人顱內生殖細胞腫瘤標誌物基因hesrg的應用方法

2023-12-08 20:00:31 2

專利名稱：人顱內生殖細胞腫瘤標誌物基因hesrg的應用方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，涉及人胚胎幹細胞相關基因(HESRG)的新的應用方法。
背景技術：
顱內生殖細胞腫瘤是遠東地區(包括中國、日本)青壯年高發的一類惡性腫瘤， 嚴重威脅著人民的生命安全。顱內生殖細胞腫瘤是由於在胚胎發育過程中，原始生殖細胞在遷移過程中受到某種因素的影響而遷移到了中樞神經系統的部位，從而導致了顱內生殖細胞腫瘤的發生。世界衛生組織(WHO)根據其病理特點將其分為生殖細胞瘤，絨(毛) 膜癌，卵黃囊瘤，胚胎癌及畸胎瘤五種。目前顱內生殖細胞腫瘤分子診斷的標誌物主要有 AFP (甲胎球蛋白)、HCG (人絨毛膜促性腺激素)、HPL (胎生乳素)、PLAP (人胎盤鹼性磷酸酶)、c-Kit、0CT4、Cytokeratin(細胞角質蛋白)、Nanog等。雖然這些指標的單獨或者聯合應用為顱內生殖細胞腫瘤的診斷提供了有用的信息，但它們均缺乏足夠的靈敏度和特異性例如AFP是人類認識較早的、較有價值的肝癌和生殖細胞瘤腫瘤標誌物，AFP在顱內生殖細胞腫瘤中主要表達在卵黃囊瘤、部分畸胎瘤及部分胚胎癌中，但同時其在消化道腫瘤 (如胃癌、胰腺癌、結腸癌、膽管細胞癌等)中也具有較強表達，缺乏足夠的特異性；HCG主要是妊娠期滋養層腫瘤和生殖細胞腫瘤的標誌物，顱內生殖細胞腫瘤中主要在絨毛膜癌、部分生殖細胞瘤及部分胚胎癌中表達，同時其在乳腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤等非妊娠期滋養層腫瘤和生殖細胞腫瘤中也有異常表達；HPL、PLAP、c-Kit、0CT4、Cytokeratin、Nanog等標誌物均在多種生殖細胞腫瘤中表達或只在某類生殖細胞腫瘤中部分表達，且在其他非生殖細胞腫瘤中也有表達，均缺乏足夠的特異性。而將上述各類標誌物聯合進行診斷時，由於各種標誌物的表達存在較多重疊而缺乏較好的互補也很難達到理想的結果。人胚胎幹細胞相關基因(Human embryonic stem cell related gene, HESRG)是我們利用晶片篩選、電子克隆、RACE等方法在人胚胎幹(ES)細胞中克隆和命名的一個人類新基因(Zhao Μ, Ren C (通訊作者)，Yang H, Feng X, Jiang X, Zhu B, Zhou W, Wang L，Zeng Y, Yao K.Transcriptional profiling of human embryonic stem cells and embryoid bodies identifies HESRG, a novel stem cell gene. Biochem Biophys Res Commun, 2007,362(4) :916-922 (IF2006 = 2. 855))，該基因在人ES細胞中高表達而在正常胎兒組織、成人睪丸組織、多種腫瘤(不包含生殖細胞腫瘤)和正常細胞系中均不表達，說明HESRG 基因的表達具有特異性。由於ES細胞及原始生殖細胞都是多能性細胞；且克隆該基因過程中，發現EST序列BF223023來源於生殖細胞腫瘤，因此我們通過RT-PCR、Real-time PCR以及免疫組化等方法檢測了其在中樞神經系統腫瘤內的表達情況，發現HESRG基因特異性表達於顱內生殖細胞瘤及胚胎癌中(表達陽性率達100% )，而在其他顱內的生殖細胞腫瘤及非生殖細胞腫瘤均不表達，說明HESRG是一種新型的特異性顱內生殖細胞瘤及胚胎癌的腫瘤標誌物。與上述各種標誌物相比，檢測HESRG的表達對於診斷顱內生殖細胞瘤及胚胎癌具有更高的靈敏度、準確度和特異性，同時HESRG與AFP、HCG等上述標誌物的表達具有較好的互補性，利用HESRG與上述一種或者兩種標誌物進行聯合診斷，可以準確地診斷各種類型的生殖細胞腫瘤。因此，HESRG作為顱內生殖細胞腫瘤的特異性標誌物在臨床診斷上擁有巨大的應用價值。

