用於抑制血小板與膠原粘附的新的特異性機制的製作方法

2023-05-11 20:23:11 3

專利名稱：用於抑制血小板與膠原粘附的新的特異性機制的製作方法
技術領域：
血細胞，特別是血小板同受創血管壁的粘附在血管成形和手術過程中是一種眾所周知的現象。這樣的創傷可能在多種手術和經皮膚進行的治療中發生，這樣的治療被用於重新打開阻塞的通道、導管以及其它的管腔，用於除去病變組織以及用於移植代用組織或者其組成部分。
已經開發出多種類型的介入技術用於輔助降低或者清除血管中的阻塞，以增加流經該血管的血液。一種用於治療血管狹窄或者阻塞的技術為經皮球囊血管成形術。將一種球囊導管引入該患者的動脈系統並且插進窄化或者阻塞的區域並且將球囊充氣以擴展該受限區域。經皮經腔血管成形術(PTCA)是被用於打開受阻的粥樣硬化動脈的最廣泛的血管成形方法。
一般來說，除去需要旁路手術之外，血管成形術過程會產生出色的效果，但在約30-40％的患者之中，表面上成功的動脈初始擴張在約3到9個月後可能會繼以血管的再度窄化(再狹窄)。如果這種血管再狹窄很嚴重，該患者可能需要第二次血管成形過程，通常還要植入一種支架以作為血管中的骨架結構。
在其它情況下可能需要通過旁路手術進行動脈重建，這是更為危險的過程。對於每年在全世界範圍內進行的800,000例以上的PTCA過程，這一30-40％的血管再狹窄率的社會經濟牽涉問題已經成為介入心臟病學家所密切關注的問題。
血管再狹窄通常是球囊介導對動脈壁的拉伸和擠壓損傷的結果，在這種過程所使用的導管的導絲在伸展中可能導致損傷並且引起該動脈的平滑肌細胞的增殖，從而導致數月後該動脈的再度閉鎖(「再狹窄」)。
由於可能出現的血管再狹窄相關的併發症和對從潰瘍性斑塊中釋放出栓子及其嚴重後果的憂慮，重複性的血管成形術在頸動脈中的應用嚴重地限制了對最低限度的侵入式介入的選擇。
在此之前進行了一些嘗試以用於通過其它類型的介入方法來治療導向腦組織的頸動脈阻塞。
頸動脈內膜切除術是一種用於從頸動脈中除去阻塞物的手術方法並且是在美國中使用的最普通的血管手術程序。多中心試驗的結果已經證實了該程序在有症狀和無症狀患者體內治療顱外頸動脈疾病中的效果(JAMA 1995；2731421-28；NEngl.J.Med.1991；325445-53)並且動脈內膜切除程序被用於在其它血管床中治療阻塞性血管疾病(Vasc.Surg.1999；33461-70)。
在動脈內膜切除術中，頸動脈被切割出縫並且血小板被從裂縫區域的血管中除去。在一個手術中，頸動脈分叉部分通過該患者頸部的切割而被暴露，並將血管鉗置於閉塞處的任意側以將其分離，並且進行一次切開以打開該動脈。除去該閉塞部分，灌注並吸出該分離區域，並且閉合該動脈裂縫。去除血管鉗以重建通過該動脈的血流。血管鉗中所包含的栓塞物和碎片可能在頸動脈打開後導致相當大的問題，這可能使血液流入先前分離的區域。
儘管動脈內膜切除是一種有效的治療方法，但該方法經常使外膜和成血栓的內皮下層被暴露。儘管頸動脈內膜切除術的效果不錯，該手術可能會導致一些併發症，包括血栓形成以及內膜增生，這可以導致消除該介入處理的良性效果的併發症或者產生新的問題。
臨床研究已經顯示了在緊接的手術後期間具有1-10％的頸動脈內膜切除術後中風機率，幾乎所有這樣的情況歸因於動脈內膜切除位置處的血栓形成以及隨後的腦栓塞形成(Stroke 1984；15950-55)。血小板的積累還可能因內膜增生的發展而導致再狹窄，這可能在手術後的兩年內發生。據報導再狹窄在10-20％的經動脈內膜切除手術的患者中在手術後2-5年內發生，根據頸部雙側超聲掃描的證實，其中大多數是由於內膜增生、內膜增厚以及血管直徑減少所造成(J.Vasc.Surg.1986310-23)。
血管壁針對機械誘導的損傷、手術介入、支架置入、某種血管移植物(動脈或者動靜脈植入物，例如透析植入物)的置入的細胞和分子反應是炎症、平滑肌細胞遷移、增殖和成肌纖維細胞轉化之間的一種複雜的相互作用，這種複雜作用一旦損傷發生便開始進行(Futura；1997 p.289-317)。如果動脈受到疾病的嚴重損傷並且可能由於鈣沉積而硬化，介入可能會由局部的去內膜化和其下的細胞外基質成分的暴露而導致一定程度的額外傷害，所述的細胞外基質成分的例子如膠原和彈性蛋白。在一些患者中，過量的血小板和纖維蛋白原的募集可能隨後導致一種急性血栓阻塞。
使用經動脈內膜切除處理的大鼠頸動脈模型(Neurosurg 1985；16773-79)以及栓子切除球囊損傷模型(Lab.Invest 1983；49327-33)進行的研究已經證明當內膜細胞在血管損傷期間被剝離時，血小板開始粘附於被暴露的內皮下層。Spallone等人(Neurosurg1985；16773-79)通過使用掃描電鏡已經證明在一隻大鼠進行頸部動脈內膜切除術5分鐘後在該受損區域上形成了一種單層血小板。損傷後15分鐘觀察到了血小板的聚集和血栓的形成。動脈內膜切除30分鐘後，該位點被覆蓋以激活的血小板並且為纖維蛋白和紅細胞所包被。血栓的形成在損傷後3個小時達到頂峰，此時可觀察到一種厚的纖維蛋白-血小板層。血小板是這種血栓形成以及所導致的血栓的整合成分，但也可能在在內膜增生中起到一定的作用。
使用患血小板減少症的大鼠而進行的研究進一步證明與對照大鼠相比較頸動脈損傷後的內膜增生明顯降低(Proc.Natl Acad.Sci.USA 1989；868412-16)。一旦血小板粘附於受損血管的暴露的內膜下層它們便成為激活狀態並且釋放其顆粒。這些顆粒含有血管活性因子和凝血因子(5-羥色胺、ADP、纖維蛋白原、von Willebrands因子、血栓烷A2)以及生長因子(血小板生長因子、轉化生長因子-β以及表皮生長因子)(Circulation 1985；72735-40)。血小板增強內膜增生發展的精確機制尚未完全了解。研究顯示，血小板主要為中膜平滑肌細胞在內膜增生發展的第二階段向內膜的遷移提供了一種趨化刺激物(Vasc.Surg.1991；13885-91)。使用抗PDGF抗體進行的其它研究證實了在血管損傷後PDGF在新的內膜平滑肌細胞聚集中所起的關鍵性作用(Science 1991；2531129-32)。血小板增強內膜增生的發展的另一種可能的機制是通過損傷位點處的凝血酶的凝血級聯激活和隨後的聚集(J.Clin.Invest.1993；9194-98，J.Vasc.Surg.1990；11307-13)。另外，凝血酶已經證明為血小板激活的一種刺激物。忽略具體的準確機制，血小板在血管損傷位置的粘附和激活在血栓形成和內膜增生的發展中起著重要的作用，因此對血小板粘附和激活的抑制可能有助於防止或者降低血栓發生率和內膜增生的發展。
