神經肽Corazonin和其受體基因及在桔小實蠅特異性控制劑中的應用的製作方法
2023-10-19 06:54:47
本發明屬於基因工程領域，具體涉及一種神經肽Corazonin和其受體基因及在桔小實蠅特異性控制劑中的應用。
背景技術：
桔小實蠅(Bactrocera dorsalis，Hendel),又名東方實蠅、黃蒼蠅、果蛆，隸屬雙翅目Diptera，果實蠅科Tetriphitidae，該蟲具有極強的環境適應能力和入侵擴散能力，主要為害柑橘、番石榴、芒果等46個科250多種果樹、蔬菜和花卉，對我國的果蔬和花卉產業的健康發展造成巨大危害。目前，歐、美、日及東南亞等多個國家和地區已經將桔小實蠅列為重要的危險性檢疫對象。在桔小實蠅的防治方面，化學殺蟲劑的是防治措施的重要組成部分，包括有機磷殺蟲劑、擬除蟲菊酯和阿維菌素等，但是化學防治離我們的環保要求甚遠，尤其是害蟲抗藥性的產生、環境殘留、食品安全隱患等問題嚴重威脅著人類健康，因此，新型殺蟲劑的研究開發有待繼續進行。
Corazonin(CZ)是普遍存在於昆蟲體內存在的一類相對保守的神經肽，介導Corazonin作用的Corazonin受體是典型的G蛋白偶聯受體(G-protein coupled receptor，GPCR)。在不同昆蟲中，Corazonin信號系統具有多種不同的生理功能，如心率加速、體色改變、物質代謝增減、發育與生理節律調控、蛻皮延遲、吐絲減少等。在果蠅中,通過RNAi沉默技術或者轉基因技術發現，Corazonin調控果蠅對飢餓、高滲、低氧等環境脅迫的響應。此外，果蠅Corazonin的表達隨著個體發育發生了位置變化，其表達具有組織、時期和性別的特異性，表明Corazonin在果蠅中可能存在較為廣泛的生理作用。而對菸草天蛾的研究表明，Corazonin receptor對菸草天蛾的蛻皮行為具有調控作用，Corazonin是調控菸草天蛾蛻皮行為的一系列激素中最先被釋放的激素，並且注射高劑量的Corazonin會導致幼蟲蛻皮時間推遲。當前國際新藥研發進入低谷，但是以G蛋白偶聯受體(GPCR)為靶標的新藥研發卻一枝獨秀，引領著全球新藥研發的重大前沿。GPCR是細胞膜受體中的最大家族，具有7個特有的跨膜螺旋結構，在細胞信號轉導過程中扮演重要角色。目前，昆蟲中以GPCR作為靶標的新型農藥鮮有報導，而在桔小實蠅中的研究和應用更少。
技術實現要素：
本發明的目的是提供桔小實蠅神經肽Corazonin及其受體的基因及擴增方法、編碼的蛋白質及應用。
在本發明的第一方面，提供一種桔小實蠅神經肽Corazonin基因及其編碼的蛋白質，所述桔小實蠅神經肽Corazonin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，其編碼的蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本發明的另一方面，提供一種桔小實蠅神經肽Corazonin基因的擴增方法，包括如下步驟：提取桔小實蠅總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板採用巢式PCR的擴增方法，第一輪擴增的引物為Corazonin-F1和Corazonin-R1，第二輪擴增的引物為Corazonin-F2和Corazonin-R2，所述引物的序列為：
Corazonin-F1：CAAACGGCTTTTTATTAAAAC，
Corazonin-R1：CTACTAAATTCGTGTGGAGTC，
Corazonin-F2：CATCATGTTCAAATTATTCTTC，
Corazonin-R2：GCCATAATCATGTTTTAATGC。
在本發明的另一方面，提供一種桔小實蠅神經肽Corazonin成熟肽(也稱CorazoninGPCR配體)基因及其編碼的蛋白質，所述桔小實蠅神經肽Corazonin配體的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述核苷酸序列編碼的蛋白質的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:12所示。
在本發明的另一方面，提供一種桔小實蠅神經肽受體Corazonin receptor基因及其編碼的蛋白質，所述桔小實蠅神經肽受體Corazonin receptor基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，其編碼的蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在本發明的另一方面，提供一種桔小實蠅神經肽受體Corazonin receptor基因的擴增方法，包括如下步驟：提取桔小實蠅總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板採用巢式PCR的擴增方法，第一輪擴增的引物為CorazoninGPCR-F1和CorazoninGPCR-R1，第二輪擴增的引物為CorazoninGPCR-F2和CorazoninGPCR-R2，所述引物的序列為：
