一種質譜兼容的蛋白質銀染法的製作方法
2023-10-04 22:01:39 4
專利名稱：一種質譜兼容的蛋白質銀染法的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質染色領域，具體的說，涉及一種電泳凝膠上質譜兼容的蛋白質 銀染方法。
背景技術：
在蛋白質組學研究中，凝膠蛋白質染色技術是銜接二維電泳和下遊質譜分析的關 鍵技術。當前先進的質譜儀已能分析Pg級的痕量蛋白。常規考馬斯亮藍染色法和銀染法 由於靈敏度低等因素嚴重的制約了蛋白質組學的發展。近三四十年來開發了不少新的染色 技術，但還是存在如下一個或幾個缺點靈敏度低、重現性差、毒性大、質譜兼容性差、價格 昂貴等。尋找新的染色方法以適應當前先進的質譜分析技術已經成為後基因時代推動蛋白 質組學發展的當務之急。對常規的染料進行篩選、組合或染色條件的優化已難以後實質性 的突破，必須以新的化學理論為指導方可突破當前在利用質譜分析對蛋白質定性的技術瓶 頸。
發明內容
發明的目的是提供一種高靈敏度、質譜兼容的電泳凝膠上的蛋白質銀染方法。為了實現本發明的目的，本發明提供了 一種電泳凝膠上蛋白質以有機染料來敏化 銀染的方法，包括如下步驟1)將蛋白質樣本電泳後的凝膠置於固定液中固定10 60min，染色液染色10 60min ；2)脫色液脫色1 lOmin，去離子水水洗1 3次，每次1 lOmin，硝酸銀溶液銀 染 1 20min ；3)去離子水水洗1 3次，每次10 60s，顯影劑顯色2 lOmin，EDTA溶液終止。所述步驟1)中凝膠置於固定液中固定20分鐘，然後在染色液中染色25min ； 所述固定液為體積百分含量30 50%的乙醇和5 20%的乙酸溶液；所述染色液為 0. 001-0. (^^的鉻黑！1、〗。1^ -30%乙醇和5 10%乙酸溶液；固定液優選體積百分含量 40%乙醇和10%乙酸水溶液；所述染色液為0.01%鉻黑1\對(％乙醇和7%乙酸溶液。所述步驟2)中脫色2min，去離子水水洗兩次，每次2min，硝酸銀銀染5min ；所述 脫色液即為上述所用固定液；所述硝酸銀溶液為0. 25%硝酸銀的0. 037%甲醛溶液。所述步驟；3)中去離子水水洗兩次，每次20s;顯影劑溶液為1 3%碳酸鉀、 0. 01% 0. 氫氧化鈉、0. 005% 0. 01%甲醛和0. 0001% 0. 0005%硫代硫酸鈉溶液。所述步驟3)中，顯影劑溶液為3%碳酸鉀、0.04%氫氧化鈉、0.007%甲醛和 0. 002%硫代硫酸鈉溶液。所述步驟3)中，1. 5% EDTA溶液終止lOmin。本發明所述方法利用了雙重染色理論和銀離子敏化理論，在銀染過程中染料分子可以作為高效的銀離子敏化劑，染料分子本身具有偶氮鍵，在顯色的特定條件下，偶氮鍵發 生斷裂產生還原性(產生氮氣)，從而改善銀離子的還原，從而減少甲醛的用量，進而增加 銀染的重現性、靈敏度和質譜兼容性。該技術能可控性進行兩次相對獨立染色，能夠從染料 染色過度到銀染。前期研究表明該技術1)靈敏度高靈敏度高於常規的考馬斯亮藍染色法10倍以上，高於常規的銀染法 3倍以上；2)較現有染色法時間短，約一個小時可完成全部染色；3)質譜兼容性好蛋白質在雙重染色後，經質譜分析都獲得了較高的覆蓋率；4)和現有的蛋白質銀染法比較，具有較好的重現性。5)生物安全性好使用的染料和試劑的毒性較低。該技術的多項指標已經達到國際先進水平，比較適合應用於高通量蛋白質組學的 研究。
