新的胱天蛋白酶-14激活肽及包含所述激活肽的組合物的製作方法

2023-04-24 14:04:41

專利名稱：新的胱天蛋白酶-14激活肽及包含所述激活肽的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及化妝品和藥物領域。本發明涉及作為胱天蛋白酶-14激活劑的以下通式⑴的妝化合物=R1 - (AA)n -X1-X2-Ile- Gln - Ala - Cys - Arg - Gly - X3 ~ (AA)p - R2,並且涉及它們在用於預防和/或校正DNA損傷、預防和/或治療皮膚老化的跡象和光老化以及改善皮膚屏障功能的化妝品和/或藥物中的用途。
背景技術：
人體中最大的器官皮膚的主要功能是保護人體免受包括外部侵害在內的許多形式的侵害。這些侵害的實例包括這樣的侵害，例如汙染，UV輻射，或者刺激性化學物質如表面活性劑、防腐劑或香料，機械侵害如擦傷、修面或脫毛。汙染表示「外部」汙染和「內部」汙染，「外部」汙染例如由於柴油顆粒、臭氧或重金屬，「內部」汙染可以特別由於油漆、膠水或壁紙釋放的溶劑(例如甲苯、苯乙烯、二甲苯或苯甲醛)，或者還由於香菸煙霧。空氣乾燥也·是皮膚侵害的主要原因。這類外部侵害引起皮膚屏障功能的改變，這導致皮膚不適，令人不快的感覺現象如緊繃或瘙癢，或者甚至過度脆弱和發紅。此外，這些外部侵害促進皮膚所謂的「外源性」老化的加速。實際上，外源性老化是由身體在其整個生命中經歷的環境因素所引起的，所述因素統稱為外部侵害。除了其作為物理屏障的作用，皮膚還作為水不可滲漏的屏障發揮作用以防止脫水。由皮膚形成的這個屏障由幾層組成，包含確保皮膚持續更新的不同類型的細胞。首先，這個更新過程包括其中皮膚的表層細胞脫落的現象，這個現象必須通過基底層中的角質形成細胞確保的表皮更新來補償，所述角質形成細胞活躍地分裂並分化為角質層的細胞或角質細胞(corneocyte)。這些更新以及損傷(例如UV-福射誘導的損傷)情況中的皮膚修復作用是由一套信號傳導途徑高度控制的。這些信號傳導途徑之一包括蛋白酶胱天蛋白酶-14。胱天蛋白酶-14是胱天蛋白酶家族的獨特的成員。實際上，不像廣泛表達的胱天蛋白酶家族的其他成員，胱天蛋白酶-14僅在表皮中表達和活躍，並且在大多數其他成年組織中不存在(Eckhart et al. , J. Invest. Dermatol. , 2003, 44:1148-1151) 胱天蛋白酶-14在形成由表皮組成的屏障中的重要作用最近已證實(Denecker et al. , Nat. Cell.Biol. 2007，9:666-674)。實際上，其僅在那些發生分化和「角化」的表皮層內以及毛囊中表達並發揮其蛋白水解作用(Lippens et al. , Cell Death Differ.，2000，10:257-259)。然而，據證實胱天蛋白酶-14起重要作用，特別是在水合過程的維持、角質細胞形成和凋亡保護中，特別是在外部侵害的情況中，例如那些由於UV輻射的外部侵害(Denecker etal., J. Cell Biology, 2008，451-458)。此外，據證實胱天蛋白酶-14負責將聚絲蛋白原(profiIaggrin)切割為聚絲蛋白，然後所述聚絲蛋白水解為肽和胺基酸，其形成天然保溼因子(Hoste et al. , J. Invest. Dermatol. Abstract, 2007, S71)。所有這些結論使得開發包含胱天蛋白酶-14作為活性成分的藥物組合物，其可以用作防曬劑(W0 2008025830)。然而，目前沒有可用的化妝品化合物允許使用胱天蛋白酶-14，從而將聚絲蛋白原轉化為待活化的聚絲蛋白以保護皮膚免受UV輻射以及改善屏障功能，雖然的確存在對這種類型的新護理的需求。

發明內容