CorazoninGPCR-F1：ACCTCGAAAAATCACTAAATGG，
CorazoninGPCR-R1：CACATACTCCCCTCCACAGAC，
CorazoninGPCR-F2：CTAAATGGAAGGTGCAAGTGTG，
CorazoninGPCR-R2：CTCGCTTACACATTAGAGATATGC。
在本發明的另一方面，提供一種前述的桔小實蠅神經肽Corazonin基因及其編碼的蛋白質、桔小實蠅神經肽Corazonin成熟肽基因及其編碼的蛋白質、或者桔小實蠅神經肽受體Corazonin receptor基因及其編碼的蛋白質，在實蠅神經調節方面的應用，在實蠅防治上的應用，或者在製備實蠅殺蟲劑方面的應用。
本發明的有益效果是：本發明提供的桔小實蠅神經肽受體Corazonin receptor的配體多肽與Corazonin receptor具有很好的結合能力，證明本發明提供的配體具有體外活性，提供的配體多肽和編碼該配體多肽的DNA可以用於針對該GPCR開發藥物，例如桔小實蠅神經調節劑。按照本發明中的重組G-蛋白偶聯受體蛋白的表達體系以及受體結合測定系統，可以篩選桔小實蠅神經肽Corazonin特異性的激動劑和拮抗劑(對模式配體活性有促進作用的為激動劑，對模式配體活性起拮抗作用的為拮抗劑)，所獲得的激動劑或拮抗劑可以用於桔小實蠅的防治，在製備實蠅殺蟲劑方面有潛在的應用前景。
附圖說明
圖1為桔小實蠅神經肽Corazonin成熟肽對Corazonin受體的活性測定結果圖。
圖2為RNA幹擾後Corazonin receptor基因的相對表達量。
圖3為RNA幹擾後幼蟲化蛹時間及化蛹率統計圖。
具體實施方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
主要試劑及生產者：
2×PrimeSTARMax Premix(Takara公司，日本)
RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(天根公司，中國)
pGEM-T Easy Vector(Promega公司，美國)
DNA連接試劑盒(Takara公司，日本)
Trans5α感受態細胞(Transgen公司，中國)
pcDNA3.1(+)質粒(Invitrogen公司，美國)
酶NotI(NEB公司，美國)
質粒提取試劑盒(QIAGEN，德國)
DMEM/F-12medium(Gibco公司，美國)
T4DNA連接酶(Takara公司，日本)
水母素Aequorin質粒由美國堪薩斯州立大學提供
ViaFect轉染試劑(Promega公司，美國)
腔腸素Coelanterazine H儲存溶液(Life-technologies公司，美國)
CHO細胞(西南大學昆蟲分子生態研究室保存提供)
本發明實施例中的各序列合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例一、桔小實蠅神經肽Corazonin及其受體的開放閱讀框序列的獲得
1、桔小實蠅神經肽Corazonin及其受體Corazonin receptor的開放閱讀框序列引物設計及擴增
基於基因組及轉錄組數據，採用生物信息學方法，經過對果蠅神經肽Corazonin(Genbank No.NP_524350.1)和果蠅神經肽受體Corazonin receptor(Genbank No.AF373862.3)反覆比對及分析，設計桔小實蠅神經肽Corazonin及其受體的巢氏PCR特異性引物，序列如下：
用RNA提取試劑盒提取桔小實蠅總RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。
擴增桔小實蠅神經肽Corazonin序列：50μL的反應體系包含24μL去離子水,20μL 2×PrimeSTAR Max Premix,引物Corazonin-F1和Corazonin-R1各2μL(濃度均為10μM),2μL桔小實蠅cDNA模板。第一輪PCR擴增條件如下:預變性：98℃反應2min；隨後，98℃變性10s,55℃退火15s,72℃延伸1.5min，循環35次；最後72℃延伸10min。取第一輪PCR擴增得到的擴增產物2μL作為第二輪PCR擴增的模板，擴增引物用Corazonin-F2和Corazonin-R2，50μL的反應體系的其餘組分與第一輪擴增時相同，第二輪PCR擴增條件與第一輪相同。