發明內容
本發明的目的在於提供一種人顱內生殖細胞腫瘤(胚胎癌和生殖細胞瘤)標誌物 HESRG基因在製備診斷和治療顱內生殖細胞腫瘤的產品上的應用方法。人顱內生殖細胞腫瘤標誌物基因HESRG用於製備診斷和治療人顱內生殖細胞腫瘤的產品；特別是用於製備診斷人顱內生殖細胞腫瘤的產品。所述的產品包括用RT-PCR、Real-time PCR、免疫檢測、原位雜交或基因晶片等方式診斷人顱內生殖細胞腫瘤的產品。所述的用RT-PCR診斷人顱內生殖細胞腫瘤的產品至少包括一對特異擴增引物。所述的用Real-time PCR診斷人顱內生殖細胞腫瘤的產品至少包括一對特異擴增引物。所述的用免疫檢測診斷人顱內生殖細胞腫瘤的產品包括與HESRG基因編碼蛋白結合的抗體。人胚胎幹細胞相關基因HESRG的克隆方法及步驟為利用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array晶片分析比較了未分化人ES細胞(H9)和分化7天的擬胚體 (7-day embryo id bodies, 7-day EBs)基因表達譜，檢測到在人ES細胞分化形成的7_day EBs中約1100個基因表達下調大於2倍及2200個基因表達上調2倍以上，並通過real-time PCR證實了晶片結果的可靠性。在表達下調2倍及以上的基因中，包含了許多已經證實在維持人ES細胞自我更新中發揮重要作用的基因。例如0ct4表達下調約14倍，Nanog表達下調約17倍，Sox2表達下調約2. 6倍。目前已初步揭示在維持人ES細胞多潛能性過程中發揮一定作用的基因也被檢測出在7-day EBs中表達顯著下調。例如TDGF1表達下調約11 倍；LEFTB表達下調約42倍，DNMBB下調約8倍等。此外，基因晶片檢測結果中包含了大量未知基因(假定蛋白和EST序列)，這些未知基因在人ES細胞分化時表達改變顯著，但它們的完整基因序列目前仍未獲得。其中兩個EST序列(GenBank登錄號BF223023、BC020935) 在人ES細胞中表達水平較高，尤其是來源於生殖細胞腫瘤的BF223023在未分化人ES細胞中表達水平與0ct4和Nanog相似，而當人ES細胞分化形成EBs時其表達顯著下調(19. 7 倍)，並且在多篇文獻報導的晶片結果中均有出現，提示我們該EST所代表的基因可能與人 ES細胞自我更新調控相關。將BF223023作為種子序列，在人EST資料庫中尋找與其匹配的序列，之後利用手工方法將所檢索到的EST重疊群拼接獲得一個長度約2330bp的序列。檢索NCBI網站的人類非冗餘基因資料庫未發現其它基因與該序列匹配，說明該基因是一個新基因，我們將其命名為人胚胎幹細胞相關基因(Human embryonic stem cell related gene, HESRG) (GenBank登錄號DQ445779)。HESRG新基因序列3，端包含一個polyA尾及AATAAA加尾信號，說明該序列包含完整3』非翻譯區。但是從基因序列分析尚不能確定其5』末端完整性， 因此我們利用Smart RACE PCR試劑盒擴增該基因完整的5，末端。