現在，申請人證實以下通式⑴的肽化合物是優異的胱天蛋白酶-14激活劑，並且對改善皮膚屏障功能以及保護皮膚免受諸如UV輻射的外部侵害(特別是DNA保護功能)具有顯著作用R1 - (AA)n-X1 _ X2 _ IIe _ Gln _ Ala _ Cys _ Arg _ Gly _ X3 _ (AA) p_R2。本發明的肽化合物的特徵在於它們-激活胱天蛋白酶-14，並因此激活其關於聚絲蛋白原的蛋白水解作用；-幫助保持表皮的水合； -防止和修復經受UVB輻射的皮膚細胞的DNA損傷；以及-優化表皮的屏障功能。因此，本發明的第一個目的是提供以下通式⑴的肽化合物R1-(AA)n X1-X2-Ile-Gln-Ala-Cys-Arg-Gly-X3-(AA)P-R20本發明的第二個目的是提供一種化妝品組合物，其包含所述式(I)的肽化合物作為主要活性成分。此外，本發明的第三個目的涉及包含所述式(I)的肽化合物的化妝品組合物用於(i)保護和/或修復DNA損傷、激活胱天蛋白酶-14以及聚絲蛋白形成，(ii)預防和/或治療皮膚老化的跡象和光老化，以及(iii)改善皮膚屏障功能以及表皮水合的用途。最後，本發明的第四個目的是提供一種使用包含所述式(I)的肽化合物的組合物對待治療的皮膚或角質附屬物進行化妝品治療的方法。本發明的第一個目的涉及通式⑴的肽化合物R1 - (AA)n-X1 -X2-Ile- Gln - Ala - Cys - Arg - Gly -X3- (AA)p - R2(I)其中X1為天冬氨酸、穀氨酸或者無胺基酸；X2為天冬醯胺、脯氨酸、絲氨酸或者無胺基酸；X3為天冬醯胺、精氨酸、亮氨酸或者無胺基酸；AA為任何胺基酸,並且η和P為0_2的整數；R1是游離的N-末端胺基酸的伯胺官能團，R2是C-末端胺基酸的羧基官能團的羥基，其被可以選自C1-C3tl烷基鏈的基團取代，或者是ΝΗ2、ΝΗΥ或NYY基團，其中Y為C1-C4烷基鏈；所述通式(I)的序列包含6-13個胺基酸殘基。術語「肽化合物」或「肽」表示通過肽鍵或修飾的肽鍵連接在一起的兩個或更多個
胺基酸的鏈。「肽化合物」或「肽」表示如上文所述的本發明的天然存在的或者合成的肽，或者是其通過蛋白水解或合成獲得的片段中的至少一種，或者其序列完全或部分由上述肽序列組成的任何天然存在的或合成的肽。構成本發明的肽化合物的胺基酸可以為左旋構型，即L-構型，和/或可以為右旋構型，即D-構型。因此本發明的肽可以為L-、D-或DL-形式。為了改善對降解的抗性，可能必需使用本發明的肽的受保護形式。保護形式顯然必須是生物學相容形式，並且應當與化妝品和藥物領域中的應用相容。優選地，為了保護N-末端胺基酸的伯胺官能團，用具有C1-C3tl、飽和或不飽和的烷基鏈的醯基類型取代基團R1，取代基可以選自乙醯基或芳香基團。優選地，為了保護C-末端胺基酸的羧基官能團，用C「C3(I烷基鏈類型取代基團R2,或者R2為NH2、NHY 或NYY基團，其中Y為C1-C4烷基鏈。本發明的肽可以在N-末端、C-末端或者這兩個末端受保護。在本發明的第一個優選實施方案中，在通式(I)中，X1為天冬氨酸、穀氨酸或者無胺基酸；X2為天冬醯胺、脯氨酸、絲氨酸或者無胺基酸；X3為天冬醯胺、精氨酸、亮氨酸或者無胺基酸；整數η和P等於O ;R1是游離的N-末端胺基酸的伯氨基官能團，R2是C-末端胺基酸的羧基官能團的羥基，其被可以選自C1-C3tl烷基鏈的基團取代，或者是ΝΗ2、NHY或NYY基團，其中Y為C1-C4燒基鏈；所述通式(I)的序列包含6-9個胺基酸殘基。在第二個優選實施方案中，所述肽化合物對應於下式之一(SEQ ID No: I)Asp - Pro - He - Gln - Ala - Cys - Arg - Gly - NH2(SEQ ID No: 2) He - Gln - Ala - Cys - Arg - Gly - NH2(SEQ ID No:3)Asn - Arg - lie - Gln - Ala - Cys - Arg - Gly-NH2(SEQ ID No:4)Pro-IIe-Gln-Ala-Cys-Arg-Gly-Phe-NH2本發明還涉及這些序列的同源形式。根據本發明，「同源」表示與選自序列SEQ IDNo: I至SEQ ID No:4的肽序列至少50%、或者優選至少80%以及更優選至少90%相同的任何肽序列。「至少Χ%相同的肽序列」表示兩個序列的最佳對比後獲得的，進行比較的兩個序列的胺基酸殘基之間的相似性百分比。最佳對比是利用局部同源性算法獲得的，例如可獲得自NCBI網站的BLAST P計算機軟體中使用的那些算法。術語「同源」還可以指肽，其由於化學上等同的胺基酸的取代，即由於用具有相同特徵的另一殘基取代一個殘基而與序列SEQ ID No: I至SEQ ID No:5的肽序列不同。