行。將pCR-Script(由Invitrogen生產)用作擴增2,001bp的基因片段的克隆載體，將其與擴增的dapB片段連接。由此構建質粒，其中從乳發酵短桿菌染色體擴增的2,001bp dapB片段與pCR-Script連接。具有源於ATCC13869的dapB的如上所述獲得的質粒命名為pCRDAPB。基於布達佩斯條約，通過把pCRDAPB引入大腸桿菌JM109菌株獲得的轉化菌株AJ13107已從1995年5月26日以保藏號FERM BP-5114國際保藏在國際貿易和工業部工業科學和技術機構的國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi L-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，日本)。
通過以EcoRV和SphI消化pCRDAPB提取包含DDPR結構基因的1,101bp片段。將這一片段與pHSG399(已由HincII和SghI消化)以製備質粒。該製備的質粒命名為p399DPR。
將Brevi.-ori引入到製備的p399DPR中以構建在棒狀桿菌中可自主複製的攜帶dapB的質粒。用限制酶KpnI(由Takara Shuzo生產)消化pHK4，使切開的末端平端化。按照指定的方法用平端化試劑盒(由Takara Shuzo生產)進行平端的形成。形成平端後，連接上磷酸化BamHI接頭(由Takara Shuzo生產)進行修飾，使相應於Brevi.-ori部分的DNA片段可以僅經BamHI消化從pHK4切下。用BamHI消化這一質粒，將所產生的Brevi.-ori DNA片段與p399DPR(也已用BamHI消化)連接，以製備含有在棒狀桿菌中可自主複製的dapB基因的質粒。所製備的質粒命名為pDPRB。pDPRB的構建方法在圖9中顯示。3製備ddh和構建包含ddh的質粒按照PCR方法採用兩種寡核苷酸引物(SEQ ID NO23，24)從乳發酵短桿菌ATCC13869染色體DNA ddh基因擴增來獲得ddh基因，所述引物是基於穀氨酸棒桿菌ddh基因的已知核苷酸序列(Ishino，S.等，核酸研究，15，3917(1987))製備的。將所獲得的擴增DNA片段用EcoT22I和AvaI消化，使切開末端平端化。之後，將該片段插入到pMW119的SmaI位點中以便獲得質粒pDDH。
接著，用SalI和EcoRI消化pDDH，並形成平端。之後，將所獲得的片段與已由SmaI消化的pUC18連接。這樣獲得的質粒命名為pUC18DDH。
將Brevi.-ori引入pUC18DDH，以構建在棒狀桿菌中可自主複製的攜帶ddh的質粒。以限制酶KpnI和BamHI消化pHK4。使切開的末端平端化。按照指定的方法用平端化試劑盒(由Takara Shuzo生產)進行平端的形成。形成平端後，連接上磷酸化PstI接頭(由Takara Shuzo生產)，以便將其插入到pHSG299的PstI位點中。如以上所述構建的質粒命名為pP4。接著，以XbaI和KpnI消化pUC18DDH，將所產生的片段與已由KpnI和XbaI消化的pPK4連接。這樣，構建了在棒狀桿菌中可自主複製的包含ddh的質粒。這一質粒命名為pPK4D。pPK4D的構建方法在圖10中顯示。比較實施例2構建含有組合的突變lysC和dapA、dapB或ddh的質粒1構建含有突變lysC和dapA的質粒從包含dapA的質粒pCRDAPA和包含突變lysC和Brevi.-ori的質粒p399AK9B構建包含突變lysC、dapA和棒狀桿菌複製源的質粒。以SalI完全消化p399AK9B，然後平端化，並與EcoRI接頭連接，以構建其中SalI位點修飾成EcoRI位點的質粒。所獲得的質粒命名為p399AK9BSE。通過以EcoRI部分消化p399AK9BSE作為一個片段切下突變lysC和Brevi.-ori。將這一片段與已用EcoRI消化的pCRDAPA連接。所獲得的質粒命名為pCRCAB。這一質粒在大腸桿菌和棒狀桿菌中可自主複製，其使宿主具有對卡那黴素的抗性，該質粒包含組合的突變lysC和dapA。pCRCAB的構建方法在圖11中顯示。2構建包含組合的突變lysC和dapB的質粒從具有突變lysC的質粒p399AK9和具有dapB的質粒p399DPR構建包含突變lysC和dapB的質粒。通過以EcoRV和SphI消化p399DPR提取包含DDPR結構基因的1,101bp的片段。將這一片段與已用SalI消化，然後平端化，並進一步由SphI消化的p399AK9連接，以構建包含組合的突變lysC和dapB的質粒。這一質粒命名為p399AKDDPR。