擴增桔小實蠅神經肽Corazonin受體序列：50μL的反應體系，以及第一、二輪的PCR擴增條件與前述擴增Corazonin序列時相同，只需將第一輪的引物換為CorazoninGPCR-F1和CorazoninGPCR-R1，第二輪的引物換為CorazoninGPCR-F2和CorazoninGPCR-R2即可。
2、擴增產物構建到T載體上
將前述擴增的桔小實蠅神經肽Corazonin和Corazonin受體產物分別構建到T載體上，操作步驟如下：
1)連接：將桔小實蠅神經肽Corazonin擴增產物或者Corazonin受體擴增產物連接到pGEM-T Easy Vector上，具體操作見DNA連接試劑盒。
2)轉化：在超淨工作檯將2.5μL步驟1)中的連接產物加入到50μL的Trans5α感受態細胞中，混勻，置冰上冰浴30min。42℃水浴熱擊65sec，再放入冰浴中5min。加入無氨苄抗性的200μL LB液體培養基，37℃條件下250rpm振蕩培養1h。在已加入氨苄的LB固體培養基上，將活化好的菌液80μL均勻塗布在上述LB平板上，37℃培養過夜，挑取白色正圓型的菌斑菌落37℃搖菌培養3-5h，用通用引物M13(上遊：GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA，下遊：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)進行PCR快速鑑定，電泳檢測出約1000bp左右的條帶，說明連接產物成功構建到T載體上，將檢測出目的條帶的菌液送去測序，測序確定序列無誤後，用質粒DNA提取試劑盒抽提質粒DNA，保存於-20℃。
通過測序，得到桔小實蠅神經肽Corazonin及其受體的cDNA序列。
桔小實蠅神經肽Corazonin的cDNA序列如下(如序列表中SEQ ID NO:9所示)：TACACAAGCAAACGGCTTTTTATTAAAACATAAACATCATGTTCAAATTATTCTTCTCATTGGCTGTCCTCTGCTTCTTGGCCACATGCTTCGGCCAAACGTTTCAATACTCACACGGCTGGACCAGCGGCAAACGAGCGGTGAACACTCATCGTGACAATGATATTGCCGAAATGCTCCAACAAGATGGCGACCGCAAATTGGAAAGATGTCTCATGCAGTTGCAATATTTATTACACAATCCCCTGTCGATCCGTGCCGGCGTTCAAGCCCTGACTCCAGCAAATGGTAATCTATTTGGAAATCGTCATCAATCAAATGAATTGTATGAAGAGCTGAATGCTGCCGAGACGAACGATTATGGAAAGCATTAAAACATGATTATGGCCATAAAATATTAATAAAACGAAGCGACTCCACACGAATTTAGTAGTATATTTAATAGAATATTTGGAACAGCATACATACACATTTACATAATACAGTTATTTATTGTACATATGTATGATTTCGTTAACATATTTTACGAACTACAATTATACTATTATATGCATTTGCAAGTTTAAAAATACTATGATTGTGCATACTTTTACATATATACATGCATACATACCATATGTGTGAAAAATAAAAAAAATCTTGAAAGTAAAAATCTAAAAAACGCAAATATAGCAGAAAGCTAAGTTGAAAAACAAGTAAAGTGTATGTTAGTGTCAAAGAAGGGAGTAAAAAGATGTTTA
神經肽Corazonin編碼的蛋白質的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示。通過對神經肽序列結構特徵(成熟肽的切割位點通常為「Arg」，「Lys」組合；「Gly」為醯胺化位點)的分析得出，下劃線部分為桔小實蠅神經肽Corazonin配體的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:11所示)，以下為該配體翻譯的多肽序列：
BdCZ：QTFQYSHGWTSa(如序列表中SEQ ID NO:12所示)
註：「a」表示醯胺化。
測得桔小實蠅神經肽受體Corazonin receptor的cDNA序列如序列表中SEQ ID NO:13所示，Corazonin receptor的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO:14所示。
實施例二、基於細胞內鈣離子流動檢測的方法測定桔小實蠅神經肽Corazonin與其受體Corazonin receptor的結合能力
1、構建桔小實蠅Corazonin receptor的CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)表達質粒