血小板對受損動脈壁的粘附在最初的情況下受到Von Willebrand因子(vWF)的介導，該因子為一種多聚的糖蛋白，該蛋白從內皮細胞中釋放並且在血液中循環，在其中該因子作為因子VIII的一種載體蛋白發揮作用(Annu.Tev.Biochem.1998；67395-424)。高度多聚化的vWF還包含在血小板的α-顆粒中進行循環，該因子隨著血小板的激活而從中釋放(Annu.Tev.Biochem.1998；67395-424)。在高度剪切的情況下，例如在血管中遭遇粥樣硬化斑或者機械介入的情況下，vWF可能通過其A 3結構域同表面暴露的膠原纖維結合(Biochemistry 1986；25(26)8357-8361，Blood 1987；70(5)1577-1583，J.Biol.Chem.1987；262(28)13835-13841)。結合於膠原的vWF隨後通過vWF-Al結構域中的一個表位的依賴於剪切的暴露而將血小板「拴住」，該結構域同血小板的GPIb/IX/V相互作用(Blood 1985；65(1)85-90，Blood 1985；65(4)823-831，Br.J.Haematol 1986；63(4)681-691)。因此，vWF作為膠原和血小板之間的一種橋梁而發揮作用，並且是血小板在流動中同膠原粘合的一個先決條件(J.Lab.Clin.Med.1974；83(2)296-300)。血小板在vWF周圍的轉動導致了微弱的粘附，但是還需要膠原和血小板表面的其它受體之間的其它的直接相互作用以輔助持久的血小板粘附、激活和聚集(Thromb.Haemost 1997；78(1)434-438，Thromb.Haemost 1997；78(1)439-444)。血小板上的直接膠原受體包括GPVI(Blood 1987；69(6)1712-1720，Thromb.Haemost 1999；81(5)782-792，J.Clin.Invest.1989；84(5)1440-1445)、GP Ia/IIa(α2/β1)(J.Clin.Invest.1989；84(5)1440-1445，Nature 1985；318(6045)470-472)以及較少量的GPIV(CD36)(J.Biol.Chem.1989；264(13)7576-7583)，甚至可能還有p65(J.Clin.Invest.1997；100(3)514-521)。在缺乏vWF輔助的血小板結合的情況下，這些受體被證明在介導血小板向血流中膠原的募集中過於微弱(Br.J.Haematol 1986；63(4)681-691)。最後，同纖維蛋白原結合的vWF通過同血小板GP IIb/IIIa的結合輔助了血小板的交聯和進一步的激活(J.Clin.Invest.2000；105(6)783-791)，為形成中的血栓提供了穩定性和強度。
隨著血小板GPIIb/IIIa和ADP受體拮抗劑的出現，近年來在抗凝治療中已經獲得了巨大的進步(Coronary Art Dis 1999；10(8)553-560，J.Am.Coll.Surg.2000；191(1)76-92)。但是，這些策略並非被設計用於抑制血小板同暴露的膠原纖維的初始粘合，並且儘管GP IIb/IIIa拮抗劑在衰減血小板-血小板間相互作用中具有效力，但血小板仍然粘附於受損的血管壁(Blood 1993；81(5)1263-1276，Circulation 1995；91(5)1354-1362)。進一步，血小板的激活幾乎肯定延續於聚集和急性血栓形成之外，而亞急性和慢性內膜增生的進展至少部分受到有絲分裂原調節物的影響，例如由激活的血小板釋放的血小板源生長因子(PDGF)。事實上，PDGF的抑制已經被證明能在多種動物中降低內膜增生(Science 1991；253(5024)1129-1132，Circulation 1999；99(25)3292-3299)。
患有急性心肌梗塞的患者體內的循環vWF增加，並且vWF水平同不良的預後正性相關(Circulation 1998；98(4)294-299)，這暗示了vWF的病理生理意義(Thromb Haemost 2000；84204-209，Circulation 1998；98(4)294-299)。體內研究已經進一步顯示中和性的抗vWF抗體能抑制實驗中的血栓形成，這證實了vWF在血栓形成中的關鍵性作用(Thromb.Haemost 1998；79(1)202-210)。進一步，隨著不可避免地導致血管壁的損傷和膠原的暴露的血管成形術在急性冠狀動脈症候群的用途越來越廣泛，對於在血小板粘附-激活-聚集級聯中進行儘可能早的藥物介入的策略的需求不斷增加。
目前用於控制血小板粘附、激活和隨後的血栓形成以及內膜增生的兩條主要治療路線是抗血小板藥物以及抗血栓給藥。儘管諸如阿司匹林這樣的藥物通過抑制環氧化酶途徑而有效地阻斷血栓烷A2的合成，但它們不能阻止膠原所誘導的血小板粘附和激活，這可以刺激內膜增生的發展。肝素作為一種抗凝血藥物的應用伴隨著一些併發症以及限制，這包括某種不可預知的藥物反應、對緊密的實驗室監控的需要、對抗同血塊結合的凝血酶的活性有限、多個抑制位點、對抗凝血酶III的依賴性、大出血的危險以及對連續輸注的需求。很明顯，一種理想的治療藥物應當產生位點特異性和局部效果而沒有全身的影響或者廣泛的凝血紊亂。
加速導致血栓形成的級聯事件以及隨後的內膜增生的關鍵性步驟為血管損傷處的暴露的內膜下膠原同粘附於該暴露膠原的血小板單層之間的相互作用。因此，一種針對血小板同內膜下膠原粘附的抑制劑可用於阻止或者至少降低血栓和內膜增生的發展。
