一種抗狂犬病病毒特異性人源抗體及應用的製作方法
2023-05-20 17:21:21
一種抗狂犬病病毒特異性人源抗體及應用的製作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種抗狂犬病毒的中和性抗體，尤其是人源化或全人源單克隆抗體，以滿足臨床上診斷和/或治療狂犬病的需要。本發明採用噬菌體抗體庫技術，以接種過狂犬病疫苗的32份高效價的健康人外周血為原材料，製備噬菌體抗體庫。該抗體庫通過三輪篩選，獲得7株ELISA陽性抗體。進一步通過RFFIT方法測定其中和活性，其中的R5、R7、R8、R9共四株具有較強的中和活性。本發明的具有高親和力的人源化的抗狂犬病病毒抗體，可用於替代ERIG和HRIG，對於狂犬病毒嚴重暴露者進行主動和/或被動免疫治療。
【專利說明】一種抗狂犬病病毒特異性人源抗體及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及病毒性疾病的預防和治療，尤其涉及狂犬病的預防和治療。
【背景技術】
[0002] 狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV)引起的世界性人獸共患傳染病，人和 動物一旦發病死亡率高達100%。世界衛生組織（WHO)最新數據指出，全球每年約有55000 人死於狂犬病，主要集中在亞非拉發展中國家。WHO建議，對於嚴重暴露者應同時進行主動 和被動免疫治療，以獲得快速的保護作用。目前，用於被動免疫治療的製劑主要有馬抗狂犬 病病毒免疫球蛋白（equine rabies immune globulin, ERIG)和人抗狂犬病病毒免疫球蛋 白（human rabies inlmune globulin，HRIG)。然而，ERIG 和 HRIG 的供應量有限、價格偏 高，在狂犬病呈地方性流行的不發達地區應用難以普及，並且ERIG和HRIG也均存在可導致 過敏反應及傳播血液性疾病等缺點。
[0003] 應用單克隆抗體技術開發抗狂犬病病毒特異性的McAb防治狂犬病可以克服多 抗血清的諸多缺點，臨床應用前景廣闊。國外Dietzschold B等利用經HDRV免疫的志願 者外周血B淋巴細胞和鼠骨髓瘤SHM-D33細胞融合形成的雜交瘤細胞J57 (Dietzschold B，J Virol 1990 ;64(6) :3087.);相同方法製備雜交瘤 JA、JB(Champion JM, Dietzschold B，J Immunol Methods. 2000 ;235 (1-2) :81-90)。從雜交瘤 J57、JA 和 JB 中克隆擴增抗體 的重鏈、輕鏈序列，插入到重組棒狀病毒載體（RhV)，經表達得到的抗體稱為S057、S0JA、 S0JB(Morimoto K, Dietzschold B, J Immunol Methods. 2001 ;252 (1-2):199-206.)。S057、 S0JA和S0JB被組合成第一種雞尾酒療法組合物，用於和HRIG比較，評價對狂犬病毒PEP的 效果（Prosniak M, Dietzschold B, J Infect Dis. 2003 ; 188:53 - 56.)。Jones D 等進一步 將S057、S0JA和S0JB的重鏈可變區、輕鏈可變區克隆，插入到人IgGl表達載體，在人PER. C6細胞中表達，得到的抗體稱為CR57、CRJA、CRJB(Jones D，et al.Biotechnol Prog，2003; 19 (1) : 163-8.)。在對CR57、CRJA、CRJB三抗體組合中的評價中，研究者發現CRJA保護潛 力弱，CR57、CRJB競爭性結合RV糖蛋白，並且發現存在對CR57和CRJB中和逃逸的病毒 株。此後Bakker AB等研究者構建了兩個RV-免疫噬菌體文庫，從中篩選出一株具有高親 和力的，並且抗原表位與CR57不重疊的RV糖蛋白特異性抗體CR4098 (Bakker AB，et al. J Virol, 2005 ;79(14) :9062 - 8.)。CR57和CR4098的組合稱為CL184,是進行臨床評價的第 二種雞尾酒療法，目前由荷蘭Crucell公司開發，在印度完成I期臨床研究（Bakker AB，et al. Vaccine, 2008, 26(47):5922 - 5927.)。
[0004] 儘管已有部分抗狂犬病病毒特異性的McAb進入臨床研究階段的報導，但至今仍 沒有藥物被批准上市。因此，本領域迫切需要開發具有高親和力的完全人源化的抗狂犬病 病毒抗體，用於替代ERIG和HRIG,已滿足對於嚴重暴露者進行主動和被動免疫治療的需 要。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種抗狂犬病病毒的中和性抗體，尤其是人源化或全人源單 克隆抗體，以滿足臨床上診斷和/或治療狂犬病的需要。
[0006] 本發明的第一方面，提供了一種人源抗狂犬病病毒中和性抗體，該中和性抗體的 重鏈可變區包含如下的互補決定區：
[0007] CDR1 ：GGSMRRSNYY,
[0008] CDR2 :IYYSGTT，
[0009] CDR3 ：ASESTVTAKLDN ；
[0010] 該中和性抗體的輕鏈可變區，包含下表中1-4組中的互補決定區中的一組：
[0011]
【權利要求】
1. 一種人源抗狂犬病病毒中和性抗體，其特徵在於： 其重鏈⑶R1、⑶R2、⑶R3的胺基酸序列為： CDR1 :GGSMRRSNYY， CDR2 :IYYSGTT, CDR3 :ASESTVTAKLDN ; 其輕鏈⑶R1、⑶R2、⑶R3的胺基酸序列選自下表1-4組中的一組：
2. 如權利要求1的抗體，其特徵在於： 所述的重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3所示的 序列； 所述的輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7所示的序列。
3. 如權利要求1的抗體，其特徵在於，其重鏈可變區的胺基酸序列和輕鏈可變區的氨 基酸序列分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 4所示。
4. 如權利要求1的抗體，其特徵在於，其重鏈可變區的胺基酸序列和輕鏈可變區的氨 基酸序列分別如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 5所示。
5. 如權利要求1的抗體，其特徵在於，其重鏈可變區的胺基酸序列和輕鏈可變區的氨 基酸序列分別如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 6所示。
6. 如權利要求1的抗體，其特徵在於，其重鏈可變區的胺基酸序列和輕鏈可變區的氨 基酸序列分別如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 7所示。
7. 如權利要求1-6中任一項的抗體，其特徵在於，其為單鏈抗體ScFv、Fab或全分子免 疫球蛋白。
8. 編碼權利要求1-6中任一項的抗體的基因序列。
9. 如權利要求8的基因序列，其特徵在於，編碼重鏈可變區的核苷酸序列和輕鏈可變 區的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 11所示。
10. 如權利要求8的基因序列，其特徵在於，編碼重鏈可變區的核苷酸序列和輕鏈可變 區的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 12所示。
11. 如權利要求8的基因序列，其特徵在於，編碼重鏈可變區的核苷酸序列和輕鏈可變 區的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 13所示。
12. 如權利要求8的基因序列，其特徵在於，編碼重鏈可變區的核苷酸序列和輕鏈可變 區的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 14所示。
13. 如權利要求1-6中任一項的抗體在製備預防或治療狂犬病的藥物中的應用。
14.如權利要求1-6中任一項的抗體的狂犬病毒檢測試劑中的應用。
【文檔編號】A61K39/42GK104193823SQ201410417957
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月22日 優先權日:2014年8月22日
【發明者】毛曉燕, 陳繼軍, 安晨, 喬玉玲, 馬瑞 申請人:蘭州生物製品研究所有限責任公司