一種鮸魚cxcr1基因微衛星標記pcr擴增引物及檢測方法
2023-12-05 01:59:36
專利名稱：一種鮸魚cxcr1基因微衛星標記pcr擴增引物及檢測方法
技術領域：
本發明涉及魚類免疫器官中表達的基因序列，更具體涉及一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記PCR擴增引物以及利用該PCR擴增引物進行鯢魚CXCRl基因微衛星標記的檢測方法。
背景技術：
趨化因子是一類結構功能相似、具有趨化吸引和活化作用的鹼基肝素結合性的小分子蛋白質，與相應的趨化因子受體結合，誘導中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、成纖維細胞等趨化遊走，介導細胞在炎症部位的聚集活化及參與組織損傷修復。依據其分子N端半胱氨酸殘基(Cys)的數量和排列順序可分為CXC、CC、C、CX3C四個亞家族。CXCR是一種介導CXC趨化因子發揮生物功能的關鍵受體，CXCRl屬於CXCR家族中的重要成員，可與多種趨化因子結合形成非一一對應的複雜網絡系統，兩者結合後，通過 G-蛋白變構激活下遊的效應分子進行信號轉導，可趨化表達CXCRl的中性粒細胞、T、B等淋巴細胞的遊走、脫顆粒等一系列生物學效應，在機體的抗感染、抗病毒等多種炎症性疾病中發揮重要作用。近年來研究證實，趨化因子及其受體可增強病毒感染細胞的細胞毒活性從而抑制病毒的複製，一些趨化因子還可促進被募集活化的白細胞在病毒感染處聚集發揮清除病毒的作用。微衛星DNA (Microsatellites DNA)，又稱短串聯重複序列(Short Tandem Repeats, STRs)或簡單重複序列(Simple Sequence R印eats，SSRs)，一般是指以 1_6個核苷酸為單位的重複序列，是近十幾年才發展起來的新型分子標記技術。微衛星分子標記具有共顯性遺傳、重複性好、特異性強、分布廣且均勻及可快速檢測等優點，被廣泛應用於群體遺傳多樣性遺傳分析、種質資源保護與管理、遺傳連鎖圖譜構建及QTL定位等領域中。抗病基因上的SSR在不同個體中表現出來的多態性可能與不同個體的抗病能力相關聯，因此可以通過檢測SSR多態性來分析與抗病能力的關聯性，進而應用於分子輔助育種中。鯢魚(Miichthysmiiuy)屬脊索動物門(Phylum Chordata)、硬骨魚綱 (Osteichyes)、鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、鯢魚屬(Miichthys),俗攝、 米魚、黑鯢，主要分布於西太平洋西部，包括中國的渤海、黃海及東海，朝鮮和日本南部，為近海暖溫水性中下層魚類。鯢魚肉鮮嫩似黃魚，無腥味，肉質可和野生大黃魚相媲美，是海產經濟魚類之一，也是經濟價值較高的魚類，又具有個體大、生長快、食性廣等諸多優點，是近海網箱養魚優良品種。遺傳改良或品種培育是鯢魚養殖發展的動力，研究表明，遺傳變異水平與生物的生長速度、抗病能力與生產性狀密切相關，因此，本發明欲建立一種篩選方式，將鯢魚抗病基因內部的SSR標記用於快速檢測多個樣本，通過關聯分析判斷其抗病能力，應用與抗病關聯分析，進一步應用於分子輔助育種。
發明內容
本發明旨在提供一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記PCR擴增引物以及利用該PCR擴增引物進行鯢魚CXCRl基因微衛星標記的檢測方法，將鯢魚抗病基因內部的SSR標記用於快速檢測多個樣本，通過分析判斷其抗病能力，應用與抗病相關分析，確定抗病基因型，進一步應用於分子輔助育種。為實現本發明的發明目的，發明人提供如下技術方案
本發明首先提供了一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記PCR擴增引物，由上遊引物和下遊引物組成，其中，所述的上遊引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示；下遊引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示。Mimi-42-E04F (上遊引物)CATTCARCACGGCTCCCTT (SEQ ID NO. 1), Mimi-42-E04R (下遊引物)TTCCCACTCTTATCTATCCA (SEQ ID NO. 2)。本發明還提供了一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記的檢測方法，包括下述步驟
(1)利用如上所述的一對PCR擴增引物對鯢魚不同地理群體或相同群體不同個體的基因組DNA進行PCR擴增；