幾種來源於水蛭的物質據報導可抑制膠原-血小板相互作用(Blood 1995；85(3)705-711，Platelets 2000；11(2)83-86，J.Biol.Chem.1992；267(10)6893-6898，J.Biol.Chem.1992；267(10)6899-6904，Blood Coagul Fibrinolysis 1991，2(1)179-184)。一種分離自Hirudo medicinalis的具有纖維蛋白解聚活性的肽異構酶，即去穩定化酶，據報導可抑制由包括膠原在內的多種激動劑所誘導的血小板的聚集，但該酶據信可直接同血小板的膜相結合(Platelets 2000；11(2)83-86)。水蛭抗血小板蛋白(LAPP)為一種來自於Haementeria officeinalis的約13kDa的蛋白，該蛋白抑制血小板在靜態條件下(J.Biol.Chem.1992；267(10)6899-6904，Thromb.Haemost 1999，82(3)1160-1163)以及在高度流動條件(Arterioscler Thromb.Vasc.Biol.1995，15(9)1424-1431)下對膠原的粘附，其效應針對vWF和血小板GP Ia/IIa所介導的對膠原的結合(Thromb.Haemost 1999，82(3)1160-1163)。Calin為一種來自於Hirudo medicinalis的約65kDa的蛋白質，已經發現了該蛋白的簡單的活性模式。Calin同樣抑制靜態或者流動狀態下的膠原-血小板相互作用(Blood 1995；85(3)705-711，Blood Coagul Fibrinolysis 1991，2(1)179-184，Thromb.Haemost 1999，82(3)1160-1163)。進一步，LAPP和Calin為膠原所誘導的血小板的聚集的強力抑制劑，它們抑制聚集的濃度同它們阻斷vWF同膠原相結合相類似(J.Biol.Chem.1992；267(10)6893-6898，Blood Coagul Fibrinolysis 1991，2(1)179-184，Blood 1995，85(3)712-719)。
LAPP和Calin已經在體內成血栓模型中進行了評估，取得了不完全的成功。LAPP不能在狒狒動靜脈分流中降低包被以膠原的植入物上的血栓形成，儘管這些藥物的使用抑制了膠原所誘導的血小板聚集(Arterioscler Thromb 1993，13(11)1593-1601)，而Calin在倉鼠靜脈血栓模型中以依賴於劑量的方式抑制血栓的形成(Blood1995，85(3)712-719)。
用於支架或者導管的非成血栓以及抗成血栓包被物為本領域所已知。非成血栓的包被物和產品基於經修飾和改進的聚合物，其實例在WO9301221和WO9830615中給出。
抗血栓和抗再狹窄包被物一般是生物相容性的包被物，這些物質還可用作為局部藥物遞送的貯存器。這些包被物主要基於水凝膠，其實例在用於製備各種不同類型的水凝膠和包被藥療設備的方法的專利文獻之中，包括WO92111896、WO9811828、WO0147572、EP0887369和WO0139811。
該包被物中所含有的治療物質的釋放特徵可通過改變聚合物層的厚度或者選擇影響選定的生理化學特性(例如電荷、疏水性、親水性)的具體的聚合包被物以及/或者通過將該包被物製成不同的層面來進行調節。聚合物選擇的標準以及釋放速度的最優化為該領域中的普通技術人員所了解。其它包被物由Fischell(Circulation，1996，941494-95)、Topol等人(Circulation，1998，981802-20)以及McNair等人在device Technology，1996，16-22描述。
支架、線和導管在心血管系統中的使用是一種常見的操作，血管壁的損傷、栓塞和隨之的再狹窄是心臟病專家在手術介入或者導管插入過程之中或者之後所關心的主要問題。替代性的方法，諸如動脈內膜切除術，可導致類似的問題。涉及對動脈的操作的每個過程，即，血管手術和血管成形術，它們對於內膜增生的發展較為敏感。用於防止或者降低內膜增生的發展的方法的用處如何強調亦不為過，一種能夠做到這些並且不產生全身影響的方法則更為令人振奮。
因此，對於抑制病理生理(例如血小板粘附)中的最早期事件的新的改良藥物和方法的需求是很明顯的，並且在該領域中的貢獻被期望能夠極大地降低血管成形術或者手術過程隨伴隨的發病率和死亡率。
發明概述大體上，本發明涉及到近來所描述的血小板粘附因子乳清酸向某種管腔內或者其上的位置中或者向該位置上的引入，該管腔位於某種組織內，即，脈管系統或者一種器官，該引入所處的條件使得乳清酸可被局部應用作為一種表面試劑或者作為一種在其表面的粘附性包被物，從而阻止和抑制某種針對損傷的不良的血栓形成和/或者再狹窄反應，該損傷反應於血管成形術、支架、透析植入物和其它血管植入物，還涉及到對良性增生性瘢痕形成的治療以及對不穩定的動脈粥樣硬化性斑的治療和鈍化。
乳清酸為一種新近被描述的(WO0056885)重組12kD蛋白，該蛋白最初分離自一種水蛭。該蛋白抑制血小板同動脈壁膠原在高度剪切條件下的依賴於vWF的結合，並且本發明的一個方面使得乳清酸適於抑制動脈血栓。另一種新的方面是，乳清酸可被用作為損傷位點的一種局部試劑，該試劑具有降低血栓形成和/或內膜增生而不具有任何全身反應的優點。這代表著一種特徵，該特徵具有特異性和局部化的效應，該特徵非常適於外科醫生或者介入放射學家等的需求。
乳清酸可同多種治療劑進行組合以用於定點遞送。在冠狀動脈中的應用的例子為抗血栓形成劑，如前列環素和水楊酸鹽，所述的例子還有溶栓劑，如鏈激酶、尿激酶、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)以及茴香醯化血纖維蛋白溶酶原-鏈激酶激活劑複合物(APSAC)，還包括血管擴張劑，即，硝酸鹽和鈣通道阻斷藥物，抗增殖劑，即，秋水仙鹼和烷化劑，嵌入劑，生長調節因子，例如白細胞介素、轉化生長因子-β以及血小板源生長因子同類物、針對生長因子的單克隆抗體，甾族和非甾族的抗炎劑以及其它的可調節血管張力、功能、硬化以及針對受損血管或者器官的癒合反應的試劑。抗生素也可包含在本發明的組合或者包被物中。進一步，一種包被物可被用於實現定位於血管壁內的藥物遞送。通過活性試劑在可膨脹聚合物中的摻入，該活性試劑應可通過該聚合物的膨脹而被釋放。
在一個實施方案中，該包被物由一種水凝膠而製成，例如聚環氧乙烷、白蛋白、親水的聚異丁烯酸酯和疏水的聚尿烷。
例如，本發明進一步提供了乳清酸及衍生物通過局部藥物遞送設備/導管或者通過支架以及支架包被物以及血管植入物和植入物包被物技術的用途。本發明還提供了以乳清酸組合物進行給藥的方法，該組合物可在某一局部區域隨時間稀釋出受控量的乳清酸。
特別地，本發明的一個實施方案涉及到基於導管的設備在乳清酸局部遞送中的用途。乳清酸乳清酸還可以結合其它治療劑或者單獨使用，它們使用導管從聚合物基質中進入體內組織。對於在本方法中使用的聚合物材料的基本的要求是生物相容性和藥物釋放特徵，這些特徵可針對具體的用途進行適配。
乳清酸的局部受控釋放可單獨通過滲透、離子電滲、電穿孔而達到，或者通過將離子電滲和電穿孔進行組合而用於釋放並且將乳清酸有效地摻入血管腔內。在優選的情況下，該導管能夠進行一些被設計用於在選定的血管腔內維持高濃度藥物的程序以使其提供一種改善的血管包被物，該包被物為單獨的乳清酸或者還含有其它的治療藥物。
本發明特別可應用於乳清酸在介入性心臟病學處理過程中以及在其後的局部遞送，所述的處理過程如血管成形術和支架植入以及動脈內膜切除術。