其次，將Brevi.-ori引入所獲得的p399AKDDPR。以限制酶KpnI(由Takara Shuzo生產)消化包含Brevi.-ori的質粒pHK4，使切下的邊緣平端化。按照指定的方法用平端化試劑盒(由Takara Shuzo生產)進行平端的形成。形成平端後，連接上磷酸化BamHI接頭(由Takara Shuzo生產)進行修飾，使相應於Brevi.-ori部分的DNA片段可以僅經BamHI消化從pHK4切下。用BamHI消化這一質粒，將所產生的Brevi.-ori DNA片段與p399AKDDPR(也已用BamHI消化)連接，以構建在棒狀桿菌中可自主複製的含有突變lysC和dapB的質粒。構建的質粒命名為pCB。pCB的構建方法在圖12中顯示。3構建含有組合突變lysC和ddh的質粒自包含ddh的質粒pUC18DDH和包含突變lysC和Brevi.-ori的質粒p399AK9B製備包含突變lysC、ddh的和棒狀桿菌的複製起點的質粒。以限制酶EcoRI(由Takara Shuzo生產)消化pUC18DDH，並平端化，將其在末端與SalI多接頭連接，以便將EcoRIJ位點改變成SalI位點。用SalI消化所獲得的質粒，以獲得含有ddh的DNA片段。
然後，用限制酶SalI消化p399AK9B，將其與包含ddh的DNA片段連接。這樣，由此製備在棒狀桿菌中可自主複製的包含突變lysC、ddh和Brevi.-ori的質粒，該質粒命名為pCD。pCD的構建方法在圖13中顯示。實施例5將包含L-賴氨酸生物合成基因的質粒引入到乳發酵短桿菌L-賴氨酸-產生菌中將如上所述構建的質粒分別引入乳發酵短桿菌L-賴氨酸-產生菌AJ11082(NRRL B-11470)中，所述質粒即p399AK9B(Cmr)、pLYSAB(Cmr)、pPwm(Kmr)、pCRCAB(Kmr)、pCB(Cmr)、pCD(Cmr)和pCL(Cmr)。AJ11082菌株具有AEC抗性。按照電脈衝方法引入質粒(Sugimoto等，日本專利申請公開2-207791)，基於質粒具有的藥物抗性標記選擇轉化體，當包含氯黴素抗性基因的質粒被引入時，在包含5μg/ml氯黴素完全培養基上選擇轉化體，當包含卡那黴素抗性基因的質粒被引入時，在包含25μg/ml卡那黴素完全培養基上選擇轉化體。
向所獲得的轉化體中的突變lysC和lysA被增強的菌株中引入pPwm(Kmr)，以獲得其中三種突變lysC、lysA和ppc被增強的菌株(AJ11082/pCL/pPwm)。在含有5μg/ml氯黴素和25μg/ml卡那黴素的完全培養基上選擇轉化體。實施例6L-賴氨酸的產生在L-賴氨酸-產生培養基中培養實施例5中所獲得的各種轉化體，以估價L-賴氨酸產量。L-賴氨酸-產生培養基具有下列組成。[L-賴氨酸-產生培養基]除了碳酸鈣外，溶解下列組分(在1升中)，用KOH調節pH為8.0。於115℃滅菌15分鐘，將已經以乾燥狀態在熱氣流中分別滅菌過的碳酸鈣(50g)加入其中。
葡萄糖 130g(NH4)2SO455gKH2PO41gMgSO4·7H2O1g生物素 500μg硫胺 2000μgFeSO4·7H2O0.01gMnSO4·7H2O0.01g煙醯胺 5mg蛋白質水解物(Mamenou)30ml碳酸鈣 50g將各種類型的轉化體和親本菌株接種到具有以上組成的培養基中，以進行在31.5℃下的往復振蕩培養。在培養40或72小時和生長72小時(OD562)後產生的L-賴氨酸的量在表1中顯示。在表中，lysC*代表突變lysC。