將實施例一中回收得到的連接在T載體上的桔小實蠅神經肽Corazonin receptor質粒和pcDNA3.1(+)質粒，分別經NotI單酶切酶切後連接(T4DNA連接酶)，連接後參照實施例一中的轉化方法進行轉化，菌液陽性鑑定無誤後(用通用引物T7/BGH進行PCR檢測，T7：TAATACGACTCACTATAGGG，BGH：TAGAAGGCACAGTCGAGG)，用質粒提取試劑盒抽提質粒，即得到構建有Corazonin receptor片段的pcDNA3.1(+)質粒。
共轉染，按照如下步驟操作：
1)準備1.5mL無血清培養基DMEM/F-12medium於EP管。
2)在EP管中加入構建有Corazonin receptor片段的pcDNA3.1(+)質粒和水母素Aequorin質粒各7.5μg。
3)在EP管中加入45uL ViaFect轉染試劑，使用移液器來回輕柔地混合均勻。
4)室溫靜置15min。
5)將上述轉染的混合液體均勻點滴加入事先準備好的CHO細胞，過夜培養至少24h。
2、檢測細胞內鈣離子：
1)收集細胞：前述共轉染過夜培養結束後，倒去本來的細胞培養基，加入2-3mL胰蛋白酶，3min後，用一次性的洗耳球管吹打細胞，收集到50mL的離心管中。
2)將離心管在室溫，1000g(2500rpm)條件下離心3min。
3)將上清液轉移至避光小瓶中，並加入3mL的無血清培養基並重懸細胞。
4)在避光小瓶中添加30μL腔腸素Coelanterazine H儲存溶液(500μM)(最終濃度應為5μM)。
5)在避光小瓶中進行磁力攪拌3h。
6)在避光小瓶中加入27mL無血清培養基，使其最終體積為30mL，並不斷磁力攪拌30min。
7)利用多功能酶標儀對合成的配體多肽與受體的結合能力進行測定。
合成的配體多肽對Corazonin receptor的結合能力檢測結果如圖1所示，顯示配體BdCZ對該受體具有激活能力，而對照BmAKH(多肽序列為：Cys-Glu-Leu-Thr-Phe-Ser-Pro-Asp-Thr-NH2)對該受體不具有活性。其中BdCZ的EC50值(最大發光值中濃度)分別為52.5nM。以此確定BdCZ為模式配體。實施例三、基於RNA幹擾方法測定桔小實蠅神經肽受體Corazonin receptor沉默效率
1)用RNA提取試劑盒提取桔小實蠅總RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA,再以該cDNA為模板，利用含T7啟動子的引物進行PCR擴增，反應條件為：95℃預變性3min；95℃變性30s、60℃退火10s、72℃延伸2min，共35個循環；72℃條件下延伸10min。PCR反應體系共25μl，包括：濃度為1000ng/μl的cDNA模板0.5μl，濃度為0.15-0.25μM的上、下遊引物(CorazoninGPCR-dsF、CorazoninGPCR-dsR)各1μl，PrimeSTAR Max Premix 12.5μl以及去核酸酶水10μl，引物詳細信息見下表：
註：引物序列中劃線部分表示T7啟動子序列
2)將步驟1)中的PCR產物用膠回收純化試劑盒按照說明書純化回收之後作為合成dsRNA的轉錄模板，用體外合成RNA試劑盒TranscriptAid T7High Yield Transcription Kit按照使用說明轉錄合成並純化得到桔小實蠅Corazonin receptor的dsRNA溶液，將dsRNA溶液濃度稀釋到3000ng/μl。dsRNA合成反應體系為20μl，其中包括：cDNA模板4μl(約1μg)、5×TranscrptAid Reaction Buffer 4μl、濃度為100mM的ATP/CTP/GTP/ΜTP Mix 8μl、TranscriptAid Enzyme Mix 2μl和DEPC-treated water 2μl；反應條件為：37℃孵育4h。
同時利用上述方法合成並純化得到GFP(綠色螢光蛋白)的dsRNA溶液作為陰性對照，反轉錄得到的cDNA進行PCR擴增時使用的上下遊引物序列(GFP-dsF，GFP-dsR)如上表所示。
3)取桔小實蠅同一批次的7日齡幼蟲進行顯微注射。注射時將蟲體置於手上，輕輕按住，用Nanoject IIAuto_NaIloliter顯微注射儀(Dmmmond)向桔小實蠅體內注射dsRNA，注射位置位於蟲體倒數第三節的節間處，注射量為2μg/頭。注射完畢後，將幼蟲置於溫度27士l℃、相對溼度75士5％、全黑暗的環境中飼養。每組注射45頭幼蟲，設置3個生物學重複。
對照組設置：注射與桔小實蠅沒有同源性的GFP基因作為陰性對照，檢測dsRNA的毒性，觀察注射效率以及dsRNA在蟲體內的移動情況。
