一種鼠抗黃麴黴毒素b的製作方法

2023-06-16 16:17:01

專利名稱：一種鼠抗黃麴黴毒素b的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種採用小鼠骨髓瘤細胞直接接種已免疫產生了抗體的小鼠製備鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的方法。
背景技術：
真菌毒素是產毒真菌分泌產生的次生代謝產物，是能引起人畜各種損害的天然有毒化合物。在已經發現的真菌毒素中黃麴黴毒素B1(aflatoxin B1，簡稱AFB1)是毒性最強的真菌毒素，其毒性、致癌性和汙染頻率均居生物毒素的首位。它汙染食品及飼料後，直接或間接進入人類食品鏈，威脅人類的健康和生命安全，危害程度與黃麴黴毒素的攝入量成正比。黃麴黴毒素廣泛存在與大米、玉米、花生、芝麻、大豆、菜籽等農產品和魚肉等食品中，其汙染食品及飼料的環節多，為此世界各國都規定了黃麴黴毒素B1食品及飼料中的最大允許含量並作為強制性標準，因此加強對食品及飼料中黃麴黴毒素B1的檢測、特別是速測，以便即使了解和掌握食品及飼料的衛生信息，是增強食品安全性的一個重要環節。
現有技術中常用的黃麴黴毒素B1檢測技術主要有薄層層析法、精密儀器分析法、免疫學分析法。其中免疫學分析法克服了前兩者的缺點，具有特異性強、靈敏度高、樣品前處理簡單、成本低、對實驗人員和環境的汙染危害小、適於現場批量檢測等優點。其中，放射免疫測定法和酶聯免疫測定法曾被喻為二十世紀九十年代分析技術的一次變革；近年免疫分析技術研究進展迅速，免疫親和微球純化及檢測技術又以更短的檢測時間和更準確的檢測結果顯示出更大的應用價值和應用前景。但要研究建立黃麴黴毒素B1的任何一種免疫學檢測技術，都必須先製備足夠的抗黃麴黴毒素B1抗體作為試驗材料。
國內外現有製備抗黃麴黴毒素B1抗體技術主要有以下兩種(1)利用大白兔、雞等成功製備抗AFB1血清多克隆抗體技術。大白兔、雞血量較充足，可收穫較多的多抗血清，但需要消耗較多昂貴的抗黃麴黴毒素B1的合成抗原，一般每次免疫抗原用量在500-2500μg，需要免疫4-7次；(2)採用B-淋巴細胞雜交瘤技術製備小鼠抗AFB1的腹水單克隆抗體技術。這種採用小鼠製備抗AFB1單克隆抗體的方法消耗黃麴黴毒素B1的人工免疫抗原也較少，但由於B-淋巴細胞雜交瘤技術中的細胞融合及篩選等環節技術難度高、要求嚴格，一般實驗室的普通研究人員難以掌握和製備成功。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術存在的不足而提供一種免疫抗原用量少，成功率高、製備方法簡單，抗體收穫量較大的鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的製備方法。
本發明為解決上述提出的問題所採用的技術方案為(1)取純種小鼠，按常規方法預養和篩選，篩選方法預養期間，用間接酶聯免疫固相吸附試驗(間接ELISA)或雙向免疫瓊脂擴散試驗檢測小鼠血清與人工免疫抗原的交叉反應情況，將存在交叉反應的小鼠淘汰，所述的人工免疫抗原為黃麴黴毒素B1與牛血清白蛋白的連接物(簡寫為AFB1-BSA)；(2)取篩選合格的小鼠進行免疫注射，每次免疫注射間隔周期為15-30天，在每次或第二次以後的每次免疫注射後第8-14天，取小鼠血清檢測抗黃麴黴毒素B1血清多克隆抗體的效價，直至檢測到抗體的間接ELISA效價達到1∶4000以上或抗體的雙向免疫瓊脂擴散效價達到1∶8以上，在此以後的一次免疫注射即為最後一次免疫注射，免疫注射方法第一次免疫注射，用無菌生理鹽水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配製成人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA為0.8-2毫克，向人工免疫抗原溶液加入等體積弗氏完全佐劑進行乳化，製備成人工免疫抗原乳化液A，用人工免疫抗原乳化液A進行皮下免疫注射，每隻小鼠注射量為0.1-0.3ml；第二次及以後免疫注射時，用無菌生理