(2)對PCR擴增產物進行多態檢測，其中，SEQID NO. 3所示為鯢魚CXCRl基因微衛星標記PCR引物擴增的核苷酸序列。PCR引物擴增的核苷酸序列(SEQ ID N0. 3)如下作為優選方案，根據本發明所述的一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記的檢測方法， 其中，所述的步驟(1)中其擴增體系為總體積20μ1，其中含有內含1. 5mM Mg2+的IXPCR buffer, 0. 2 μ M dNTP, IU Taq 聚合酶，DNA 模板量為 50_100ng ；PCR 反應程序為95° C 變性5分鐘之後進入循環，95° C變性30秒，最佳退火溫度30秒，72° C延伸30秒，進行30 個循環，最終72° C延伸5分鐘，最佳退火溫度是根據設置45° C -60° C的梯度PCR確定的。作為優選方案，根據本發明所述的一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記的檢測方法， 其中，所述的步驟(2 )中採用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測。作為優選方案，根據本發明所述的一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記的檢測方法， 其中，所述的步驟(2)中採用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，具體包括PCR產物加入等體積變性劑(含98%去離子甲醯胺，IOmM EDTA, 0. 25%溴酚藍和0. 25% 二甲苯青)，95°C變性8 分鐘，然後用6%的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，恆壓1000-1500V，功率200W，電泳1_2個小時，硝酸銀染色系統進行檢測，分析確定多態性。具體地，本發明的檢測方法包括如下步驟
(1)利用發明人實驗室從鯢魚CDNA文庫中測序獲得的序列中查找CXCRl基因的序列， 利用微衛星搜索軟體SSRHimter進行微衛星位點的查找，從而確定該基因含有微衛星位佔.
(2)在CXCRl基因的微衛星位點兩端的側翼序列設計特異引物，通過引物設計軟體 Primer Premier5. 0進行引物設計，其設計參數是①引物長度為18_25bp ；②GC含量大於40%;③退火溫度大於40° C，且正反引物退火溫度相差不超過5° C;④儘量避免二級結構；⑤預期的PCR產物長度為100-300bp。(3)鯢魚基因組DNA的提取，具體步驟如下①剪取少量鯢魚鰭條組織30_100mg， 加入 300μ 1 裂解液(含 0. 2M NaCl,0. 02Μ Tris-HCl (ρΗ8. 0)，1%SDS 和 0. 05Μ EDTA)，剪刀剪碎後加入終濃度20mg/ml的蛋白酶K，55° C水浴裂解數小時至溶液清澈；②完全裂解後加300 μ 1苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)(體積比)反覆顛倒抽提10-15分鐘，10000-12000 轉/分鐘離心10分鐘，吸取上清；③重複步驟②3-4次至上清澄清；④加兩倍體積冰乙醇沉澱DNA，10000-12000轉/分鐘離心10分鐘，棄上清；⑤75%乙醇洗滌沉澱1_2次，晾乾， 使乙醇完全揮發，用50-100 μ ITE或滅菌的去離子水溶解DNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測後於-20° C保存備用。(4)對於鯢魚CXCRl基因微衛星標記進行PCR擴增，其擴增體系為總體積 20 μ 1，其中含有 IXPCR buffer (內含 1. 5mMMg2+)，0. 2 μ M dNTP, IU Taq 聚合酶，模板量為 50-100ng。PCR反應程序為95° C變性5分鐘之後進入循環，95° C變性30秒，最佳退火溫度30秒，72° C延伸30秒，進行30個循環，最終72° C延伸5分鐘，最佳退火溫度是根據設置45° C -60° C的梯度PCR確定的。(5)對PCR產物進行檢測首先用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的特異性， 之後用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測其基因型，變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測其基因型即在PCR產物中加入等體積變性劑(含98%去離子甲醯胺，IOmM EDTA, 0. 25%溴酚藍和0. 25% 二甲苯青)，95° C變性8分鐘，再用6%的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，恆壓1000-1500V， 功率200W，電泳1-2個小時，硝酸銀染色系統進行檢測，分析確定多態性。本發明具有如下優點
本發明建立了一種篩選方式，將鯢魚抗病基因內部的SSR標記用於快速檢測多個樣本，本發明的CXCRl來源的微衛星標記可應用於抗病關聯分析，通過關聯分析判斷其抗病能力，應用與抗病關聯分析，進一步應用於分子輔助育種。