4)為了檢測注射dsRNA後對靶標基因的幹擾效果，採用qPCR技術對RNAi後的基因表達量進行檢測。在注射PBS、GFP或Corazonin receptor的dsRNA24h後，收集存活的蟲體液氮處理後，提取RNA，並反轉錄成cDNA，分別檢測基因的表達量變化情況。結果表明Corazonin receptor顯著性降低，結果如圖2所示，圖為注射PBS和GFP作為對照情況下的沉默效率檢測，結果表明PBS和GFP注射對基因表達量沒有顯著性影響，而Corazonin receptor dsRNA(dsCZR)注射組基因表達量顯著性下調，表明在RNA幹擾過程中，相應基因能夠被有效地沉默。
5)注射dsRNA後，使用LelcaMl65c顯微鏡觀察每組幼蟲的生長發育情況，直到化蛹為止，對累計表型率和化蛹時間進行統計分析。結果表明注射Corazonin receptor的dsRNA後，幼蟲化蛹時間顯著性延遲，結果如圖3所示，注射PBS和GFP作為對照情況下，RNA幹擾後幼蟲化蛹時間及化蛹率統計結果表明PBS和GFP注射對幼蟲化蛹時間沒有明顯影響，其幼蟲均能在24h內正常化蛹，化蛹率接近100％，而Corazonin receptor dsRNA(dsCZR)注射組幼蟲化蛹顯著性延遲，24h時間段內的化蛹率僅為17％，延遲時間約為72h。
序列表
西南大學
神經肽Corazonin和其受體基因及在桔小實蠅特異性控制劑中的應用
18
1
21
DNA
人工序列
Corazonin-F1
1
caaacggctt tttattaaaa c 21
2
21
DNA
人工序列
Corazonin-R1
2
ctactaaatt cgtgtggagt c 21
3
22
DNA
人工序列
Corazonin-F2
3
catcatgttc aaattattct tc 22
4
21
DNA
人工序列
Corazonin-R2
4
gccataatca tgttttaatg c 21
5
22
DNA
人工序列
CorazoninGPCR-F1
5
acctcgaaaa atcactaaat gg 22
6
21
DNA
人工序列
CorazoninGPCR-R1
6
cacatactcc cctccacaga c 21
7
22
DNA
人工序列
CorazoninGPCR-F2
7
ctaaatggaa ggtgcaagtg tg 22
8
24
DNA
人工序列
CorazoninGPCR-R2
8
ctcgcttaca cattagagat atgc 24
9
740
DNA
人工序列
桔小實蠅神經肽Corazonin基因
9
tacacaagca aacggctttt tattaaaaca taaacatcat gttcaaatta ttcttctcat 60
tggctgtcct ctgcttcttg gccacatgct tcggccaaac gtttcaatac tcacacggct 120
ggaccagcgg caaacgagcg gtgaacactc atcgtgacaa tgatattgcc gaaatgctcc 180
aacaagatgg cgaccgcaaa ttggaaagat gtctcatgca gttgcaatat ttattacaca 240
atcccctgtc gatccgtgcc ggcgttcaag ccctgactcc agcaaatggt aatctatttg 300
gaaatcgtca tcaatcaaat gaattgtatg aagagctgaa tgctgccgag acgaacgatt 360
atggaaagca ttaaaacatg attatggcca taaaatatta ataaaacgaa gcgactccac 420
acgaatttag tagtatattt aatagaatat ttggaacagc atacatacac atttacataa 480
tacagttatt tattgtacat atgtatgatt tcgttaacat attttacgaa ctacaattat 540
actattatat gcatttgcaa gtttaaaaat actatgattg tgcatacttt tacatatata 600
catgcataca taccatatgt gtgaaaaata aaaaaaatct tgaaagtaaa aatctaaaaa 660
acgcaaatat agcagaaagc taagttgaaa aacaagtaaa gtgtatgtta gtgtcaaaga 720
agggagtaaa aagatgttta 740
10
111
PRT
人工序列
桔小實蠅神經肽Corazonin基因編碼的蛋白質
10
Met Phe Lys Leu Phe Phe Ser Leu Ala Val Leu Cys Phe Leu Ala Thr
1 5 10 15
Cys Phe Gly Gln Thr Phe Gln Tyr Ser His Gly Trp Thr Ser Gly Lys
20 25 30
Arg Ala Val Asn Thr His Arg Asp Asn Asp Ile Ala Glu Met Leu Gln