表1在40或72小時培養後積累的L-賴氨酸細菌菌株/質粒 引入的基因 產生的L-賴氨酸量(g/l)40h後72h後AJ 11082 22.0 29.8AJ 11082/p399AK9B lysC* 16.8 34.5AJ 11082/pLYSABlysA19.8 32.5AJ 11082/pPwm ppc 20.7 28.9AJ 11082/pCRCABlysC*，dapA 19.7 36.5AJ 11082/pCB lysC*，dapB 23.3 35.0AJ 11082/pCD lysC*，ddh 15.0 27.0AJ 11082/pCL lysC*，lysA 24.0 44.0AJ 11082/pCL/pPwm lysC*，lysA，ppc25.0 45.2如上所示，當突變lysC、lysA或ppc單獨增強時或者當突變lysC和dapA或ddh一起增強時，培養72小時後產生的L-賴氨酸的量大於由親本菌株產生的量，然而，培養40小時後產生的L一賴氨酸的量小於由親本菌株產生的量。即，在短的培養時間內，L-賴氨酸-產生速度降低。同樣地，當突變lysC和ddh一起增強時，培養40和72小時後產生的L-賴氨酸的量大於由親本菌株產生的量。相反，在其中dapB與突變lysC一道增強的菌株的情況下，在短的培養時間內L-賴氨酸產生速度成功地恢復，在長的培養時間內所積累的L-賴氨酸的量也得到提高。
在其中三種突變lysC、lysA和ppc同時增強的情況下，L-賴氨酸的產量得到進一步的提高。
序列表(1)一般信息(i)申請人AJINOMOTO有限公司(ii)發明名稱用於產生L-賴氨酸的方法(iii)序列數24個(iv)通訊地址(A)收信人(B)街道(C)城市(E)國家(F)ZIP(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patentln Release#，版本#1.30(vi)當前申請的數據(A)申請號(B)申請日(C)分類號(vii)在先申請的數據(A)申請號JP 8-325659(B)申請日1996年12月5日(viii)律師/代理人信息(A)姓名(B)登記號(ix)電信信息(A)電話(B)傳真(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝＂合成的DNA＂(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO1TCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度21個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO2ACGGAATTCA ATCTTACGGC C21(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度1643個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(vi)原始來源(A)有機體乳發酵短桿菌(B)菌株ATCC 13869(xi)序列描述SEQ ID NO3TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC 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Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 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NO6的信息(i)序列特徵(A)長度1643個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(vi)原始來源(A)有機體乳發酵短桿菌(B)菌株ATCC13869(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置964..1482(xi)序列描述SEQ ID NO6TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA 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NO7的信息(i)序列特徵(A)長度172個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala1 5 10 15Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys20 25 30Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu.