最終我們得到=HESRG基因cDNA序列的全長為3141bp，定位於人類染色體3pl4. 3。將該基因與NCBI中非冗餘核酸資料庫進行比對，結果顯示HESRG基因僅與人類及類人猿的基因組序列匹配，在其它物種中均未發現有相似序列，提示HESRG基因可能是一種靈長類動物ES細胞特異性表達的新基因。通過Northern blot確定在人ES細胞中HESRG的兩個轉錄本，分別是3. Ikb和 1.2kb。利用NCBI網站的ORF Finder在線程序預測HESRG基因編碼框架(open reading frame, ORF)。結果顯示HESRG的mRNA序列包含兩個候選ORFs，它們均可能編碼蛋白質。候選0RF-1的起始密碼子CTG位於2-4bp處，終止密碼子位於668_670bp處；候選0RF-2的起始密碼子ATG位於2245-2M7bp處，終止密碼子位於M85_2487bp處。0RF-1編碼包含222 個胺基酸的蛋白質HESRP-1，預測分子量為MkD，理論等電點為9. 37，包含亮氨酸拉鏈結構及蛋白激酶C磷酸化位點，在線軟體LOCtree預測該蛋白表達定位於細胞核內。HESRP-I與多個假定蛋白有較高同源性，並與核糖核苷酸二磷酸還原酶(RNR)及E2F家族成員E2F-7 有部分同源性。根據生物信息學分析我們推測HESRP-I可能作為轉錄因子，參與組織發育和細胞分化過程。0RF-2編碼蛋白質HESRP-2的預測分子量為8. 7kD，理論等電點為5. 75， 無典型蛋白結構域。通過融合基因表達策略、Western blot和免疫細胞化學檢測等手段， 我們現已確定ORFl是HESRG蛋白編碼框。HESRG基因在人ES細胞及顱內生殖細胞腫瘤中的胚胎癌和生殖細胞瘤中高水平表達，而在正常胎兒組織、成人正常睪丸組織、多種腫瘤和正常細胞系中均不表達，說明 HESRG基因表達具有特異性。HESRG基因編碼蛋白多抗的製備方法通過生物信息學方法(JW方法)篩選找到HESRG蛋白抗原表位，合成特異性多肽REH(TPAPVTDWEGC，然後將其C末段半胱氨酸偶聯匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)，免疫紐西蘭大白兔，每隻均經過四次免疫，採集兔免疫血清，將偶聯多肽到親和樹脂上進行親和純化，酶聯免疫吸附實驗 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定抗體效價，效價達到 1 512，000，由此製備了 HESRG特異性抗體。HESRG基因編碼蛋白單抗的製備方法通過生物信息學方法(JW方法)篩選找到 HESRG蛋白抗原表位，合成特異性多肽REH(TPAPVTDWEGC免疫小鼠後收集腹腔巨噬細胞及小鼠脾細胞，與骨髓瘤細胞融合製備雜交瘤細胞，然後篩選陽性克隆細胞培養，再將陽性克隆細胞注射到BALB/C小鼠腹腔，收集小鼠血清或腹水；最後將收集的血清或腹水採用免疫沉澱法或親和層析法分離獲得抗HESRG單克隆抗體。同時，還可以將所述的陽性克隆細胞培養，收集培養液上清，採用免疫沉澱法或者親和層析法分離獲得HESRG單克隆抗體。利用晶片篩選、電子克隆、RACE、PCR、Northern Blot等方法克隆獲得HESRG基因全長cDNA序列，並通過融合基因表達策略、Western blot和免疫細胞化學檢測等多種手段，確定HESRG蛋白編碼序列，通過生物信息學方法(JW方法)篩選找到HESRG蛋白抗原表位，合成特異性多肽REH(TPAPVTDWEGC，然後將其C末段半胱氨酸偶聯匙孔血藍蛋白，將其免疫紐西蘭兔及BALB/C小鼠製備了兔多抗及小鼠單抗。