35 40 45
Gln Asp Gly Asp Arg Lys Leu Glu Arg Cys Leu Met Gln Leu Gln Tyr
50 55 60
Leu Leu His Asn Pro Leu Ser Ile Arg Ala Gly Val Gln Ala Leu Thr
65 70 75 80
Pro Ala Asn Gly Asn Leu Phe Gly Asn Arg His Gln Ser Asn Glu Leu
85 90 95
Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Ala Glu Thr Asn Asp Tyr Gly Lys His
100 105 110
11
33
DNA
人工序列
桔小實蠅神經肽Corazonin配體基因
11
caaacgtttc aatactcaca cggctggacc agc 33
12
11
PRT
人工序列
桔小實蠅神經肽Corazonin配體多肽
12
Gln Thr Phe Gln Tyr Ser His Gly Trp Thr Ser
1 5 10
13
2008
DNA
人工序列
桔小實蠅神經肽受體Corazonin receptor基因
13
tacaaattta cctcgaaaaa tcactaaatg gaaggtgcaa gtgtggtggc aacaaccatt 60
ctcaatcctc aagcagccgt gggagcaatg cttgaacatt tcgcagagaa tttaagccac 120
ccacagcagt attacgagag tcatgaaccc catgcacgat tggcggcagc cgcaattgcc 180
acaacaacac taccaaatat agcactgtca cgtttggcgc aagttctcac aataacacaa 240
aatttaacgg ataataccac aatatatcct tatctgccag acacgttaga cacaacactt 300
acaccgtcag caacgagtaa agaagttttc tacactcatg cgccacaatt ctccaccacc 360
acgctgataa aggtctgtgt gctgggtgtg atggcgattt tctcactctt cggcaatatg 420
ctcaccatgt ggaacatcta taagacacgc ttcaagcggc gtagcttgcg caactcttgg 480
aatgccatct attcgttgtt gtttcatcta tcgatcgccg atttgcttgt aactggtttc 540
tgtattatcg gcgaggcggc ctgggcgtac acggtgcaat ggcgtggcgg tgatcttttg 600
tgcaaattct tcaagctctt ccagatgttc agtttatatt tatccactta tgtgatggtg 660
ctaatcggtg tggatcgttg gtttgcggtg aaatttccca tgcgatcgtt atatatgacc 720
aagagatgct atcaatttct gggcattgtc tacatgtctt cgttcatatt gagcatacca 780
cagtttttca tatttcattt atcgcgcggc ccgttcatcg aagacttcca tcaatgcgtg 840
acgcatggca cctacacggc accctggcag gagcagagct acaccacatt cacgctattc 900
agcacatttc tgataccctt ttgtgtgctc accgtcacct acatttccac gttccgggcg 960
atttcacgaa gtgaaaagat atttttgggt ccgcaacagg agccgcacac gagcgccaat 1020
ttaatgcata cgaatcgaca acggctcata cataaggcga aaatgaattc gctgcgactg 1080
tcttttgtga taataattgc atttctcatt tgctgggcac cctactgtac gctcatggtg 1140
ctgctacagt ttgtcgacat cgacgatgcg accagcaaaa gattaattga tggcatattc 1200
ttctttggca tgtccaatag tctggtgaat cctctcatat acggcgcctt ccatctgcac 1260
actataaaga gtaaatcgag cgataaaggc gggaatggtg gctatagtct aaatagagcc 1320