鹽水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配製成人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA為0.8-2毫克，向人工免疫抗原溶液加入等體積弗氏不完全佐劑進行乳化，製備成人工免疫抗原乳化液B，用人工免疫抗原乳化液B進行腹腔免疫注射，每隻小鼠注射量為0.1-0.3ml，最後一次腹腔免疫注射(已檢測到抗體的間接ELISA效價達到1∶4000以上或抗體的雙向免疫瓊脂擴散效價達到1∶8以上之後的一次)量為以前注射量(0.1-0.3ml)的1.2-2倍；(3)鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的製備，在進行最後一次腹腔免疫注射之前的第3-15天內給小鼠腹腔注射液體石蠟0.4-0.6ml，在進行最後一次腹腔免疫注射之前第8天到之後第4天內(注射液體石蠟後)再給小鼠腹腔直接注射(1-10)×106個活的鼠骨髓瘤細胞，5-10天後每天觀察小鼠腹水產生情況，及時採集小鼠產生的腹水，可反覆採集腹水，腹水中含抗黃麴黴毒素B1多克隆抗體；
(4)將所採集的小鼠腹水離心分離，取上清分裝，上清液中含有抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體，冷凍乾燥後或直接低溫保存，即完成抗黃麴黴毒素B1多克隆抗體的製備。
按上述方案，所述免疫注射的次數為3-7次；所述的皮下免疫注射為頸背部皮下免疫注射；所述的活的鼠骨髓瘤細胞為處於對數生長期的鼠骨髓瘤細胞；所述的反覆採集腹水的間隔時間為1-4天，反覆採集的次數為3-7次；所述的離心分離轉速為5000r/min以上，離心後取上清分裝，分別標記抗體效價和採集日期，冷凍乾燥後或直接保存於低溫冰箱。
按上述方案，所述的弗氏完全佐劑由弗氏不完全佐劑加入活卡介苗或死的結核分枝桿菌混合而成，最終濃度為2-20mg/ml；121℃滅菌15min後低溫保存備用。
所述的弗氏不完全佐劑由油劑石蠟油與乳化劑汙水羊毛脂混合而成，混合比例最常用的是2∶1；121℃滅菌15min後低溫保存備用。
弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑也可從市場上直接購得。
本發明採用人工免疫抗原黃麴黴毒素B1與牛血清白蛋白的連接物免疫小鼠產生了抗黃麴黴毒素B1血清抗體，給小鼠腹腔接種鼠骨髓瘤細胞，使小鼠產生腹水。小鼠抗黃麴黴毒素B1多克隆抗體隨腹水的分泌進入腹腔中，通過採集腹水製備出抗黃麴黴毒素B1多克隆抗體。
本發明的有益效果在於(1)節約免疫抗原。對難以獲得的、昂貴的黃麴黴毒素B1人工免疫抗原尤其合適。每隻小鼠每次人工免疫抗原的用量不超過250μg，而免疫其它動物(如兔、雞等)製備多克隆抗體每次需500-2500μg。
(2)成功率高。用於1隻兔免疫3次以內的黃麴黴毒素B1人工免疫抗原極難使1隻兔產生質量合格的抗體，但同樣量的黃麴黴毒素B1免疫抗原足夠10隻以上BALB/C小鼠免疫5次，按80％免疫成功率計算，獲得質量合格抗體的成功機率大大提高。
(3)製備方法簡單，抗體收穫量較大。經過3-7次免疫注射，當檢測到小鼠抗黃麴黴毒素B1血清抗體達到較高效價時，通過直接給小鼠腹腔注射液體石蠟和接種小鼠骨髓瘤細胞以及最後一次加大劑量的免疫注射，製備小鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體，使得每隻小鼠總計可採到效價與血清多克隆抗體效價相當的腹水多克隆抗體2ml-8ml；而按常規製備血清多克隆抗體的方法，實際每隻小鼠只能獲得0.4-1.2ml的血清抗體。本方法與採用B-淋巴細胞雜交瘤技術製備單克隆抗體相比，省去了複雜繁瑣的細胞融合及篩選的過程，製備過程和方法相對簡單，更易實現。
(4)抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體經過純化後，通過化學方法與氨基修飾的矽膠微球共價偶聯製備出黃麴黴毒素B1免疫親和微球；將黃麴黴毒素B1免疫親和微球作為填料製備成黃麴黴毒素B1免疫親和微柱，用於糧油及飼料中黃麴黴毒素B1的快速檢測方法中。
