一種適合於印度梨形孢真菌生長的改良溶磷培養基的製作方法

2024-03-27 23:32:05

本發明屬於改良培養基領域，具體涉及一種適合於印度梨形孢真菌生長的改良溶磷培養基。

背景技術：

印度梨形孢作為一種新近發現的植物內生真菌，能夠在水稻、小麥、大麥、擬南芥等100多種植物根系共生，已經明確的生物功能包括促進植物生長，提高植物抗逆性(抗旱、抗鹽、抗病)，能促進植物對養分的吸收利用。

目前，國內外對微生物溶解難溶磷酸鹽的研究採用的主要是pvk(pikovskaya)和nbrip(nationalbotanicalresearchinstitute'sphosphategrowthmedium)兩種通用培養基；但由於微生物的千差萬別，上述兩種培養基只是能夠證明某一微生物可以溶解某些難溶磷酸鹽，且nbrip也主要是用於溶磷微生物的快速篩選，通用的pvk培養基很難將微生物溶磷功效發揮到最大。目前關於印度梨形孢真菌溶解難溶磷的報導極少，也無關於印度梨形孢溶磷培養基的優化的先例，這成為印度梨形孢溶磷研究和應用一大障礙。因pvk、nbrip不能全面評價印度梨形孢對磷酸鹽的溶磷效果，因此，我們開發一種溶磷培養基來全面、綜合評價印度梨形孢溶磷效果，為印度梨形孢製備微生物菌肥奠定基礎。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明要解決的技術問題是改良一種微生物溶磷研究通用的pvk培養基，使之能夠更全面評價印度梨形孢的溶磷功效，為其後續溶解難溶磷酸鹽特性研究及微生物菌肥製作奠定基礎。

為了實現本發明的目的，發明人通過大量試驗研究和不懈探索，最終獲得了如下技術方案：

本發明對印度梨形孢在pvk培養中的所需碳源、所需氮源及培養ph值三個對其生長影響較大的因素進行優化，從而得到適宜印度梨形孢生長的pvk培養基，從而增強其溶磷效果。

一種適合於印度梨形孢生長的改良溶磷培養基，組分包括：可溶性澱粉15.0g、ca(no3)20.5g、nacl0.2g、mgso4·7h2o0.1g、kcl0.1g、酵母提取物0.5g、mnso4·h2o0.002g、feso4·7h2o0.002g、瓊脂粉18.0g(液體培養基不加瓊脂粉)，蒸餾水溶解定容至1l，並用1nnaoh調節ph至8.0。

優選地，如上所述的一種適合於印度梨形孢真菌生長的改良溶磷培養基，其難溶磷酸鹽和培養基其餘組分需分開單獨滅菌，然後再將難溶磷酸鹽加入到已滅菌的培養基剩餘組分中。

本發明優點

與現有技術相比，本發明的優點為：相比原始pvk培養基該培養基更適宜印度梨形孢生長，更能反應印度梨形孢溶解難溶性磷酸鹽的效果。

說明書附圖

圖1為pvk培養基改良前後溶解磷酸鐵對比圖。

具體實施方式

以下是本發明的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步作描述，但是本發明的保護範圍並不限於這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護範圍之內。

實施例1碳源、氮源篩選

供篩選的碳源為：葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性澱粉。

供篩選的氮源為：(nh4)2so4、kno3、nh4no3、牛肉膏、ca(no3)2。

按以下配方配置培養基(g/l)：碳源10.0g、氮源0.5g、酵母提取物0.5g、kc10.2g、mgso4·7h2o0.1g、feso4·7h2o0.002g、mnso4·4h2o0.002g、瓊脂粉18.0g，ph7.2，121℃，20min滅菌。將印度梨形孢菌餅接種於不同碳源、氮源的培養基中央，於生化培養箱28℃，黑暗倒置培養，培養7天後測定菌落直徑，以菌落直徑大小選擇較優的碳源和氮源。

供選碳源中可溶性澱粉的菌落生長最好，平均直徑達27.3mm，供選的硝酸鈣的菌落生長最好，平均直徑為53.0mm。所以篩選出可溶性澱粉為適宜碳源，硝酸鈣為適宜氮源。

實施例2適宜碳、氮量及ph值的確定

利用l9(34)正交組合(見表1)進行適宜碳、氮量及ph值的確定試驗。

表1正交試驗因素水平表

表2l9(34)正交試驗結果表

通過印度梨形孢在培養基上的生長情況(菌落直徑)，進行篩選適宜的碳、氮量及ph值，其結果見表2、表3，可以確定本試驗對印度梨形孢選出的理論較優培養基配方組合為a2b2c3，即可溶性澱粉10.0g、硝酸鈣0.5g、ph8.0。

表3正交結果方差分析

實施例3pvk培養基改良前後溶解磷酸鐵對比

為檢驗改良培養基的溶磷效果，選擇了原始培養基基本不能溶解的磷酸鐵作為供試難溶磷源，具體方法為：1、培養基配置：①改良溶磷培養基配置按如下比例：可溶性澱粉15.0g、ca(no3)20.5g、nacl0.2g、mgso4·7h2o0.1g、kcl0.1g、yeastextract0.5g、mnso4·h2o0.002g、feso4·7h2o0.002g加入蒸餾水溶解並定容至1l，用1nnaoh調節ph至8.0，分裝至250ml三角瓶，每瓶50ml，121℃高溫高壓滅菌20min；②常規pvk培養基配置按如下比例：葡萄糖10.0g、(nh4)2so40.5g、nacl0.2g、mgso4·7h2o0.1g、kcl0.1g、yeastextract0.5g、mnso4·h2o0.002g、feso4·7h2o0.002g加入蒸餾水溶解並定容至1l，用1nnaoh調節ph至7.0，分裝至250ml三角瓶，每瓶50ml，121℃高溫高壓滅菌20min。

2、接種培養：培養基冷卻至室溫後分別加入0.25g/l(1l培養基中加入0.25g)已滅菌的磷酸三鈣、磷酸鋁、磷酸鐵及50μl106cfu/ml濃度的印度梨形孢孢子液，於150rpm，28℃條件下培養一周取樣(1ml)測定水溶性磷含量。

在接種印度梨形孢培養一周後分別取樣測定了改良培養基和培養基中的水溶性含量，其中加入磷酸三鈣、磷酸鋁和磷酸鐵的改良培養基中水溶性磷含量分別為194.66mg/l、157.29mg/l、54.17mg/l，較原始培養基水溶性磷含量分別提高了0.2倍、0.4倍和3倍，效果明顯，具體結果見圖1。