免疫組化和RT-PCR、Real-Time PCR分析表明=HESRG基因產物特異表達於人ES細胞及顱內生殖細胞腫瘤中，而在其他組織中不表達。可以作為診斷顱內生殖細胞腫瘤的有效手段。此外，HESRG基因編碼蛋白的多抗及單抗的製備將為人顱內生殖細胞腫瘤的基因診斷和基因靶向治療提供新的手段。基因診斷具有靈敏度高、特異性強、取材一般不受組織或時限限制等特點，利用HESRG基因在人顱內生殖細胞瘤、胚胎癌中高表達的特徵，製備診斷試劑盒，用於早期診斷顱內生殖細胞瘤、胚胎癌，實現生殖細胞瘤及胚胎癌的早診斷、早治療。與此同時，以HESRG基因作為靶點，設計和開發顱內生殖細胞瘤、胚胎癌特異性的化療(基因)藥物，是一種新型的顱內生殖細胞瘤、胚胎癌治療方法，有望實現顱內生殖細胞瘤、胚胎癌的無創性或根治性治療。


圖1為RT-PCR結果顯示HESRG基因在人ES細胞(Hl和H9兩個細胞系)、顱內生殖細胞瘤組織和胚胎癌組織中特異性表達。第一道為Hl細胞系、第二道為H9細胞系、第 3-13道為顱內生殖細胞瘤組織、第14-17道為顱內胚胎癌組織、第18道為無cDNA的陰性對照。圖2為Real-time PCR結果顯示HESRG在人中樞神經系統腫瘤中只在胚胎癌和生殖細胞瘤內呈相對高表達。圖3為免疫組化結果顯示HESRG在人中樞神經系統腫瘤中只在胚胎癌和生殖細胞瘤中表達。A、B、C顯示人ES細胞(Hl)中HESRG表達呈強陽性；D、E、F、J顯示HESRG在顱內生殖細胞瘤中表達；G、H、I顯示HESRG在顱內胚胎癌中表達。圖4為免疫組化結果顯示HESRG在中樞神經系統其它類型生殖細胞腫瘤中不表達。A、B 絨膜癌；C、D 卵黃囊瘤；E、F 不成熟的畸胎瘤；G、H 成熟的畸胎瘤
具體實施例方式下面結合實施例進一步說明本發明，而非限制本發明。實施例1HESRG基因的克隆1)分別抽提未分化人ES細胞H9細胞系及分化七天的擬胚體的mRNA，經反轉錄成cDNA，cDNA體外轉錄成帶有生物素標記的cRNA探針後利用Affymetrix human genome microarry U133A，B晶片檢測人ES細胞及其自發分化產生的EBs的基因表達譜，從晶片檢測結果中發現兩個EST序列(GenBank登錄號BF223023、BC02093Q在人ES細胞中表達水平較高，尤其是BF223023在未分化人ES細胞中表達水平與0ct4和Nanog這些已知基因相似，而當人ES細胞分化形成EBs時其表達顯著下調(19. 7倍)。2)將BF223023作為種子序列，在人EST資料庫中尋找與其匹配的序列。之後利用手工方法將所檢索到的EST重疊群拼接得一個約2330個鹼基的序列。檢索人類非冗餘基因資料庫未發現其它基因與該序列匹配，說明該基因可能是一個新基因，我們將其命名為人胚胎幹細胞相關基因(Human embryonic stem cell related gene，HESRG) (GenBank 登錄號為 DQ445779)。組成該基因的 ESiTs 分別是 BF223023、DN602362、CX164527、CX786672 及 CX756175，除 BF223023 外均被包含在人ES細胞cDNA資料庫中。3)利用5，-RACE PCR驗證序列完整性。HESRG基因序列 3』端包含一個polyA尾及AATAAA加尾信號，說明該序列包含完整的3』末端。但是從基因序列分析我們不能確定5』末端的完整性，因此我們通過Smart race PCR試劑盒擴增該基因完整的5』末端。