gactcgcagc gtaatccatc catgctaacg gctgttacac aaatcgacgg cagcggacgc 1380
agcacacgcg tcaaccgaca gcccagctat tatcgcgccc aacacaattt cagcaactcc 1440
agcaaggagc aggccagcct gctgcagatg acccccacca ccgccatcgt gcataaattc 1500
aattcgaact ctgaacgcag ttcagtgggt tcatcgccgc aaacctgctc cacaaatttt 1560
acacgcagcg agatgggcga ccacgaacac gagagcggct gcgaagggaa cggtggcggt 1620
ggcgctaagc gcgatgcaaa ttcacacagc accacggtgg tgtatagctt taagaagcca 1680
gccattttgc gcgcacaaag tttcgaggca ttagcaattg cgccgcccaa taatcgtatg 1740
caagcgccga aagctgcgcc acctgtgtcc gagaatggct tccatcggtc ggtgtgtgtg 1800
ttgagcttgg aagattgtaa gatatgcgcc gatgagcata tctctaatgt gtaagcgagt 1860
gtctgtggag gggagtatgt gtgtatgtgg gggatttgca tacaaaatac ttttcgaaaa 1920
agttccttat ttaagtaaca catccggtta tgtgtgcgtg tacataactg cttgtttacg 1980
taagtatata tgtaggtata tatttata 2008
14
608
PRT
人工序列
桔小實蠅神經肽受體Corazonin receptor基因編碼的蛋白質
14
Met Glu Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Thr Ile Leu Asn Pro Gln Ala
1 5 10 15
Ala Val Gly Ala Met Leu Glu His Phe Ala Glu Asn Leu Ser His Pro
20 25 30
Gln Gln Tyr Tyr Glu Ser His Glu Pro His Ala Arg Leu Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Ile Ala Thr Thr Thr Leu Pro Asn Ile Ala Leu Ser Arg Leu Ala
50 55 60
Gln Val Leu Thr Ile Thr Gln Asn Leu Thr Asp Asn Thr Thr Ile Tyr
65 70 75 80
Pro Tyr Leu Pro Asp Thr Leu Asp Thr Thr Leu Thr Pro Ser Ala Thr
85 90 95
Ser Lys Glu Val Phe Tyr Thr His Ala Pro Gln Phe Ser Thr Thr Thr
100 105 110
Leu Ile Lys Val Cys Val Leu Gly Val Met Ala Ile Phe Ser Leu Phe
115 120 125
Gly Asn Met Leu Thr Met Trp Asn Ile Tyr Lys Thr Arg Phe Lys Arg
130 135 140
Arg Ser Leu Arg Asn Ser Trp Asn Ala Ile Tyr Ser Leu Leu Phe His
145 150 155 160
Leu Ser Ile Ala Asp Leu Leu Val Thr Gly Phe Cys Ile Ile Gly Glu
165 170 175
Ala Ala Trp Ala Tyr Thr Val Gln Trp Arg Gly Gly Asp Leu Leu Cys
180 185 190
Lys Phe Phe Lys Leu Phe Gln Met Phe Ser Leu Tyr Leu Ser Thr Tyr
195 200 205
Val Met Val Leu Ile Gly Val Asp Arg Trp Phe Ala Val Lys Phe Pro
210 215 220
Met Arg Ser Leu Tyr Met Thr Lys Arg Cys Tyr Gln Phe Leu Gly Ile
225 230 235 240