發明詳述從多形漢遜氏酵母中表達並分離了用於本發明的適當的重組乳清酸，並且該乳清酸被發現可通過阻斷vWF同膠原的結合而發揮活性並且有效地防止了血小板同膠原在高度剪切條件下的粘附。乳清酸劑量依賴性地抑制純化的人類vWF對人類I型和III型膠原(IC50＝0.23±0.004和0.81±0.04μgml-1)的結合以及對小牛皮膚膠原(IC50＝0.44±0.008μgml-1)的結合。進一步，乳清酸針對人類、嚙齒類和豬血漿vWF同這些膠原的結合表現出類似的抑制活力。在高度剪切條件(2700s-1)下的一個流體腔室內，乳清酸劑量依賴性地強效抑制膠原包被表面上的血小板聚集(IC50＝0.96±0.25μgml-1)，但在較低的剪切的情況(1300s-1)下可發現該劑量依賴曲線的右移(IC50＝5.2±1.4μgml-1)。表面等離子共振分析揭示了乳清酸對III型人類膠原的高親合性和低親和性結合位點(分別為Kd＝5×10-8M和2×10-6M)，並且儘管在高度剪切下抑制血小板粘附的低濃度(即，高親和結合位點飽和)乳清酸對於不依賴於vWF的膠原誘導的血小板聚集沒有效果，但高濃度(即，低親和位點飽和)下被發現可抑制血小板聚集。這些數據表明乳清酸為血小板同膠原依賴於vWF的粘附的一種強力抑制劑，這構成了其作為抗血栓劑的療效的基礎。
該研究進一步展示，乳清酸不僅劑量依賴性地強效地抑制vWF同小牛皮膚膠原的結合，而且抑制其同人類I型和III型膠原的結合，這兩種膠原均在動脈壁內皮下層含量豐富並且被認為在血小板-血管壁相互作用中十分重要(Thromb Haemost 1997，78(1)434-438)。由於膠原-vWF-GP Ib/IX/V相互作用僅僅發生在充分的高度剪切情況下，因此本發明的一個重要方面是證明乳清酸不僅在靜態條件下具有效力，並且在更加接近於體內所面臨的環境中也具有效力。在一種可以改變剪切力以模擬這種環境的流體腔室中，乳清酸明顯地抑制了血小板向膠原的聚集，特別是在高度剪切的情況下。低度剪切的結果是劑量反應曲線的右移，這是值得注意的，因為這意味著乳清酸的體內效能可能定位於高度剪切的區域，在該情況下血液層流的打亂是由在血液中內膜表面的變化所導致，例如在動脈粥樣硬化斑存在的情況下或者在機械介入之後。
以乳清酸進行的表面等離子共振揭示，膠原可能具有兩種獨立的乳清酸結合位點，一個具有高親和性，另一個具有低親和性。乳清酸對vWF同膠原的結合的抑制可解釋為高親和性位點的飽和，其IC50值為約5×10-8M，即，等於該位點的解離常數。由於膠原所誘導的不依賴於vWF的血小板聚集僅僅在很高劑量乳清酸下被抑制(高於100μM)，看起來低親和性膠原結合位點相關於直接的膠原-膠原受體相互作用的抑制。
本發明的另一個目標是乳清酸影響經動脈內膜切除處理的血管的局部環境的效果，該影響效果並不需要全身的分布並且並不改變血小板的功能或者改變其凝聚，這使它成為一種理想的用於在血管手術和介入放射性程序過程中的表面應用的藥徵。
在本發明的這方面中，使用先前所描述的大鼠頸動脈切除術(CEA)模型(J.Vasc.Surg.1998，28909-918)對乳清酸療效進行了研究。PLT激活被認為是I H所導致的CEA後血栓形成和再狹窄的初始步驟。經觀察，乳清酸在腔室表面的表面應用將減低血小板同經內膜切術的動脈的粘附，並且由此而降低手術後的血栓形成和IH。
概括這些實驗結果，在兩個不同的手術後時間對乳清酸的抗血小板粘附效果進行的評估表明，在經過乳清酸處理的大鼠體內在頸動脈內膜切除後的3個小時(圖4)和24個小時(圖5)的粘附血小板數量同對照大鼠相比較明顯降低。
血小板粘附在第3個小時時降低了59％(每格64±17.2比155±33.4PLT，P＝0.05)，在第24個小時時降低了77％(每格35±11.3比149±36.6PLT每格，P＝0.0110)。在對照組中，在第3個小時和第24個小時的血小板粘附很接近，但在經乳清酸處理的組中，所述的兩個時間的血小板粘附從每格64個血小板降至每格35個血小板。
圖6和圖7顯示的是使用掃描電鏡在2000×放大下觀察的在具有和不具有表面的乳清酸的情況下頸動脈內膜切除表面的典型代表。圖6A顯示的是在頸動脈內膜切除後3個小時的對照表面，注意所標記的細胞物質纖維蛋白鏈、大量的紅細胞以及大量的血小板的明顯富集。圖6B顯示的是在頸動脈內膜切除後3個小時的乳清酸處理表面。注意細胞成分的缺乏以及近乎空白的膠原表面。圖7A顯示的是在頸動脈內膜切除後24個小時的對照表面，血小板作為小白點十分明顯。圖7A顯示的是在頸動脈內膜切除後24個小時的乳清酸處理表面。經乳清酸處理後的血小板粘附明顯減少了。
在頸動脈內膜切除術後的乳清酸表面應用同對照組相比較明顯地降低了內膜增生的發展。度量I H所用的腔狹窄百分比經應用乳清酸後同對照相比明顯降低。這種IH形成的降低同PLT粘附的抑制相對應。對於腔狹窄，對照大鼠為29.8±6.8％，p＝0.0042的腔狹窄，而在經乳清酸處理的組中為10.9±1.8％的腔狹窄(圖6)。經乳清酸處理的大鼠的腔直徑高出對照大鼠18.9％。在頸動脈內膜切除術後2周，15隻對照大鼠中的5隻(15％)經組織學分析出現了頸動脈的完全血栓，而15隻經乳清酸處理的大鼠中無一產生頸動脈血栓。可能性Chi平方分析顯示可能性比為16.238，這說明對照組發生阻塞性血栓形成的可能性高出經乳清酸處理的大鼠16倍，P＝0.0156。
在乳清酸組中，沿著動脈縫合線未遇到出血增加的現象。在動脈內膜切除術後3和24小時，同對照大鼠相比較在經乳清酸處理的大鼠體內未發現出血時間和全身血小板計數的變化。
CEA模型很接近地模擬了人類CEA手術，因此其結果提出了一種機制，該機制針對在不影響血小板系統功能或者減弱止血效果的情況下減少血小板在動脈內膜切除位點的粘附和聚集的不良影響的降低。乳清酸在大鼠CEA中的簡單表面應用降低了血小板的粘附、聚集以及隨後的由於內膜增生所導致的頸動脈床再狹窄。
表3所示為出血時間和血小板計數的結果。在手術前和手術後的出血時間上未觀察到明顯的統計學變化。在乳清酸和對照大鼠之間未發現到血小板計數在統計學上有顯著的變化。