首先抽提人ES細胞(H9)的總RNA，電泳檢測完整性，然後逆轉錄得到 cDNA鏈，再利用通用外引物(UPM5』-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3』)和基因特異性外引物(GSP5，-TAATGGGAGATGAGGGAGGGGGC-3，)進行第一輪擴增，將第一輪擴增產物稀釋100倍後利用通用內引物(NUPM 5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，)和基因特異性內引物1 (NGSP-15 ，-GTCTGCGGGGCTTCTGAGGCGAT-3，)進行巢式PCR。PCR產物電泳檢測得到一條特異性條帶， 長度約2. 21Λ，產物送測序。根據測序結果結合原序列分析，確定我們通過5』-RACE可以將原HESRG基因序列向5，末端延伸812個鹼基。最後我們再利用NGSP-2 (5，-TTCTCACGGAGC AAAGAGCAGGA-3』)和GSP作為引物進行PCR擴增，測序結果顯示該序列不能再向5』末端延伸。最終我們得到了 HESRG基因全長為3141bp。將該序列再次與人EST資料庫進行比對， 結果顯示我們延伸的長約812bp的序列與EST(CX788941)完全匹配，該EST也來源於人ES 細胞cDNA文庫。基因克隆步驟基本完成。4)利用Northern blot進一步確定HESRG基因有兩個轉錄本。實施例2RT-PCR 驗證 HESRG 的表達引物GAPDH 上遊CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC ；下遊CTCTTCCTCTTGTGCTCTTGCT；產物大小498bpGAPDH作為內參基因HESRG 上遊ATGAAAGGGAAGACATACAA ；下遊TGAACATAGCAAGGGAAA；產物大小314bpHESRG為目的基因細胞總RNA的提取利用Omega Bio-Tek公司的Ε. Z. N. A Total RNA Kit的操作步驟抽提細胞及相應腫瘤標本組織的總RNA。RNA中痕量DNA的去除去除體系配方如下DNase I處理總RNA反應體系
權利要求
1.人顱內生殖細胞腫瘤標誌物基因HESRG的應用方法，其特徵在於，用於製備診斷和治療人顱內生殖細胞腫瘤的產品。
2.根據權利要求1所述的應用方法，其特徵在於，用於製備診斷人顱內生殖細胞腫瘤的產品。
3.根據權利要求1或2所述的應用方法，其特徵在於，所述的產品包括用RT-PCR、 Real-time PCR、免疫檢測、原位雜交或基因晶片診斷人顱內生殖細胞腫瘤的產品。
4.根據權利要求3所述的應用方法，其特徵在於，所述的用RT-PCR診斷人顱內生殖細胞腫瘤的產品至少包括一對特異擴增引物。
5.根據權利要求3所述的應用方法，其特徵在於，所述的用Real-timePCR診斷人顱內生殖細胞腫瘤的產品至少包括一對特異擴增引物。
6.根據權利要求1或2所述的應用方法，其特徵在於，所述的用免疫檢測診斷人顱內生殖細胞腫瘤的產品包括與HESRG基因編碼蛋白結合的抗體。
全文摘要
本發明公開了一種人顱內生殖細胞腫瘤標誌物HESRG基因的應用方法。其能製備診斷和治療人顱內生殖細胞腫瘤的製劑；尤其是用於製備診斷人顱內生殖細胞腫瘤的製劑。將為人顱內生殖細胞腫瘤的基因診斷和基因靶向治療提供新的手段。
文檔編號A61K39/395GK102277431SQ20111022271
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月4日 優先權日2011年8月4日
發明者任彩萍, 馮湘玲, 劉衛東, 王苟思義, 蔣星軍, 黃偉 申請人:中南大學