一種用於檢測B型肝炎病毒的生物用品的製作方法
2023-09-19 18:21:30 1
專利名稱：一種用於檢測B型肝炎病毒的生物用品的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測B型肝炎病毒的生物用品。
背景技術：
目前定量檢測HBV DNA的拷貝數(copy)是衡量B肝傳染性的最精確的指標，是確定HBV感染不同複製狀態的非常有價值的檢測手段。對於HBV DNA的檢測方法主要有斑點雜交法、bDNA信號擴增技術、競爭PCR法、PCR-ELISA法等，但它們由於靈敏度低、試劑成本高或是易汙染等原因，使其應用價值受到很大限制；而螢光定量PCR方法則由於其靈敏度高已廣泛用於B型肝炎病毒的定量檢測，但現已開發的螢光定量PCR檢測試劑盒絕大多數都是基因常規PCR加螢光染料的策略，在檢測的靈敏度和特異性方面有很大的缺陷，本發明的螢光定量PCR檢測中通過採用特異性的TaqMan螢光檢測探針，使檢測的靈敏度及特異性獲得顯著提高。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種用於檢測B型肝炎病毒的生物用品，以便於對B肝患者進行早期診斷和對臨床HBV感染的診斷。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案如下本發明提供的用於檢測B型肝炎病毒的生物用品，具體是採用TagMan檢測探針和一對針對B型肝炎病毒C基因的特異性PCR引物，其中採用一對針對B型肝炎病毒C基因的特異性PCR引物，引物P1為5′-GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG GTC TG-3′，其核酸序列長度為26個鹼基，引物P2為5′-CCA AGG CAC AGC TTG GAG GCT TGA A-3′，其核酸序列長度為25個鹼基，擴增片斷長度為112個鹼基；採用的TagMan檢測探針，其核酸序列為5′-GAG ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，其核酸序列長度為33個鹼基。
本發明提供的用於檢測B型肝炎病毒的生物用品是試劑盒，該試劑盒內設有上述的檢測B型肝炎病毒的引物、探針。
本發明與現有技術相比，具有以下顯著效果對特異性PCR引物擴增出的產物通過特異性的TaqMan螢光探針進行檢測，從而能夠顯著提高檢測B型肝炎病毒的靈敏度及特異性，其靈敏度可檢測出低於30個病毒DNA的拷貝數的極微量的核酸，而常規方法的靈敏度則是約為數百個拷貝。這有助於對體檢中B肝大三陽、小三陽部分病人進行HBV DNA測定，並了解B肝患者傳染性及進行早期診斷，和對臨床HBV感染的診斷，治療方案的選擇及療效的觀察。
圖1是重組質粒經EcoR I單酶切和PCR後，經0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測到約1.8Kb片段的示意圖。
圖2是用TaqMan探針進行螢光定量PCR檢測的標準曲線。
圖3是用EvaGreen螢光染料進行兩對引物螢光定量PCR檢測的標準曲線。
圖4是用EvaGreen螢光染料進行單對引物螢光定量PCR檢測的標準曲線。
具體實施例方式
本發明利用TaqMan探針技術和螢光染料EvaGreen技術兩種方法，分別建立了新的HBVDNA螢光實時定量PCR檢測系統，由此提供一種用於檢測B型肝炎病毒的生物用品，該生物用品是一種用螢光定量檢測B型肝炎病毒的引物、探針及試劑盒。
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步說明。
一.用螢光定量檢測B型肝炎病毒的引物、探針1.採用一對針對B肝病毒C基因的特異性PCR引物引物P1為5′-GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG GTC TG-3′，其核酸序列長度為26個鹼基，引物P2為5′-CCA AGG CAC AGC TTG GAG GCT TGA A-3′，其核酸序列長度為25個鹼基，擴增片斷長度為112個鹼基；採用的TagMan檢測探針，其核酸序列為5′-GAG ATGATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，其核酸序列長度為33個鹼基。