我們已經證明了在類似於動脈內膜切除術的血管損傷中血小板粘附和聚集有明顯的降低。這種降低的血小板粘附在動脈內膜切除術之後立即(3小時)可見，在24小時後也可見到。在24小時的效果很有意義，這是因為我們相信這種效果並非由於乳清酸在膠原上的直接抑制效應所造成(乳清酸的血漿半衰期是90分鐘)，而是由於對血小板聚集的初始抑制以及隨後對血小板激活級聯的破壞所導致。一旦血小板經初始抑制而不粘附於暴露的膠原，該血小板級聯則無以為繼。圖4和圖5表明乳清酸在新近受損的血管上的表面應用可以在很大程度上抑制了血小板的粘附。在第3和第24小時時乳清酸分別抑制了血小板粘附的60％和75％。這種抑制從在第3和第24小時對照組和乳清酸處理的動脈之間在細胞成分沉積上的明顯差異可以看出(圖7和8)。我們所提出的這種細胞反應上的缺乏是由於血小板粘附的抑制所造成。這是一種獨特的治療模型，該治療用於抑制血小板對受損血管的粘附。在頸動脈內膜切除術後2星期，同經乳清酸處理的大鼠相比對照大鼠具有明顯減少的管腔直徑(圖9)。在經乳清酸處理的大鼠體內，內膜增生的發展量明顯降低，這同血小板粘附和聚集的降低相對應。同血小板粘附的減少相關的內膜增生和血栓形成的減少的發現提供了血小板粘附降低的臨床上實質性的終點以及結果。這表明對血小板聚集和粘附的位點特異性的非全身抑制導致了血栓形成和阻塞率的降低，因此而降低了頸動脈內膜切除術後相關的腦血管事件的發生率。內膜增生的水平和管腔狹窄的改善由一個明顯的發現進一步證明，該發現為在經乳清酸處理的大鼠體內血栓形成率有所降低。佔全體33％的對照大鼠表現出血形成，而經乳清酸處理的頸動脈無一形成血栓。該藥物缺乏全身效果具有特別的臨床意義。乳清酸的局部應用並不影響全身出血時間或血小板計數。這暗示血小板粘附和隨後的血栓形成以及內膜增生的減少是局部效應的結果。這些涉及乳清酸的新的發現特別地重要，這是因為對於能夠局部地抑制血小板粘附和激活的不良效應而不幹擾全身的止血機制的模式，其臨床用途範圍十分廣泛。
先前已經指出，多種治療性介入所誘導的局部損傷在理想的情況下應立即接受局部的處理。餘留未經處理的受損細胞啟動了一系列的進程，這些進程涉及到凝血、補體激活以及針對細胞因子的釋放的細胞反應、增生的誘導以及其它的生物活性進程。這些複雜的、相互關聯的進程一旦開始則終止十分困難。
因此，本發明的一個重要方面是將乳清酸直接定位於經受操作的組織。該局部應用的另一個方面是最小化了涉及到用於介入的藥物的全身作用的潛在問題。
在理想的情況下乳清酸處理可以與適當的治療介入同步進行給予，這可以通過將乳清酸摻入諸如球囊導管這樣的手術設備或者其它設備或其一部分的包被物中來完成。另一個方面還涉及到以乳清酸進行的對受損血管的直接包被。
另外，普通的乳清酸遞送方式也可被用於該發明，例如游離的流體形式，包括同其它的治療藥物組合應用。但是，聚合物/水凝膠基質與游離流體遞送相比具有特別的優勢。已被摻入聚合物基質的試劑的遞送並不需要在支持導管中具有額外的腔以將游離流體藥物溶液運入或者運出處理部位。
另外，該聚合物基質消除了藥物溶液的下遊滲漏的危險，該危險是由球囊在血管節段的密封缺陷所導致，這樣就避免了將非靶定組織暴露於高濃度的藥物的危險。
用在治療設備上或者將之作為包被物將乳清酸局部應用於受損血管的常用技術方案的例子是將乳清酸摻入聚合物或者水凝膠包被物中。
關於聚合物組合物，此處使用的術語「水凝膠」包括具有不同大小和容量的微孔或者間隙的合成聚合物，這些聚合物具有不同的生理化學性質，特別是凝膠基質的電荷或者親水/疏水特性，這些性質可在製造包被物或者被包被的設備時被引入。多種合成的高彈體和天然的聚合物材料為該領域的技術人員所已知。乳清酸可在聚合物生產時被摻入基質，或者在對該聚合物進行包被或者成形時為所需形狀時被添加入。另外，多種不同聚合物材料和製造方法可被用於本發明的聚合物基質。適當的聚合物材料的或者聚合物材料的組合的例子包括生物相容性和/或可生物降解的聚合物，但不限於此。
多種烷基烷基和氰基丙烯酸酯已被研究用於外科應用，並且一些異丁基氰基丙烯酸酯已被發現特別地適用。
典型的水凝膠聚合物可由單體混合物進行製造，該混合物含有40-60重量份的羥烷基烷基丙烯酸酯的某種純化的單酯，該單酯具有一個烯雙鍵，該混合物還含有40-60重量份的具有一個烯雙鍵的甲基丙烯酸單體以及0.001-5重量份的聚合引發劑。聚合可通過傳統的大規模聚合、溶液聚合、懸浮物聚合或者乳劑聚合工藝來完成。所使用的聚合工藝根據所需的聚合物體積以及所製造的最終產物的性質來決定。一種典型的水凝膠產物可通過單酯和甲基丙烯酸單體的摩爾比進行描述，該比例在1∶1到2.3∶1，在優選的情況下為1.5∶1，其中該聚合物的孔直徑大於90埃。
作為具有一個烯雙鍵的羥烷基甲基丙烯酸酯的單酯，可接受的化合物包括，但不限於2-羥乙基甲基丙烯酸酯、甘油基甲基丙烯酸酯、2-羥丙基甲基丙烯酸酯、縮水甘油基甲基丙烯酸酯、2-羥乙基丙烯酸酯和2-羥丙基丙烯酸酯。可接受的甲基丙烯酸單體為甲基丙烯酸、甲基丙烯醯胺5以及甲基丙烯酸腈。
聚合引發劑可根據聚合方法或者該聚合物的最終應用目的來決定。例如，當該聚合物用於形成某種固體時可使用自由基引發劑。
這種類型的優選的引發劑包括雙官能的聚酯，如2，5-二甲基-2，5-雙(2乙基己基過氧)己烷或者叔丁基過氧新戊酸酯。在替代情況下，當該聚合物以單體混合形式使用並在原位進行聚合最終被作為一種包被物時，該引發劑可為放射活化，例如UV催化劑2，2偶氮雙(2-甲基丙腈)或者偶氮雙丁腈(AIBN)。該引發劑並不限於應用於特定的聚合方法或者特定的終產物。例如，自由基引發劑可被應用於包被物，並且放射活化引發劑可被用於固體顆粒的形成。
除了基本上類似的單酯和甲基丙烯酸單體成分之外，該單體混合物可由痕量的較長鏈烷基丙烯酸酯或者甲基丙烯酸酯共聚單體進行增強，如環己基甲基丙烯酸、三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或者乙二醇二甲基丙烯酸酯。這樣的額外的共聚單體在需要提高聚合物強度的情況下增強了聚合物的交聯。痕量的這些共聚單體通常低於單體混合物總重量的0.1％。
在本發明中所使用的水凝膠聚合物可經成形以產生一種製品，該製品通過內在活動進行交聯，這樣所產生的製品不需要額外的交聯單體。
可生物降解的聚合物的其它例子為聚丙交酯、聚乙醇酸交酯、聚酐、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯以及這些化合物的共聚物和聚乙二醇。這些化合物可形成共聚物水凝膠或者交聯聚合物網狀物，聚合期間在其中可摻入用於增強的局部遞送的藥物，對於某些水凝膠可將藥物在聚合後裝入。根據藥物的分子性質可對優選的基質進行調整以控制向外的自由擴散。
包被以乳清酸的多種類型的導管和其它治療設備可根據它們經設計所面向的治療需求，或者根據用於局部遞送裝載有乳清酸的聚合物的更為具體的目的來進行構建和使用；本發明已經通過名為Bluemedical Devices BV GO的球囊導管進行了測試，該設備來自Bulemedical，但並不限於該型導管。