具體實施例方式
下面結合附圖
進一步說明本發明的一個實施例。
實施例1(1)取6-7周齡雌性Balb/c純種小白鼠12隻，預養7-8天，負壓採小白鼠尾血，以6000r/min離心30min分離血清，分裝，低溫保存備用。取少量血清採用間接酶聯免疫固相吸附試驗檢測血清與人工免疫抗原的交叉反應，將存在交叉反應的1隻小鼠淘汰。人工免疫抗原為黃麴黴毒素B1與牛血清白蛋白的連接物(簡寫為AFB1-BSA)。
(2)取通過篩選的Balb/c純種小白鼠，進行免疫注射，每次免疫間隔周期為26-30天。
第一次免疫注射時，用無菌生理鹽水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA，配製成人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA為1.0-1.2毫克，將等體積弗氏完全佐劑加入人工免疫抗原溶液中進行乳化，製備成人工免疫抗原乳化液A。給每隻小白鼠頸背部皮下免疫注射0.1-0.2毫升人工免疫抗原乳化液A。
第二次及以後免疫注射，用無菌生理鹽水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA，配製人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA為1.0-1.3毫克；向人工免疫抗原溶液中加入等體積弗氏不完全佐劑進行乳化，製備成人工免疫抗原乳化液B。給每隻小白鼠腹腔免疫注射0.1-0.2毫升人工免疫抗原乳化液B。自第二次免疫後，每次免疫注射後第9-12天採血，分離血清，採用間接酶聯免疫固相吸附試驗檢測抗黃麴黴毒素B1抗體，全體試驗小鼠抗體呈陽性。
(3)第四次免疫注射後第8天採小白鼠尾血，分離血清，採用間接酶聯免疫固相吸附試驗檢測抗黃麴黴毒素B1抗體，抗體效價達到了1∶4200，在第四次免疫注射之後第26-28天，進行最後一次免疫注射，給每隻小白鼠腹腔免疫注射0.2-0.3毫升人工免疫抗原乳化溶液B。在進行最後一次免疫注射之前第13-15天內，給小鼠腹腔注射液體石蠟0.5-0.6毫升；在進行最後一次免疫注射之前第5-8天內再給小鼠腹腔注射約(1-3)×106個處於對數生長期的P3-X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤細胞。從給小鼠腹腔注射小鼠骨髓瘤細胞當天起的第9-10天，觀察到小鼠腹部膨大，產生了腹水。及時採集腹水，每2-4天採集一次，反覆採腹水3-6次。
(4)每次採集的腹水在4℃下以8000r/min轉速離心分離10min，取腹水上清分裝，留少量腹水採用間接ELISA檢測腹水中抗黃麴黴毒素B1多克隆抗體效價，其餘置-70℃低溫冰箱保存備用。計算出從每隻小鼠採集分離到間接ELISA效價達到了1∶4200的腹水多克隆抗體的總體積從3.5-7.5毫升不等，分別標記抗體效價和採集日期。
實施例2(1)取5-6周齡Balb/c-nude裸小鼠15隻，預養9-10天，負壓採小鼠尾血，以6000r/min離心30min分離血清，分裝，低溫保存備用。取少量血清採用雙向免疫瓊脂擴散法檢測血清與人工免疫抗原的交叉反應，結果是15隻小鼠與人工免疫抗原都不存在交叉反應。
(2)取通過篩選的Balb/c-nude裸小鼠，進行免疫注射，每次免疫注射間隔周期為20-24天。
第一次免疫注射時，用無菌生理鹽水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配製成人工免疫抗原溶液，使每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA1.6-1.9毫克，將等體積弗氏完全佐劑加入人工免疫抗原溶液進行乳化，製備成人工免疫抗原乳化液A。然後，以每隻小鼠0.10-0.12ml人工免疫抗原乳化液A的劑量，給Balb/c-nude裸小鼠進行頸背部皮下免疫注射。