Val Tyr Met Ser Ser Phe Ile Leu Ser Ile Pro Gln Phe Phe Ile Phe
245 250 255
His Leu Ser Arg Gly Pro Phe Ile Glu Asp Phe His Gln Cys Val Thr
260 265 270
His Gly Thr Tyr Thr Ala Pro Trp Gln Glu Gln Ser Tyr Thr Thr Phe
275 280 285
Thr Leu Phe Ser Thr Phe Leu Ile Pro Phe Cys Val Leu Thr Val Thr
290 295 300
Tyr Ile Ser Thr Phe Arg Ala Ile Ser Arg Ser Glu Lys Ile Phe Leu
305 310 315 320
Gly Pro Gln Gln Glu Pro His Thr Ser Ala Asn Leu Met His Thr Asn
325 330 335
Arg Gln Arg Leu Ile His Lys Ala Lys Met Asn Ser Leu Arg Leu Ser
340 345 350
Phe Val Ile Ile Ile Ala Phe Leu Ile Cys Trp Ala Pro Tyr Cys Thr
355 360 365
Leu Met Val Leu Leu Gln Phe Val Asp Ile Asp Asp Ala Thr Ser Lys
370 375 380
Arg Leu Ile Asp Gly Ile Phe Phe Phe Gly Met Ser Asn Ser Leu Val
385 390 395 400
Asn Pro Leu Ile Tyr Gly Ala Phe His Leu His Thr Ile Lys Ser Lys
405 410 415
Ser Ser Asp Lys Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Ser Leu Asn Arg Ala Asp
420 425 430
Ser Gln Arg Asn Pro Ser Met Leu Thr Ala Val Thr Gln Ile Asp Gly
435 440 445
Ser Gly Arg Ser Thr Arg Val Asn Arg Gln Pro Ser Tyr Tyr Arg Ala
450 455 460
Gln His Asn Phe Ser Asn Ser Ser Lys Glu Gln Ala Ser Leu Leu Gln
465 470 475 480
Met Thr Pro Thr Thr Ala Ile Val His Lys Phe Asn Ser Asn Ser Glu
485 490 495
Arg Ser Ser Val Gly Ser Ser Pro Gln Thr Cys Ser Thr Asn Phe Thr
500 505 510
Arg Ser Glu Met Gly Asp His Glu His Glu Ser Gly Cys Glu Gly Asn
515 520 525
Gly Gly Gly Gly Ala Lys Arg Asp Ala Asn Ser His Ser Thr Thr Val
530 535 540
Val Tyr Ser Phe Lys Lys Pro Ala Ile Leu Arg Ala Gln Ser Phe Glu
545 550 555 560
Ala Leu Ala Ile Ala Pro Pro Asn Asn Arg Met Gln Ala Pro Lys Ala
565 570 575
Ala Pro Pro Val Ser Glu Asn Gly Phe His Arg Ser Val Cys Val Leu
580 585 590
Ser Leu Glu Asp Cys Lys Ile Cys Ala Asp Glu His Ile Ser Asn Val
595 600 605
15
40
DNA
人工序列
CorazoninGPCR-dsF
15
taatacgact cactataggg ttacacaaat cgacggcagc 40
16
40
DNA
人工序列
CorazoninGPCR-dsR
16
taatacgact cactataggg gctgtgtgaa tttgcatcgc 40
17
41
DNA
人工序列
GFP-dsF
17
taatacgact cactataggg cagttcttgt tgaattagat g 41
18
41
DNA
人工序列
GFP-dsR
18
taatacgact cactataggg tttggtttgt ctcccatgat g 41