進一步的例子實施例1純化的vWF和血小板與膠原在靜態條件下的結合在微量滴定板中對結合於膠原的vWF進行了研究，該研究主要根據其它描述(Blood 1995，85(3)709-711)。以多種膠原，人類I型、III型膠原或者小牛皮膚膠原(Sigma)進行過夜包被，該包被通過將以125μg ml-1溶解於50mM乙酸的50μl膠原加至96孔微量滴定板中的200μl PBS內，以此促進復性。在以BSA封閉非包被位點之後，將純化的人類vWF(對於以小牛皮膚和I型膠原包被的板為1.25μgml-1；對於以III型膠原包被的板為0.625μgml-1)或者稀釋的普通血漿(人類血漿對於I和III型膠原為1/80；對於I型和小牛皮膚膠原為1/40；倉鼠、小鼠和豬血漿對於III型膠原為1/80；對於I型膠原和小牛皮膚膠原為1/20)在存在乳清酸的情況下加至孔中並且孵育2小時(稀釋的血漿)或者1小時(純化的vWF)。在進一步的洗滌步驟之後使用兔抗vWF抗血清(Dako，Copenhagen，Denmark)測定殘存的vWF同膠原的結合，該抗血清偶聯以辣根過氧化物酶，進行顯色後在492nm下測定所產生的光吸收。
當以人類I型膠原、人類III型膠原或者小牛皮膚膠原對微滴度板進行預孵育時，純化的vWF在存在乳清酸的情況下進行的隨後孵育伴隨著vWF-膠原結合的劑量依賴性抑制，其IC50值分別為0.23±0.004、0.81±0.04以及0.44±0.008μg ml-1(圖1)。當以稀釋的普通人類血漿代替純化的vWF時維持了乳清酸的這種抑制能力(表1)。乳清酸還抑制了vWF在稀釋的豬、倉鼠和鼠類血漿中與不同的被測膠原的結合，其對I型膠原具有一致的最高效力(表1)。
實施例2血小板在高度剪切下的粘附根據剪切力在控制血小板與膠原之間的依賴於vWF的粘附中具有重要作用的觀點(J.Lab.Clin.Med.1974，83(2)296-300)，進行了流體腔室灌注研究以檢測乳清酸在類似於受損或者病變動脈所遇到的流動條件下的抑制活性。如前所述(Blood 1995，85(3)709-711)，將小牛皮膚膠原包被於塑料蓋玻片之上。灌注在具有兩個蓋玻片支持物的平行板灌注腔中進行，該腔高0.4、0.6或者1.0mm，寬1.0cm，處於剪切速率分別約為2700、1300和300s-1的脈衝流之中(roller pump，Watson Marlow 603S，VEL，Leuven，Belgium)。以經抗凝處理的全血(0.2IU ml-1低分子量肝素，Clexane)對經膠原包被的蓋玻片灌注5分鐘，隨後以Grünwald-Giemsa對經漂洗的蓋玻片進行染色並且根據描述(Blood 1995，85(3)709-711)通過光學顯微鏡和成像分析估測血小板沉積，該估測使用表面覆蓋率作為定量參數。
在2700s-1的剪切速率下，乳清酸根據其劑量而抑制血小板粘附，其IC50＝0.96±0.25μg ml-1(圖2)。但是，在1300s-1的較為溫和剪切速率下觀察到了劑量反應曲線的明顯右移，其IC50＝5.2±1.4μg ml-1(圖2)。在300s-1的靜脈剪切速率下，乳清酸在高達10μg ml-1下不能抑制所灌注的血小板的粘附(數據未示出)。
實施例3通過表面等離子共振(SPR)進行的結合分析使用一種BIAcore 3000設備(BIAcore，Freiburg，Germany)通過SPR對蛋白質的相互作用進行了鑑定和性質測定。根據供應商所開發的方案使用偶聯試劑。同CM5傳感器晶片的偶聯通過激活的羧基同人類III型膠原(Sigma)的游離氨基之間進行。pH監測和偶聯化學在標準條件下進行(Anal Biochem.1991，198(2)268-277，JAIPressLtd.，1992)。為進行偶聯，將該膠原在10mM乙酸緩衝液(pH4.5)中稀釋至0.125μg ml-1，這產生了331共振單位(RU)的固定化材料。該基質被用於研究純化的重組乳清酸的結合，該乳清酸被稀釋入20mM Hepes(pH7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA，0.005％Tween20。所有的結合實驗均在20℃下進行。以乳清酸進行的滴定在濃度範圍從7.8nM到10μM之間。根據以下方程對所產生的實驗RU平臺值進行作圖Req/乳清酸濃度＝(-KA×Req)+(KA×Rmax)乳清酸對固定化的膠原表面進行的滴定產生了依賴於濃度的結合。進一步，與膠原結合的乳清酸的最高量所產生的信號高於1∶1結合模型的計算最大值。該結果指出在III型膠原上存在多於一個乳清酸結合位點，這進一步為一個觀察所證實，該觀察發現將數據對根據Langmuir的1∶1結合模型進行擬合給不出滿意的結果。
對SPR數據進行的Scatchard分析表明了兩個不同的結合位點的存在(圖3)，這兩個位點對於乳清酸具有顯著差異的親和性。平衡常數的計算結果是對於高親和性位點解離常數為5×10-8M，對於低親和性位點解離常數為2×10-6M。
實施例4血小板聚集乳清酸對血小板功能的特異性通過使用膠原、ADP、瑞斯西丁素、花生四烯酸或者血栓烷模擬物U46619作為激動劑在富含血小板的血漿中進行聚集研究來估測。將來自未用藥的健康志願者的檸檬酸處理的血液(3.13％)進行離心(15分鐘，100g)以獲得富含血小板的血漿，在誘導血小板聚集之前1分鐘加入乳清酸(終濃度為0-200μgml-1)，該誘導以膠原(0.5μgml-1)、ADP(2.5μM)、瑞斯西丁素(0.9μgml-1)、花生四烯酸(1.0mM)或者U46619(1.3μM)進行。對於各激動劑，在5分鐘期間均觀察到了最大聚集(幅度)。
乳清酸在終濃度高達40μgml-1的情況下仍不能抑制針對包括膠原在內的各種被測激動劑的最大聚集(表2)。然而，乳清酸能夠在100μgml-1的情況下部分地抑制膠原所誘導的血小板聚集(未示出)，在200μgml-1的情況下完全抑制，而由ADP誘導的聚集則不受影響，甚至在200μgml-1的乳清酸的情況下亦是如此。
實施例5大鼠CEA模型使用了一種大鼠CEA模型，該模型使用了以動脈切開術進行的開放技術、內膜和部分中膜的直接去除以及動脈的縫合。一組大鼠接受了乳清酸而另一組大鼠作為對照。終點測量包括，1)PLT粘附，2)成血栓速率，3)內膜增生的發展。在縫合前乳清酸被直接應用於經動脈內膜切除的頸動脈表面。經製備的頸動脈電子顯微照片(2000×放大)被用於PLT聚集的定量分析。使用一種標準化的覆蓋網格計算總PLT數量。通過對經彈性蛋白染色的頸動脈切片進行計算機輔助的形態分析以及IH區域的直接測量來測定IH和血栓形成。