第二次及以後免疫注射時，用無菌生理鹽水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配製成人工免疫抗原溶液，使每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA1.6-1.9毫克；向人工免疫抗原溶液中加入等體積弗氏不完全佐劑進行乳化，製備成人工免疫抗原乳化液B。以每隻0.10-0.12毫升人工免疫抗原乳化液B的劑量，對Balb/c-nude裸小鼠進行腹腔免疫注射。自第二次免疫注射後，每次免疫注射後第8-10天採血，分離血清後，採用雙向免疫瓊脂擴散法檢測抗黃麴黴毒素B1多克隆抗體，淘汰1隻抗體呈陰性的小鼠。
(3)第五次免疫注射後第10天負壓採尾血，6000r/min轉速離心30min分離血清，採用雙向免疫瓊脂擴散試驗檢測小鼠抗黃麴黴毒素B1血清抗體的效價達到1∶16；在第五次免疫注射時間之後第20-24天，進行最後一次腹腔免疫注射，人工免疫抗原乳化液B用量增加到0.20-0.24毫升。在進行最後一次免疫注射之前4-7天，給小鼠腹腔注射液體石蠟0.4-0.5毫升；在進行最後一次免疫注射之後2-4天再給小鼠腹腔注射(5-7)×106個活的SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細胞。6-8天後每天觀察小鼠產生了腹水，及時採集腹水。每1-3天採集一次，重複採集腹水3-5次。
(4)每次採的腹水在4℃下，以7000r/min轉速離心分離20min，取腹水上清，分裝，取少量檢測腹水中抗黃麴黴毒素B1多克隆抗體雙向免疫瓊脂擴散試驗的效價，其餘冷凍乾燥後置-40℃低溫冰箱保存。計算出從每隻小鼠採集分離到雙向免疫瓊脂擴散效價達到1∶16的腹水多克隆抗體的體積從2.5-6.5毫升不等，分別記錄和標記抗體效價和採集日期。
權利要求
1.一種鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的製備方法，其特徵在於(1)取純種小鼠，按常規方法預養和篩選，篩選方法預養期間，用間接酶聯免疫固相吸附試驗或雙向免疫瓊脂擴散試驗檢測小鼠血清與人工免疫抗原的交叉反應情況，將存在交叉反應的小鼠淘汰，所述的人工免疫抗原為黃麴黴毒素B1與牛血清白蛋白的連接物；(2)取篩選合格的小鼠進行免疫注射，每次免疫注射間隔周期為15-30天，在每次或第二次以後的每次免疫注射後第8-14天，取小鼠血清檢測抗黃麴黴毒素B1血清多克隆抗體的效價，直至檢測到抗體的間接ELISA效價達到1∶4000以上或抗體的雙向免疫瓊脂擴散效價達到1∶8以上，在此以後的一次免疫注射即為最後一次免疫注射，免疫注射方法第一次免疫注射，用無菌生理鹽水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配製成人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA為0.8-2毫克，向人工免疫抗原溶液加入等體積弗氏完全佐劑進行乳化，製備成人工免疫抗原乳化液A，用人工免疫抗原乳化液A進行皮下免疫注射，每隻小鼠注射量為0.1-0.3ml；第二次及以後免疫注射時，用無菌生理鹽水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配製成人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA為0.8-2毫克，向人工免疫抗原溶液加入等體積弗氏不完全佐劑進行乳化，製備成人工免疫抗原乳化液B，用人工免疫抗原乳化液B進行腹腔免疫注射，每隻小鼠注射量為0.1-0.3ml，最後一次腹腔免疫注射量為以前注射量的1.2-2倍；(3)鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的製備，在進行最後一次腹腔免疫注射之前的第3-1 5天內給小鼠腹腔注射液體石蠟0.4-0.6ml，在進行最後一次腹腔免疫注射之前第8天到之後第4天內(注射液體石蠟後)再給小鼠腹腔直接注射(1-10)×106個活的鼠骨髓瘤細胞，5-10天後每天觀察小鼠腹水產生情況，及時採集小鼠產生的腹水，可反覆採集腹水，腹水中含抗黃麴黴毒素B1多克隆抗體；(4)將所採集的小鼠腹水離心分離，取上清分裝，上清液中含有抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體，冷凍乾燥後或直接低溫保存，即完成抗黃麴黴毒素B1多克隆抗體的製備。