圖1在SDS-PAGE凝膠上，本發明所述雙重染色法和戊二醛銀染法靈敏度的比較。圖中A雙重染色法中染料染色，B雙重染色法中銀染，C傳統的戊二醛銀染法；1、 樣品量 25ng/mm2 ；2、樣品量 12. 5ng/mm2 ；3、樣品量 6. 2ng/mm2 ；4、樣品量 3. lng/mm2 ；5、樣品 量 1. 6ng/mm2 ；6、樣品量 0. 8ng/mm2 ；7、樣品量 0. 4ng/mm2 ；8、樣品量 0. 2ng/mm2 ；9、樣品量 0. lng/mm2 ； 10、樣品量 0. 05ng/mm2。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1用購自Sigma公司的標準蛋白SDS-6H2為樣品，在相同的條件下進行電泳。將蛋 白質樣本電泳後的凝膠置於體積百分含量為40%乙醇10%乙酸水溶液中固定20min，染色 液0. 01%鉻黑T、M%乙醇和7%乙酸溶液溶液染色25min。用體積百分含量為40%的乙 醇和10%乙酸溶液洗脫aiiin。去離子水水洗2次，每次aiiin，硝酸銀溶液銀染5min。去離 子水水洗2次，每次20s。顯影劑3%的碳酸鉀溶液顯色2 lOmin。1. 5% EDTA溶液終止 IOmin0戊二醛銀染法操作方法參見文獻=Heukeshoven,J.，and Dernick，R. (1985) Simplified method for silver staining of proteins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining.Electrophoresis 6,103—12·由附圖可見，A為雙重染色法中染料染色；B為雙重染色法中銀染；C為傳統的戊二 醛銀染法。隨著樣本量的逐漸降低O倍遞減)，三種染色法所顯現的顏色逐漸變弱，其中， 本發明所述的雙重染色方法(銀染法)的靈敏度最高。
權利要求
1.一種電泳凝膠上蛋白質的銀染法，包括如下步驟1)將蛋白質樣本電泳後的凝膠置於固定液中固定10 60min，染色液染色10 60min ；2)脫色液脫色1 lOmin，去離子水水洗1 3次，每次1 lOmin，硝酸銀溶液銀染 1 20min ；3)去離子水水洗1 3次，每次10 60s，顯影劑顯色2 lOmin，EDTA溶液終止。
2.如權利要求1所述的銀染法，其特徵在於，所述步驟1)中凝膠置於固定液中固定 20min，然後在染色液中染色25min ；所述固定液為體積百分含量30 50%的乙醇和5 20%的乙酸溶液；所述染色液為0. 001-0. 02%的鉻黑T、20% -30%乙醇和5 10%乙酸溶液。
3.如權利要求2所述的銀染法，其特徵在於，所述步驟1)中固定液為體積百分含量 40%乙醇和10%乙酸水溶液；所述染色液為0.01%鉻黑1\對(％乙醇和7%乙酸溶液。
4.如權利要求1所述的銀染法，其特徵在於，所述步驟2)中，用脫色液脫色aiiin，去離 子水水洗兩次，每次2min，硝酸銀銀染5min ；所述脫色液即上述所用的固定液，所述的硝酸 銀溶液為0. 25%硝酸銀的0. 037%甲醛溶液。
5.如權利要求1所述的銀染法，其特徵在於，所述步驟3)中，去離子水水洗2次，每 次20s ；顯影劑溶液為1 3%碳酸鉀、0.01% 0. 氫氧化鈉、0. 005% 0.01%甲醛和 0. 0001% 0. 0005%硫代硫酸鈉溶液。
6.如權利5所述的銀染法，其特徵在於，所述步驟幻中，在顯影劑溶液為3%碳酸鉀、 0. 04%氫氧化鈉、0. 007%甲醛和0. 002%硫代硫酸鈉溶液。
7.如權利要求1中所述的銀染法，其特徵在於，所述步驟幻中，1.5%EDTA溶液終止 IOmin0
全文摘要
本發明涉及一種電泳凝膠上的質譜兼容的蛋白質銀染法，包括如下步驟1)將蛋白質樣品電泳後的凝膠置於固定液中固定，染色液染色；2)脫色液脫色，去離子水水洗，硝酸銀溶液銀染；3)去離子水水洗，顯影劑顯色，EDTA溶液終止。本發明所述的蛋白質銀染法靈敏度高，較現有蛋白質銀染法所需時間更短，質譜兼容性好，可適合應用於高通量蛋白質組學研究。本發明涉及蛋白質染色領域，具體的說，涉及一種電泳凝膠上質譜兼容的蛋白質銀染方法。
文檔編號G01N1/30GK102053030SQ200910193628
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月3日 優先權日2009年11月3日
發明者馮治國, 李校堃, 熊盛, 胡宏偉, 金利泰, 黃志鋒 申請人:廣東暨大基因藥物工程研究中心有限公司