實施例6頸動脈內膜切除術以異氟醚在鐘形皿中鎮靜小鼠，稱重並且隨後以氯胺酮(100mg/kg)以及乙醯丙嗪(1mg/kg)的組合進行腹膜內麻醉。根據對後爪刺激缺乏反應來確認充分的麻醉之後，將4cc的生理鹽水進行在後背中上部區域進行皮下注射以作為液體藥劑(10cc/kg)來補償手術內血液的損失。隨後在頸部區域剃毛並以7％的異丙醇進行備皮。使用無菌技術和解剖顯微鏡(×40，sz4001ympus，Olympus America Inc.，Melville，NY)產生一個中線頸部切口。將表層肌肉分開並將切割進行至右側頸動脈水平。將該區域中的頸神經分離以保護咽功能並且防止手術後的呼吸損害。
在頸動脈充分暴露之後，使用3-0絲線止血帶進行對約1.5cm遠的分叉處的近端和遠端控制。使用一個角膜刀進行了一處動脈切開並且用微型剪將之擴展至長6mm。使用一個27號針頭以兩條相距約2mm的平行線在血管內膜上橫向刻痕。以微型鑷子除去內膜和中膜層。乳清酸組的大鼠接受了5μl的乳清酸溶液，該溶液被直接應用於經過動脈內膜切除處理的表面。以running 10-0單絲尼龍縫合線(MS/9，Ethilon，Ethicon Inc.，Somerville，NJ)從遠側端開始將該動脈切口封閉。首先除去遠端的止血帶以估測縫合沿線的止血程度，隨後除去近端的止血帶。施用乳清酸的時間為5分鐘，該時間為動脈閉合的時間。以無菌藥棉敷藥器輕輕填壓縫合沿線的出血處直至達到止血。以便攜都卜勒儀估測頸動脈內膜切除的頸動脈以證實其開放性。隨後以running 3-0可吸收縫合線縫合表層肌肉和皮膚。
實施例7血小板粘附在血小板粘附亞組中，在頸動脈內膜切除後3小時或者24小時將大鼠重新麻醉並且收集經動脈內膜切除處理的頸動脈並將其在4％的glutaldehyde溶液中固定。在收集過程中，沿著縫合位置將頸動脈縱向打開，由此而暴露經過動脈內膜切除的區域。隨後以四氧化鋨對動脈進行後固定，在級進醇系列(graded alcohol series)中脫水，以CO2進行臨界點乾燥(1072psi和31.1℃)，以金鈀包被，並將之置於掃描電鏡中(JEOL JSM 5410，JEOL，USA Peabody，MA)。在2000×放大倍數下掃描經動脈內膜切除的區域並且獲取照片。匹配這些照片圖像並將之排列於一幅拼貼圖中以進行對一個區域的可視化處理，該區域大於掃描電鏡的監視器的單視野。一旦組成照片的拼貼圖便以一個透明的覆蓋網格將其覆蓋。對所有標本的照片使用同一個覆蓋網格。使用116個方塊以計算各張照片中的血小板總數。116是在所有的照片拼貼圖中可被一致計數的最大方塊數。由兩名相互隔離的觀察者來進行血小板計數。
實施例8內膜增生在頸動脈內膜切除兩周後，將內膜增生組中的大鼠麻醉並且暴露經動脈內膜切除的頸動脈。沿中線打開腹部並且暴露遠端主動脈和下腔靜脈。橫切該靜脈腔並將20號導管插入遠端主動脈以灌注100毫米汞柱的生理鹽水直至該靜脈腔流出物流盡。下一步，將相同體積的10％的緩衝福馬林以100毫米汞柱進行灌注以完成灌注-固定工藝。將受操作的頸動脈切除一個一釐米的片段並且置於10％的福馬林中至進一步的組織學處理。該動脈經石蠟封閉、切片、並且以Verhoeff’s和Van Gieson’s染液進行彈性蛋白染色。以3毫米的間隔切取多個切片以使切片區域標準化，各個切片沿連著10-0尼龍縫合動脈切口的封閉處。使用KODAK DC 120 Zoom數位相機(Eastman KODAK Company，Rochester，NY)對彈性蛋白染色的切片進行照相。任何形成血栓的切片均在此時注出。未形成血栓的圖像被下載至一臺計算機並且使用National Institute of Health(Bethesda，MD)的ImageJ Software程序0.99i版對頸動脈的管腔面積進行分析。該軟體包使我們勾繪出內膜增生的內部面積並且由此而完成對血管腔的橫切面的精確測量。同樣對內膜增生的外部面積進行測定。測定這兩個面積之間的差異(內膜增生的外部面積減去實際管腔)以作為內膜增生的絕對面積。由於動脈的橫切面具有各自不同的形狀，所以該值以內膜增生的絕對面積同內膜增生的外部界限的比例來表示，並且以管腔狹窄百分比進行報導。該比例代表了該管腔面積被內膜增生所佔據的比例並且可進行對不同大小的動脈橫切片之間的比較(4)。在兩名相互隔離的觀察者之間觀察到了測量值之間的最小變異。
實施例9出血時間和血小板計數為估測乳清酸對於全身血小板計數和出血時間的影響，對12隻大鼠的血小板計數和出血時間進行了測定。如果有必要從各只大鼠中獲取約1-1.5cc的手術前血樣，這是大鼠總血量的相當大的一部分。有鑑於此，可以預期在手術後對照組和乳清酸組大鼠的血小板計數應有所減低。為估測乳清酸對血小板計數的影響，我們通過從手術後血小板計數中減去手術前血小板計數以獲得差值來測定各大鼠在血小板計數上的差異。使用一個2×2的係數排列ANOVA模型以分析血小板計數的差異。該分析顯示在對照組和乳清酸處理大鼠之間的血小板計數差異上沒有統計學意義。所有的大鼠均在手術前接受了血小板計數和出血時間測定。六隻大鼠進行了頸動脈內膜切除術並且在手術後3個小時進行收集同時測定出血時間和血小板計數，剩下的6隻大鼠在手術後24小時進行收集同時測定出血時間和血小板計數。各時間組中有3隻接受了表面乳清酸處理，其餘3隻作為對照。
通過在大鼠尾部末端2mm處進行橫切並將約4釐米的尾部浸入37℃的磷酸緩衝液來測定出血時間。測定從尾部橫切直至出血停止所耗的時間並作為出血時間。通過從頸靜脈取1-1.5cc的血樣來測定血小板計數，該血樣在Coulter STKS血液分析儀中進行分析，以×103的方式表達結果。
實施例10
統計方法所報導的為平均值±誤差。使用StatView程序(SAS InstituteInc.Cary，NC 27513)5.0版進行非成對t檢驗分析以比較乳清酸處理和對照組的粘附血小板數量、管腔狹窄百分比和出血時間。使用可能性Chi平方分析以估測在頸動脈內膜切除術後2周的血栓形成發生的機率。使用一個2×2的係數排列來處理ANOVA模型以估測手術前和手術後血小板計數的差異。
實施例11實驗動物根據兩個主要目標將Sprague-Dawley大鼠(350-400g)編入頸動脈內膜切除組中。1)血小板粘附的評估以及2)對由於內膜增生所造成的管腔狹窄以及成血栓速率的評估。大鼠以這兩個目標分成對照組和乳清酸處理動物組。所有的大鼠均進行了頸動脈內膜切除術(見下文)，乳清酸處理組大鼠在除去內膜/中膜之後立即接受了5μl乳清酸溶液在頸動脈管腔表面的表面施用。血小板粘附組包括在頸動脈內膜切除術後3個小時(n＝17)和24個小時(n＝19)的電子顯微評估。內膜增生組(n＝25)在進行頸動脈內膜切除術後兩周進行收集。