圖1是本發明CXCRl基因微衛星標記的變性聚丙烯醯胺凝膠檢測圖譜。
具體實施例方式下面結合實施例和說明書附圖，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的實施並不局限於下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護範圍。在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。若無特別指明，實施例採用的方法為本領域通用技術。主要材料、試劑和儀器設備眼科剪，鑷子，1.5ml離心管，微量移液器、微量移液器槍頭。脫氧核糖核苷酸dNTP，熱聚合Taq酶，小型離心機(Qspin ，BAYGENE)，渦旋振蕩器(QL-866 型，QILINEBEIER)，pH 計(Mettler Toledo 320PH Meter)、高壓蒸氣滅菌鍋 (SANYO)、微量離心機(Heraeus Pico 17，Thermo Scientific)、電泳儀(DYY-6C 型，北京六一)、電泳儀(DYY-12C型，北京六一)、DNA序列分析電泳儀(DYCZ-20C型，北京六一)、調速多用振蕩器(HY-2型，上海國華)、凝膠成像系統(Bio-Rad⑶2000)、PCR儀(ABI Veriti96well Thermal Cycler)。實驗樣本鯢魚採集於浙江省海洋水產研究所。本發明實施例所用的常規藥品氯仿(分析純)，異丙醇(分析純)，甲醛，氫氧化鈉 (分析純)，硝酸銀，氯化鈉(分析純)購自國藥集團，去離子甲醯胺，溴酚藍，二甲基苯靑，乙二胺四乙酸，尿素，丙烯醯胺，甲叉，Tris-鹼，硼酸，瓊脂糖，溴化乙錠，脫氧核糖核苷酸dNTP， 熱聚合Taq酶，質粒文庫測序由華大基因公司完成，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
本發明實施例所用主要儀器包括小型離心機(Qspin ，BAYGENE),渦旋振蕩器 (QL-866 型，QILINEBEIER), pH 計(Mettler Toledo 320PH Meter)、高壓蒸氣滅菌鍋 (SANYO)、微量離心機(Heraeus Pico 17，Thermo Scientific)、電泳儀(DYY-6C 型，北京六一)、電泳儀(DYY-12C型，北京六一)、DNA序列分析電泳儀(DYCZ-20C型，北京六一)、調速多用振蕩器(HY-2型，上海國華)、凝膠成像系統(Bio-Rad⑶2000)、PCR儀(ABI Veriti 96well Thermal Cycler)。實施例中未註明具體條件的實驗方法，是按照常規條件，例如Sambrook等作者的分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商說明書建議的條件。實施例1
1、鯢魚CXCRl基因序列的來源及微衛星位點的篩選
利用本實驗室從鯢魚cDNA文庫中測序獲得的序列中查找CXCRl基因的序列，利用微衛星搜索軟體SSRHimter進行微衛星位點的查找，查找參數為2_6個鹼基重複單元重複次數大於5。2、CXCRl基因微衛星標記特異引物的設計
在CXCRl基因的微衛星位點兩端的側翼序列設計特異引物，通過引物設計軟體Primer Premier5.0進行引物設計，其設計參數是⑴引物長度為18_25bp ； (2) GC含量大於40% ； ⑶退火溫度大於40° C，且正反引物退火溫度相差不超過5° C ；⑷儘量避免二級結構；(5) 預期的PCR產物長度為100-300bp。發明人經過實驗，本實施例採用的擴增引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID N0. 2 所示。3、鯢魚基因組DNA的提取
具體步驟如下⑴剪取少量鯢魚鰭條組織30-100mg，加入300 μ 1裂解液(含0. 2Μ NaCl,0. 02Μ Tris-HCl (ρΗ8. 0)，1%SDS 和 0. 05M EDTA)，剪刀剪碎後加入終濃度 20mg/ml 的蛋白酶K，55° C水浴裂解數小時至溶液清澈；⑵完全裂解後加300 μ 1苯酚氯仿異戊醇 (25:24:1)反覆顛倒抽提10-15分鐘，10000-12000轉/分鐘離心10分鐘，吸取上清；⑶重複步驟⑵3-4次至上清澄清；⑷加兩倍體積冰乙醇沉澱DNA，10000-12000轉/分鐘離心10 分鐘，棄上清；(5) 75%乙醇洗滌沉澱1-2次，晾乾，使乙醇完全揮發，用50-100 μ 1 TE或滅菌的去離子水溶解DNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測後於-20° C保存備用。4、PCR 擴增