上述的引物中，可選取引物P1核酸序列中的5′-GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG G-3′作為引物P3，該序列長度為22個鹼基(22bp)；可選取引物P2核酸序列中的5′-GCA CAGCTT GGA GGC TTG A-3′作為引物P4，該序列長度為19個鹼基(19bp)，擴增片斷長度為107個鹼基(107bp)。螢光染料技術的引物有兩對，分別為針對S區(P5、P6)和C區基因(P7、P8)，P55′-TGC TGG TGG CTC CAG TTC AGG-3′(21bp)，P65′-GAA GAT GAG GCA TAG CAGCAG G-3′(22bp)，P75′-ACT TCG CTT CAC CTC TGC ACG-3′(21bp)，P85′-AAG GCACAG CTT GGA GGC TTG-3′(21bp)；擴增及克隆標準品所用的引物為P5和P8。
上述的TagMan檢測探針，其核酸序列為5′-ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，該序列長度為30個鹼基(30bp)。
上述引物及探針的設計原理為經過對Genbank中已有的B肝病毒基因組序列進行序列比對之後，確定序列保守區域，然後用Primer Express 2.0軟體在這些保守區域中確定前述「一.用螢光定量檢測B型肝炎病毒的引物、探針」中所列的引物及探針序列。本實例中所用的探針和引物可由上海基康生物工程技術有限公司合成。
2.相關試劑質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自武漢博大泰克公司；Taq DNA聚合酶、dNTP及10xbuffer購自Biostar公司；高保真KOD酶購自ToYoBo公司；pGEM-T Easy載體克隆試劑盒購自Promega公司；20xEvaGreen購自Biotium公司；B肝病毒ELISA檢測試劑盒和B肝病毒螢光定量試劑盒分別由上海科華公司和深圳匹基公司提供，實驗操作和判斷結果嚴格按廠家提供的說明書進行。
3.所用儀器螢光定量PCR擴增儀型CFD-3200，採用option監控軟體，冷凍離心機，37℃恆溫培養箱，振蕩培養箱等。
4.標準品的製備及檢測方法血清HBV DNA的提取採用直接煮沸法，具體為直接取50ul血清入1.5ml Eppendorf管中煮沸10分鐘，取出放置4℃ 10小時，10000r/min離心5分鐘，取上清液2ul於PCR反應管內，瞬時離心後即可上機擴增。
標準品的克隆用高保真KOD酶擴增目的PCR產物，經膠回收試劑盒回收，用TaqDNA聚合酶與pGEM-T Easy載體經T4DNA連接酶連接，電轉入大腸桿菌DH5α，在含X-gal，IPTG，氨苄青黴素的LB平板上挑選白斑，接入液體LB培養基過夜培養後用質粒提取試劑盒提取質粒DNA，經EcoR I酶切電泳，PCR鑑定和DNA測序證實目的DNA片段後確定為陽性質粒。
螢光定量PCR反應條件的探討對PCR反應參數及引物和探針、染料濃度進行探討，以期找到曲線形狀好、無非特異性擴增、檢測靈敏度高、重複性好的最佳反應條件。
定量標準曲線的建立將鑑定好的陽性質粒測定吸光值，計算拷貝數/ml，方法為拷貝數＝(質量÷分子量)×6.0×1023，然後進行10倍倍比稀釋成1010-100拷貝數/ml濃度梯度，在最佳反應條件下上定量PCR儀擴增，反應結束後儀器會自動繪製標準曲線。
靈敏度檢測選擇1份強陽性樣本含量為108拷貝數/ml，按5倍倍比稀釋並檢測，確定靈敏度，並與匹基試劑盒檢測結果對比。
重複性實驗選3份不同含量的樣本，每份樣本從提取開始重複3次，計算各個檢測方法的重複性，並與匹基試劑盒檢測結果對比。
質量控制為增加數據的可信度，每次實驗均設置空白對照管，已知樣本量靶序列的陽性對照管及陰性對照管。
結果處理調整基線以試劑空白和陰性管不出現陽性為準，與基線的交點的循環次數(Ct)值為橫坐標，HBV DNA濃度的對數值為縱坐標，製作標準曲線，利用待測標本的Ct值求出相應的HBV DNA含量。
數據分析定量結果對數值計算HBV DNA平均拷貝數(均數±標準差)，陰性結果不參與平均值計算。採用幾何均數t檢驗分析差異的顯著性，以P＜0.05差異具有顯著意義，P＜0.01差異具有高度顯著意義。
5.檢測原理TaqMan探針螢光定量PCR原理TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術，探針的5′端標記有報告基團(Reporter，R)-FAM，3′端標記有螢光淬滅基團(Quencher，Q)，隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生螢光信號。由於探針與模板是特異性結合，所以螢光信號的強弱就代表了模板的數量。
EvaGreen螢光定量PCR原理EvaGreen是一種只與DNA雙鏈結合的螢光染料。當它與DNA雙鏈結合時，發出螢光；從DNA雙鏈上釋放出來時，螢光信號急劇減弱，引物二聚體的螢光信號可以通過熔解曲線來消除。因此，螢光信號強度與不斷生成的產物成正比。