實施例12乳清酸包被的水凝膠導管的製備基於PA-12材料的表面已經通過將該設備浸沒入一種溶液而激活，該溶液含2mol-％的大分子引發劑(聚(十八烯-alt-馬來乙酸酐))以及溶於異丙醇的過酸酯(11-16mol-％)和0.5mol二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)/1mol大分子引發劑。在對大分子引發劑-/EGDMA包被物進行乾燥後，在120℃下將該包被物退火5個重複10分鐘(5bis10min)，這有助於提高該大分子引發劑在表面的固定程度由此而改善了交聯。
為最優化包被條件而使用了產生於PA-12載體片的水凝膠包被物。在包被之前，以異丙醇或者丙酮洗滌該片並進行乾燥。
由Vestamid(PA-12)組成的Blue Medical Devises GO型球囊導管(RX PTCA導管)被用於水凝膠包被。將100ml的5mol-％丙烯酸水溶液和0.2∶0.8mol-％的亞甲基∶丙烯酸進行混合併且用於包被這些片或者導管。在聚合化之後以水洗滌該包被設備並且在PBS緩衝液中再放置24小時。
此後，將該聚合物在60-80℃的烘箱中退火0.5到3個小時。
乾燥的水凝膠包被物的厚度在1到4μm之間，水凝膠在水溶液中的膨脹度為10到50g水凝膠溼重/1g水凝膠乾重。
當浸沒於pH7.4的PBS緩衝乳清酸溶液時(30分鐘)，所使用的濃度為50μg/ml。
有機溶劑被用於製備該包被物溶液，此時使用標準的小規模噴霧包被裝置將之噴灑於球囊導管之上，該裝置可購自EFD。


圖1.乳清酸對於純化的人類vWF與人類I型(圓形)和III型(方形)膠原以及小牛皮膚膠原(三角形)的結合的影響。對I型的IC50＝0.23±0.004μgml-1，對III型的IC50＝0.81±0.04μgml-1，對小牛皮膚膠原的IC50＝0.44±0.008μgml-1。
圖2.剪切力對於乳清酸在體外流動腔室內對血小板在人類III型膠原上形成聚集的抑制的影響。圓形所示為2700s-1的剪切速率(IC50＝0.96±0.25μgml-1)，而方形所示為1300s-1的剪切速率(IC50＝5.2±1.4μgml-1)。
圖3.對表面等離子共振所檢測出的乳清酸同固定化的人類膠原的結合的Scatchard分析，顯示了在III型膠原上存在高親和性(Kd＝5×10-8M，實線)以及低親和性(Kd=2×10-6M，虛線)乳清酸結合位點。
圖4.在頸動脈內膜切除後3小時同暴露的內皮下層表面粘附的血小板數量，比較乳清酸施用組(n＝7)和對照組(n＝10)。數據為平均值±SE。乳清酸組接受了5μl的乳清酸溶液向暴露的內皮下表面的表面施用。星號所示為0.05的P值。
圖5.在頸動脈內膜切除後24小時同暴露的內皮下層表面粘附的血小板數量，比較乳清酸施用組(n＝9)和對照組(n＝10)。數據為平均值±SE。使用掃描電子顯微鏡對血小板進行計數。乳清酸組接受了5μl的乳清酸溶液向暴露的內皮下表面的表面施用。星號所示為0.01的P值。
圖6.在頸動脈內膜切除後3小時的經內膜切除的大鼠頸動脈電子顯微照片(2000×)。A，對照表面。B，接受表面乳清酸(5μl)的表面。對照表面顯示出大量的細胞成分，包括纖維蛋白鏈、紅細胞和血小板。經乳清酸處理的表面顯示出細胞成分的明顯減少。
圖7.在頸動脈內膜切除後24小時的經內膜切除的大鼠頸動脈電子顯微照片(2000×)。A，對照表面。B，接受表面乳清酸(5μl)的表面。對照表面顯示出大量的紅細胞和血小板。經乳清酸處理的表面顯示出血小板粘附的明顯減少。
圖8.在頸動脈內膜切除後兩周的繼發於內膜增生的管腔狹窄百分比。所示為乳清酸(n＝15)和對照組(n＝10)。乳清酸組接受了5μl的乳清酸溶液向暴露的內皮下表面的表面施用。星號所示為0.004的P值。
圖9.通過頸動脈的橫切片，該圖顯示，同未經處理的對照組(A)相比較，在乳清酸處理過的動脈中(B)的內膜增生的降低。IH＝內膜增生。
表1.用於抑制血小板在來自於多種物種的PRP中同人類I型和III型膠原以及小牛皮膚膠原的粘附所必需的乳清酸的IC50濃度。
表2.乳清酸對於PRP中的由多種激動劑誘導的最大血小板聚集(％)的影響，顯示了這些試劑的終濃度。
表3.手術前和手術後的出血時間和血小板計數。
表1

表2

表3

權利要求
1.多肽乳清酸在製造一種藥物中的用途，該藥物用於在血管損傷或者動脈內膜切除術之後抑制血小板的聚集，該用途包括以一種治療有效量的防止血小板粘附的乳清酸對血管組織進行給藥，由此而抑制血栓形成以及再狹窄。
2.權利要求1的方法的用途，其中該血管損傷相關於動脈粥樣硬化、心臟移植血管病變、冠狀動脈介入後的冠狀動脈再狹窄、球囊血管成形術、支架置入、旋切術、包括頸動脈內膜切除術在內的動脈內膜切除術，透析植入分流器以及其它移植物吻合、不穩定心絞痛、急性心肌梗塞、中風、良性增生或良性前列腺增生。
3.具有覆蓋以水凝膠的表面和與包被物相關的用於提供一種抗血栓發生表面的工具的設備，該水凝膠摻入了一定量的生物活性的乳清酸以用於從該水凝膠中的局部遞送。
4.權利要求1的方法的用途，其中該乳清酸通過一種導管進行局部遞送，或者其中該乳清酸被摻入導管的腔內鋪面，該導管直接地局部導向組織。
5.權利要求1的方法的用途，其中該乳清酸被摻入一種局部給藥的聚合物，該聚合物允許了乳清酸的局部持續釋放。
6.權利要求5的方法的用途，其中該聚合物製劑化的乳清酸通過一種導管進行局部給藥。
7.一種導管設備，其特徵在於一種聚合物材料為該設備的一部分並且含有乳清酸。
8.權利要求1的方法的用途，其中乳清酸被摻入一種支架或者支架的包被物，該支架被局部置於該組織內或組織上。
9.權利要求1的方法的用途，其中乳清酸被摻入一種血管內移植物或者一種血管內移植物的包被物，該血管內移植物被局部置於該組織內或組織上。
10.一種包含權利要求1-9任意一項的試劑盒。
全文摘要
多肽乳清酸在製造一種藥物中的用途，該藥物具有顯著減少血管損傷或者動脈內膜切除術後的血小板粘附和聚集的能力。本發明進一步涉及到乳清酸的一種新的醫學用途，在該用途中乳清酸作為血栓形成和內膜增生的抑制劑，其中所述的多肽可被局部用作為表面試劑或者作為治療設備上的包被物或者摻入其中或與之相結合。
文檔編號A61P7/02GK1449291SQ01814660
公開日2003年10月15日 申請日期2001年8月23日 優先權日2000年8月25日
發明者C·巴尼斯, M·弗雷希, U·霍夫曼, J·格萊茨, W·斯特裡特馬特 申請人:默克專利股份公司