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GCA AAC TAC CGC GAG CTG TCT GAA GCA GAG 1646Glu Arg Ala Gln Val Thr Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu430 435 440AAG CTT GAG GTG CTG CTG AAG GAA cTG CGC AGC CCT CGT CCG CTG ATC 1694Lys Leu Glu Val Leu Leu Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile445 450 455CCG CAC GGT TCA GAT GAA TAC AGC GAG GTC ACC GAC CGC GAG CTC GGC 1742Pro His Gly Ser Asp Glu Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly460 465 470ATC TTC CGC ACC GCG TCG GAG GCT GTT AAG AAA TTC GGG CCA CGG ATG 1790Ile Phe Arg Thr Ala Ser Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met475 480485 490GTG CCT CAC TGC ATC ATC TCC ATG GCA TCA TCG GTC ACC GAT GTG CTC 1838Val Pro His Cys Ile Ile Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu495 500 505GAG CCG ATG GTA TTG CTC AAG GAA TTC GGC CTC ATT GCA GCC AAC GGC 1886Glu Pro Met Val Leu Leu Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly510 515 520GAC AAC CCA CGC GGC ACC GTC GAT GTC ATC CCA CTG TTC GAA ACC ATC 1934Asp Asn Pro Arg Gly Thr Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile525 530 535GAA GAT CTC CAG GCC GGC GCC GGA ATC CTC GAC GAA CTG TGG AAA ATT 1982Glu Asp Leu Gln Ala Gly Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile540 545 550GAT CTT TAC CGC AAC TAC CTC CTG CAG CGC GAC AAC GTC CAG GAA GTC 2030Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val555 560 565 570ATG CTC GGT TAC TCC GAT TCC AAC AAG GAT GGC GGA TAT TTC TCC GCA 2078Met Leu Gly Tyr Ser Asp Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala575 580 585AAC TGG GCG CTT TAC GAC GCG GAA CTG CAG CTC GTC GAA CTA TGC CGA 2126Asn Trp Ala Leu Tyr Asp Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg590 595 600TCA GCC GGG GTC AAG CTT CGC CTG TTC CAC GGC CGT GGT GGC ACC GTC 2174Ser Ala Gly Val Lys Leu Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val605 610 615GGC CGC GGT GGC GGA CCT TCC TAC GAC GCG ATT CTT GCC CAG CCC AGG 2222Gly Arg Gly Gly Gly Pro Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Arg620 625 630GGG GCT GTC CAA GGT TCC GTG CGC ATC ACC GAG CAG GGC GAG ATC ATC 2270Gly Ala Val Gln Gly Ser Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile635 640 645 650TCC GCT AAG TAC GGC AAC CCC GAA ACC GCG CGC CGA AAC CTC GAA GCT 2318Ser Ala Lys Tyr Gly Asn Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala655 660 665CTG GTC TCA GCA ACG CTT GAG GCA TCG CTT CTC GAC GTC TCC GAA CTC 2366Leu Val Ser Ala Thr Leu Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu670 675 680ACC GAT CAC CAA CGC GCG TAC GAC ATC ATG AGT GAG ATC TCT GAG CTC 2414Thr Asp His Gln Arg Ala Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu685 690 695AGC TTG AAG AAG TAC GCC TCC TTG GTG CAC GAG GAT CAA GGC TTC ATC 2462Ser Leu Lys Lys Tyr Ala Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile700 705 710GAT TAC TTC ACC CAG TCC ACG CCG CTG CAG GAG ATT GGA TCC CTC AAC 2510Asp Tyr Phe Thr Gln Ser Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn715 720 725 730ATC GGA TCC AGG CCT TCC TCA CGC AAG CAG ACC TCC TCG GTG GAA GAT 2558Ile Gly Ser Arg Pro Ser Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp735 740 745TTG CGA GCA ATC CCG TGG GTG CTC AGT TGG TCC CAG TCT CGT GTC ATG 2606Leu Arg Ala Ile Pro Trp Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met750 755 760CTG CCG GGC TGG TTT GGT GTC GGC ACC GCA CTT GAG CAA TGG ATT GGC 2654Leu Pro Gly Trp Phe Gly Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly765 770 775GAA GGG GAG CAG GCC ACC CAG CGC ATT GCC GAG CTA CAA ACA CTC AAC 2702Glu Gly Glu Gln Ala Thr Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn780 785 790GAG TCC TGG CCA TTT TTC ACC TCA GTG TTG GAT AAC ATG GCT CAG GTG 2750Glu Ser Trp Pro Phe Phe Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val795 800 805 810ATG TCC AAG GCA GAG CTG CGT TTG GCA AAG CTC TAC GCA GAC CTG ATC 2798Met Ser Lys Ala Glu Leu Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile815 820 825CCA GAT