6.檢測結果重組質粒的鑑定重組質粒經EcoR I單酶切和PCR後，經0.7％的瓊脂糖凝膠電泳得到約1.8Kb的片斷(圖1)，測序結果也顯示插入片斷與預期序列完全一致。圖1中①重組質粒用EcoR I單酶切鑑定。②DNA maker ③ 2000 DNA maker。④重組質粒PCR鑑定。⑤B肝病毒基因組PCR擴增產物。⑥陰性對照。
TaqMan探針螢光定量PCR體系經多組試驗確定最佳反應體系為50ul，包括0.4uM引物P3、P4，0.12uM TaqMan探針，2ul模板提取液。擴增條件為50℃×2min；95℃×2min；95℃×15sec、60℃×1min，45個循環；螢光信號收集設在60℃。
EvaGreen螢光定量PCR體系兩對引物(P5+P6+P7+P8)最佳反應體系為50ul，0.32uM引物P5、P6，0.20uM引物P7、P8和0.02xEva Green；單對引物(P7+P8)最佳反應體系為50ul，包括0.24uM引物P5、P6和0.02xEva Green。擴增條件均為94℃×2min；94℃×15sec、58℃×15sec、72℃×20sec、82℃×3sec、讀板，45個循環；72℃×5min；16℃×5sec；熔解曲線繪製從16℃到94℃之間，每隔0.2℃讀板一次，每次持續2sec。螢光信號收集設在82℃，因產物的熔解度約為81℃。
定量標準曲線的建立圖2、圖3和圖4分別為TaqMan探針、EvaGreen雙對引物和單對引物螢光定量PCR體系的標準曲線，起始模板分別在1010-103、1010-105和1010-104拷貝數/ml時線性較好，相關係數分別為0.997、0.999和0.996。
7.方法學評價(1)靈敏度分析見表1，不難看出，TaqMan探針的靈敏度最高(28拷貝數/ml)，EvaGreen靈敏度較低(103拷貝數/ml)，匹基試劑盒的靈敏度為102拷貝數/ml。
(2)重複性分析據3次結果計算出均數、標準差S及變異係數CV(見表2)，TaqMan探針、EvaGreen雙對引物、單對引物及匹基試劑盒的平均變異係數分別為2.57％、0.77％、1.23％和1.33％。
(3)臨床檢測共檢測標本30例，結果見表3和表4。從表3可以看出只有新建立的TaqMan探針技術可以檢出極微量的HBV DNA含量(＜100拷貝數/ml)。
表4中①sAg(+)eAg(+)cAb(+)8例；②sAg(+)eAb(+)cAb(+)7例；③對照7例；*和#分別組內兩兩比較，P＞0.05；*和#作組間兩兩比較，P＜0.01。
8.結論B肝病毒的定性和定量檢測是病毒複製最直接和可信的指標，特別是定量檢測血清中HBV DNA含量對B型肝炎的診斷，特別是監測患者病情、評價抗病毒療效以及指導用藥方面具有重要意義。本文建立了兩種檢測HBV DNA的螢光定量PCR方法，並通過與匹基公司現有的B肝螢光定量診斷試劑盒檢測結果對比和實驗室方法學評價，充分證明了其檢測的可信度。同時，使用重組HBV質粒作為定量標準品具有穩定性好、重複性好和擴增效率高等優點。本發明建立的TaqMan探針技術具有線性範圍寬(1010-103拷貝數/ml)、相關性好(相關係數為0.997)、重複性好(平均變異係數分別為2.57％)、特別是靈敏度高(28拷貝數/ml)。EvaGreen是螢光定量PCR的專用螢光指示劑，其螢光信號強於SYRB Green I，且可用於任何一臺螢光定量PCR儀上進行PCR反應可兼容原有SYRB Green I的條件設置。為提高其檢測的準確度，我們特意設計了兩對引物在同一個PCR體系中反應，並作了單引物的對比。EvaGreen雙對引物體系的標準曲線起始模板在1010-105拷貝數/ml時線性較好，相關係數為0.999；單對引物體系的標準曲線起始模板在1010-104拷貝數/ml時線性較好，相關係數為0.996。重複性均較好，平均變異係數分別為0.77％和1.23％；但靈敏度相對較低，僅為103拷貝數/ml。通過對比分析，可以看出TaqMan探針技術特異性好；循環條件簡單，只需兩溫PCR循環即變性，退火、延伸及檢測可一步完成(溫度為60℃)；特別是靈敏度高，可檢測到極微量的HBV DNA，更有利於進行早期診斷及了解B肝患者傳染性，和對臨床HBV感染的診斷，治療方案的選擇及療效的觀察。與TaqMan探針技術相比，EvaGreen的靈敏度較低，循環條件更複雜，需採用四溫PCR循環即變性、退火、延伸及檢測四個溫度，為減少引物二聚體的產生和影響，還須根據熔解曲線進行分析，但其引物設計較簡單，成本也相對較低。通過對臨床標本的檢測比較，TaqMan探針具有更高的檢測水平，而EvaGreen雙對引物體系和單對引物體系之間則沒有顯著性差異(P＞0.05)。所以，對於HBV DNA的檢測最好採用TaqMan探針法。當然，對B肝的診斷最好結合ELISA法和TaqMan探針法同時作定性和定量檢測。