進行最佳退火溫度優化的模板是隨機的兩個鯢魚個體的DNA混合池，引物的最佳退火溫度在45-60° C之間進行優化，選擇單一或雜帶少、特異性產物較高的溫度作為最佳退火溫度，最終鯢魚CXCRl基因微衛星標記特異引物的最佳退火溫度確定為48° C。PCR反應體系為總體積 20 μ 1，其中含有 IXPCR buffer (內含 1. 5mMMg2+)，0. 2μΜ dNTP, IU Taq 聚合酶，模板量為50-100ng。反應程序為95° C變性5分鐘之後進入循環，95° C變性30秒， 48° C退火30秒，72° C延伸30秒，進行30個循環，最終延伸5分鐘。擴增產物用1. 5% 的瓊脂糖凝膠電泳-EB染色系統進行檢測特異性。5、PCR產物的檢測
PCR產物加入等體積變性劑(含98%去離子甲醯胺，IOmM EDTA, 0. 25%溴酚藍和0. 25% 二甲苯青)，95° C變性8分鐘後快速冷卻，用6%的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，恆壓 1000-1500V，功率200W，電泳1_2個小時後進行染色和顯色，首先用70%的乙醇固定10分鐘，水洗10分鐘，硝酸銀溶液染色30分鐘，水洗10秒，20%的NaOH顯色液顯色10分鐘，水洗10分鐘，乾燥後進行基因型統計便獲得了鯢魚遺傳變異的多態性圖譜(如圖1所示)。PCR 擴增產物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。儘管發明人已經對本發明的技術方案做了較為詳細的闡述和列舉，應當理解，對於本領域一個熟練的技術人員來說，對上述實施例作出修改和/或變通或者採用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發明精神的實質，本發明中出現的術語用於對本發明技術方案的闡述和理解，並不能構成對本發明的限制。
權利要求
1.一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記PCR擴增引物，由上遊引物和下遊引物組成，其中， 所述的上遊引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示；下遊引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2 所示。
2.一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記的檢測方法，其特徵在於，所述的檢測方法包括下述步驟(1)利用如權利要求1所述的一對PCR擴增引物對鯢魚不同地理群體或相同群體不同個體的基因組DNA進行PCR擴增；(2)對PCR擴增產物進行檢測，其中，SEQID NO. 3所示為鯢魚CXCRl基因微衛星標記 PCR引物擴增的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記的檢測方法，其特徵在於， 所述的步驟(1)中其擴增體系為總體積20μ1，其中含有內含1.5mM Mg2+的IXPCR buffer, 0. 2 μ M dNTP, IU Taq 聚合酶，DNA 模板量為 50_100ng ；PCR 反應程序為95° C 變性5分鐘之後進入循環，95° C變性30秒，最佳退火溫度30秒，72° C延伸30秒，進行30 個循環，最終72° C延伸5分鐘，最佳退火溫度是根據設置45° C -60° C的梯度PCR確定的。
4.如權利要求2所述的一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記的檢測方法，其特徵在於，所述的步驟(2)中採用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測。
5.如權利要求2或4所述的一種鯢魚CXCRl基因微衛星標記的檢測方法，其特徵在於，所述的步驟(2)中採用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，具體包括PCR產物加入等體積變性劑，95°C變性8分鐘，然後用6%的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，恆壓1000-1500V，功率200W，電泳1-2個小時，硝酸銀染色系統進行檢測，分析確定多態性。
全文摘要
本發明涉及魚類免疫器官中表達的基因序列領域，具體是一種鮸魚CXCR1基因微衛星標記PCR擴增引物及檢測方法。一種鮸魚CXCR1基因微衛星標記PCR擴增引物為一對，其核苷酸序列為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。本發明建立了一種篩選方式，將鮸魚抗病基因內部的SSR標記用於快速檢測多個樣本，本發明的CXCR1來源的微衛星標記可應用於抗病關聯分析，通過關聯分析判斷其抗病能力，應用與抗病關聯分析，進一步應用於分子輔助育種。
文檔編號C12N15/11GK102304510SQ20111019085
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月8日 優先權日2011年7月8日
發明者孫典巧, 孫悅娜, 徐田軍, 王日昕 申請人:浙江海洋學院