AGG GAA GTA GCT GAG CGC GTT TAT GCC GTC ATC CGC GAG GAA 2846Pro Asp Arg Glu Val Ala Glu Arg Val Tyr Ala Val Ile Arg Glu Glu830 835 840TAC TTC CTG ACC AAG AAG ATG TTC TGC GTA ATC ACC GGT TCT GAT GAT 2894Tyr Phe Leu Thr Lys Lys Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp845 850 855CTG CTT GAT GAC AAC CCG CTT CTC GCA CGA TCC GTC CAG CGC CGA TAC 2942Leu Leu Asp Asp Asn Pro Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr860 865 870CCC TAC CTG CTT CCA CTC AAC GTG ATC CAG GTA GAG ATG ATG CGA CGC 2990Pro Tyr Leu Leu Pro Leu Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg875 880 885 890TAC CGA AAA GGC GAC CAAAGC GAG CAA GTA TCC CGC AAC ATC CAG CTG 3038Tyr Arg Lys Gly Asp Gln Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu895 900 905ACC ATG AAC GGT CTT TCC ACT GCA CTG CGC AAC TCT GGC TAGTCCTGCT 3087Thr Met Asn Gly Leu Ser Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly910 915GGGTAGGTAG TACTCGTGTA TACTGTCTAA AGTTATTCGA AATCAGGTGG GAATAAGGTT3147CACCTGGGTT CTCAAACGGC AAAGGAACAT TTTCCACATG GCATTGACGC TTCAAATCAT3207CCTCGTCGTC GCCAGCCTGC TCATGACGGT TTTCGTCTTG CTGCACAAGG GCAAAGGCGG3267CGGACTCTCC AGCCTCTTCG GTGGCGGTGT GCAGTCCAAT CTTTCGGGCT CCACTGTTGT3327TGAAAAGAAC CTGGATCGCG TCACCATTTT GGTTGCCGTT ATCTGGATTG TGTGCATTGT3387CGCACTCAAC CTCATCCAGA CTTATTCATA AGACACGAGC TTAAAAAGAG CGGTTCCCTT3447TTCATAGGGG AGCCGCTTTT TTGGGTTTTG TCGACCTGTT GTCTCCCCAC TGTTCCTCGG3507TGTGCACTTT CGACACCAAG ATTTCG 3533(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特徵(A)長度919個胺基酸(B)類型胺基酸
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO16Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Gln Ile Leu1 5 10 15Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Glu Val Tyr Glu Leu Val20 25 30Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu35 40 45Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala50 55 60Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu65 70 75 80Ala Glu Asp leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala85 90 95Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu100 105 110Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn115 120 125Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg130 135 140Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu145150 155 160Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys165 170 175Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp180185 190Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile195 200 205Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro210 215 220Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu225 230 235 240Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly245 250 255Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser260 265 270Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu275 280 285His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Lys Val290 295 300Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro305310 315 320Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly325 330 335Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu340 345 350Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe355 360 365Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Asn Asp370 375 380Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu385 390 395 400Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu405 410 415Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr420 425 430Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu435 440 445Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu450 455 460Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser465 470 475 480Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile485 490 495Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu500 505 510Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr515 520 525Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Gln Ala Gly530 535 540Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr545 550 555 560Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp565 