二.用螢光定量方法檢測B型肝炎病毒的試劑盒1.在B型肝炎病毒檢測試劑盒內，設有上述的「用螢光定量檢測B型肝炎病毒的引物、探針」。
2.B型肝炎病毒檢測試劑盒的製備及試劑盒的使用可採用或參考現有的其它B型肝炎病毒螢光定量PCR檢測試劑盒的方法進行製備和使用。
試劑盒使用的簡要步驟包括1).B型肝炎病毒核酸的提取；2).用實例中所描述的TaqMan探針螢光定量PCR體系進行擴增，螢光定量檢測的結果用螢光定量PCR儀直接讀出。
三.附表
表1 靈敏度分析
表2重複性分析
表3部分血清HBV DNA檢測結果
表4螢光定量PCR與ELISA法檢測結果比較
權利要求
1.一種用於檢測B型肝炎病毒的生物用品，其特徵在於該生物用品是採用TagMan檢測探針和一對針對B型肝炎病毒C基因的特異性PCR引物，其中引物P1為5′-GGA GGC TGTAGG CAT AAA TTG GTC TG-3′，其核酸序列長度為26個鹼基，引物P2為5′-CCA AGG CACAGC TTG GAG GCT TGA A-3′，其核酸序列長度為25個鹼基，擴增片斷長度為112個鹼基；採用的TagMan檢測探針，其核酸序列為5′-GAG ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，其核酸序列長度為33個鹼基。
2.根據權利要求1所述的生物用品，其特徵在於選取引物P1核酸序列中的5′-GGA GGCTGT AGG CAT AAA TTG G-3′作為引物P3，該序列長度為22個鹼基；選取引物P2核酸序列中的5′-GCA CAG CTT GGA GGC TTG A-3′作為引物P4，該序列長度為19個鹼基，擴增片斷長度為107個鹼基。
3.根據權利要求1所述的生物用品，其特徵在於TagMan檢測探針的核酸序列為5′-ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，該序列長度為30個鹼基。
4.一種用於檢測B型肝炎病毒的生物用品，其特徵在於生物用品是試劑盒，該試劑盒內設有TagMan檢測探針和一對針對B型肝炎病毒C基因的特異性PCR引物；特異性PCR引物中，引物P1為5′-GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG GTC TG-3′，其核酸序列長度為26個鹼基，引物P2為5′-CCA AGG CAC AGC TTG GAG GCT TGA A-3′，其核酸序列長度為25個鹼基，擴增片斷長度為112個鹼基；採用的TagMan檢測探針，其核酸序列為5′-GAG ATGATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，其核酸序列長度為33個鹼基。一種用螢光定量檢測B型肝炎病毒的試劑盒。
5.根據權利要求4所述的生物用品，其特徵在於特異性PCR引物中，選取引物P1核酸序列中的5′-GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG G-3′作為引物P3，該序列長度為22個鹼基；選取引物P2核酸序列中的5′-GCA CAG CTT GGA GGC TTG A-3′作為引物P4，該序列長度為19個鹼基，擴增片斷長度為107個鹼基。
6.根據權利要求4所述的生物用品，其特徵在於採用的TagMan檢測探針，其核酸序列為5′-ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，該序列長度為30個鹼基。
全文摘要
本發明是用於檢測B型肝炎病毒的生物用品，其為TagMan檢測探針、一對針對B型肝炎病毒C基因的特異性PCR引物和試劑盒，引物P1、P2和探針的核酸序列分別為5′－GGAGGC TGT AGG CAT AAA TTG GTC TG－3′、5′－CCA AGG CAC AGC TTG GAG GCT TGA A－3′、5′－GAG ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG－3′；試劑盒內裝有所述探針和引物P1、P2。本發明可檢測出低於30個病毒DNA的拷貝數的核酸，這有助於早期診斷和了解B肝患者傳染性，以及對臨床HBV感染的診斷、治療和療效的觀察。
文檔編號C12Q1/68GK1861807SQ20061001834
公開日2006年11月15日 申請日期2006年2月14日 優先權日2006年2月14日
發明者王華林, 周穎, 鄧菲, 袁麗, 胡志紅 申請人:中國科學院武漢病毒研究所