2.按權利要求1所述的鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的製備方法，其特徵在於所述免疫注射的次數為3-7次。
3.按權利要求1或2所述的鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的製備方法，其特徵在於所述的皮下免疫注射為頸背部皮下免疫注射。
4.按權利要求1或2所述的鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的製備方法，其特徵在於所述的活的鼠骨髓瘤細胞為處於對數生長期的鼠骨髓瘤細胞。
5.按權利要求1或2所述的鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的製備方法，其特徵在於所述的反覆採集腹水的間隔時間為2-4天，反覆採集的次數為3-7次。
6.按權利要求1或2所述的鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的製備方法，其特徵在於所述的離心分離轉速為5000r/min以上。
7.按權利要求1或2所述的鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的製備方法，其特徵在於第一次免疫注射時，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA為1.0-1.2毫克，給每隻小白鼠頸背部皮下免疫注射0.1-0.2毫升人工免疫抗原乳化液A，第二次及以後免疫注射，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA為1.0-1.3毫克，給每隻小白鼠腹腔免疫注射0.1-0.2毫升人工免疫抗原乳化液B，最後一次免疫注射，給每隻小白鼠腹腔免疫注射0.2-0.3毫升人工免疫抗原乳化溶液B，在進行最後一次免疫注射之前第13-15天內，給小鼠腹腔注射液體石蠟0.5-0.6毫升；在進行最後一次免疫注射之前第5-8天內再給小鼠腹腔注射約(1-3)×106個處於對數生長期的P3-X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤細胞。
8.按權利要求1或2所述的鼠抗黃麴黴毒素B1腹水多克隆抗體的製備方法，其特徵在於第一次免疫注射時，使每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA 1.6-1.9毫克，以每隻小鼠0.10-0.12ml人工免疫抗原乳化液A的劑量，給小鼠進行頸背部皮下免疫注射，第二次及以後免疫注射時，使每毫升人工免疫抗原溶液中按重量計含AFB1-BSA 1.6-1.9毫克，以每隻0.10-0.12毫升人工免疫抗原乳化液B的劑量，對小鼠進行腹腔免疫注射，最後一次腹腔免疫注射，人工免疫抗原乳化液B用量增加到0.20-0.24毫升，在進行最後一次免疫注射之前4-7天，給小鼠腹腔注射液體石蠟0.4-0.5毫升；在進行最後一次免疫注射之後2-4天再給小鼠腹腔注射(5-7)×106個活的SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細胞。
全文摘要
本發明涉及一種製備鼠抗黃麴黴毒素B
文檔編號C07K16/14GK1696157SQ20051001861
公開日2005年11月16日 申請日期2005年4月26日 優先權日2005年4月26日
發明者李培武, 楊金娥, 張文, 丁小霞, 謝立華, 楊湄, 李光明 申請人:中國農業科學院油料作物研究所