570 575Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp580 585 590Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Lys Leu595 600 605Arg Leu Phe His GlyArg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro610615 620Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Arg Gly Ala Val Gln Gly Ser625 630 635 640Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn645 650 655Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu660 665 670Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala675 680 685Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Ala690 695 700Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser705 710 715 720Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser725 730 735Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp740 745 750Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly755 760 765Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr770 775 780Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe785 790 795 800Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu805 810 815Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Arg Glu Val Ala820 825 830Glu Arg Val Tyr Ala Val Ile Arg Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys835 840 845Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro850 855 860Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu865 870 875 880Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln885 890 895Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser900 905 910Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly915SEQ ID NO17的信息(i)序列特徵(A)長度20個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO17CGCGAGGTAC CACCTGTCAC 20(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特徵(A)長度20個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO18CAATCCAGGT ACCGGCAACC(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO19GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 23(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO20CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO21GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述dese＝＂合成的DNA＂(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO22GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG23(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特徵(A)長度20個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述dese＝＂合成的DNA＂(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO23CATCTAAGTA TGCATCTCGG20(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特徵(A)長度20個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述desc＝，＂合成的DNA＂(iv)反義是(xi)序列描述SEQID.NO24TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20
權利要求
1.一種在棒狀桿菌細胞中可自主複製的重組DNA，該DNA包含編碼天冬氨酸激酶(其中L-蘇氨酸和L-賴氨酸的反饋抑制實質上被脫敏)的DNA序列和編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA序列。
2.按照權利要求1的重組DNA，其中所說的天冬氨酸激酶(其中L-蘇氨酸和L-賴氨酸的反饋抑制實質上被脫敏)是來源於棒狀桿菌的天冬氨酸激酶，並且其中所說的天冬氨酸激酶是突變天冬氨酸激酶，在該突變天冬氨酸激酶中，相應於279位(在SEQ ID NO5所示的胺基酸序列中從N-末端開始計數)丙氨酸殘基的胺基酸殘基改變成非丙氨酸和非其α-亞單位中的酸性胺基酸的胺基酸殘基，相應於30位(在SEQ ID NO7所示的胺基酸序列中從N-末端開始計數)丙氨酸殘基的胺基酸殘基改變成非丙氨酸和非其β-亞單位中的酸性胺基酸的胺基酸殘基。
3.按照權利要求1的重組DNA，其中所說的編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA序列編碼SEQ ID NO12所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO12所示的胺基酸序列實質上相同的胺基酸序列。
4.按照權利要求1的重組DNA，該DNA還包含編碼磷酸烯醇丙酮酸羧酶的DNA序列。
5.一種具有天冬氨酸激酶(其中L-蘇氨酸和L-賴氨酸的反饋抑制實質上被脫敏)的棒狀桿菌，該棒狀桿菌包含編碼二氨基庚二酸脫羧酶的增強DNA序列。
6.按照權利要求5的棒狀桿菌，該棒狀桿菌是通過引入如權利要求1所限定的重組DNA轉化過的。
7.按照權利要求5的棒狀桿菌，該棒狀桿菌還包含編碼磷酸烯醇丙酮酸羧酶的增強DNA序列。
8.按照權利要求7的棒狀桿菌，該棒狀桿菌是通過引入如權利要求4所限定的重組DNA轉化過的。
9.一種用於產生L-賴氨酸的方法，該方法包括以下步驟在適當的培養基中培養如權利要求5所限定的棒狀桿菌，使得在所說的細菌的培養物中產生並積累L-賴氨酸，並從培養物收集L-賴氨酸。
全文摘要
一種在棒狀桿菌細胞中可自主複製的重組DNA,該DNA包含編碼天冬氨酸激酶(其中L－蘇氨酸和L－賴氨酸的反饋抑制實質上被脫敏)的DNA序列和編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA序列。一種具有天冬氨酸激酶的棒狀桿菌(其中L－蘇氨酸和L－賴氨酸的反饋抑制實質上被脫敏),其包含編碼二氨基庚二酸脫羧酶的增強DNA序列;一種用於產生L－賴氨酸的方法,該方法包括以下步驟:在適當的培養基中培養棒狀桿菌使得在所說的細菌的培養物中產生並積累L－賴氨酸,並從培養物收集L－賴氨酸。
文檔編號C12N15/60GK1187539SQ97120819
公開日1998年7月15日 申請日期1997年12月5日 優先權日1996年12月5日
發明者早川敦, 杉本雅一, 吉原康彥, 中松亙 申請人:味之素株式會社