因此常規取代在Ala、Val、Leu和Ile之間進行；在Ser和Thr之間進行；在酸性殘基Asp和Glu之間進行；在Asn和Gln之間進行；以及在鹼性殘基Lys和Arg之間進行；或者在芳香殘基Phe和Tyr之間進行。本發明的通式⑴的肽可以通過常規化學合成(在固相或液體均相中)或者通過酶促合成(Kullman et al.，J. Biol. Chem. 1980, 225，8234)從其組成胺基酸或衍生物獲得。本發明的肽可以是天然存在的或合成的。優選地，根據本發明，所述肽是通過化學合成獲得的。最後，活性成分可以是單種肽、肽混合物或者肽衍生物和/或由胺基酸衍生物組成。本發明的肽化合物可以用作藥物。根據本發明的一個有利的實施方案，將本發明的肽化合物溶解於一種或多種本領域技術人員常規使用的生理學合適的溶劑中，例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化二甘醇或丙氧基化二甘醇、環狀多元醇或者這些溶劑的任何混合物。根據本發明的另一有利的實施方案，將本發明的肽化合物溶解於化妝品或藥物載體如脂質體中，或者吸附在粉末狀有機聚合物、礦物支持物如滑石和膨潤土上，更通常溶解於或固定至任何生理學合適的載體。本發明的第二個目的涉及一種化妝品組合物，其包含所述通式(I)的肽化合物作為活性成分。優選地，本發明的組合物為適合局部施用的形式，其包含化妝品可接受的介質。「化妝品可接受」表示適合與皮膚或人角質附屬物接觸，無任何毒性、不相容性、不穩定性、過敏反應等風險的介質。施用於皮膚的組合物可以為霜劑、水包油或油包水乳劑或複合型乳劑、溶液劑、混懸劑、微乳劑、水性凝膠或無水凝膠、精華素(serum)形式，或者還可以是小泡分散液、貼劑、噴霧劑、軟膏劑、發膏、乳劑、膠體、乳(milk)、洗劑、口紅，或者還可以是粉末，所有均適合施用於皮膚、嘴唇和/或角質附屬物。
優選地,所述肽化合物以約O. 0005-500ppm的濃度、優選O. 01_5ppm的濃度存在於
組合物中。更優選地，本發明的組合物進一步包含至少一種其他活性成分，其促進所述肽化合物的作用。實例包括但不限於以下類別的成分其他活性肽物質，植物提取物，癒合、抗老化、抗皺、鎮靜(soothing)、自由基清除劑和抗UV物質，刺激真皮大分子合成或能量代謝的物質，水合、抗細菌、抗真菌、抗炎物質，麻醉劑，調節皮膚分化、色素沉積或色素脫失的物質，刺激指甲或毛髮生長的物質等。優選地，使用具有抗皺活性的物質如自由基清除劑或抗氧化劑，或者刺激真皮大分子合成的物質，或者刺激能量代謝的物質。具體地，所述活性成分選自維生素、植物留醇、黃酮類化合物、DHEA和/或其前體或者其化學或生物學衍生物、金屬蛋白酶抑制劑或者類視黃醇。此外，可以將添加劑如溶劑、稀釋劑、染料、防曬劑、仿曬劑(self-tanning agent)、顏料、填充劑、防腐劑、氣味吸收劑、增稠劑、乳化劑、溼潤劑、軟化劑、香料、抗氧化劑、成膜劑、螯合劑、掩蔽劑、調節劑等加入所述組合物中。在所有情況中，本領域技術人員會確保選擇這些輔助劑及其比例以不損害本發明組合物的有利性質。例如，這些輔助劑可以所述組合物總重量的O. 01-20%的量存在。當本發明的組合物為乳劑時，脂肪相可以佔所述組合物總重量的5-80重量％，並且優選5-50重量％。所述組合物中使用的乳化劑和輔助乳化劑選自本領域常規使用的那些乳化劑和輔助乳化劑。這些乳化劑和輔助乳化劑可以例如所述組合物總重量的O. 3-30重量％的量使用。本發明的第三個目的涉及包含本發明的肽化合物的組合物用於預防和/或修復DNA損傷、激活胱天蛋白酶-14以及形成聚絲蛋白的用途。旨在「預防和/或修復DNA損傷」的肽化合物表示能夠修復由於DNA鹼基之間的光化學反應(例如環丁烷嘧啶二聚體的形成)的損傷的生物學活性肽化合物或衍生物。「使得胱天蛋白酶-14激活」的肽化合物表示能夠增加胱天蛋白酶-14的量的任何生物學活性肽或衍生物，其通過增加胱天蛋白酶-14的蛋白合成(通過基因表達的直接或間接調節)，或者通過其他生物學過程，例如信使RNA轉錄物的穩定或不穩定。使得「聚絲蛋白的形成」增加的肽化合物表示能夠增加轉化為聚絲蛋白的聚絲蛋白原的量的任何生物學活性肽或衍生物，其通過胱天蛋白酶-14的蛋白水解活性的增加，或者通過胱天蛋白酶-14的量的增加。具體地，本發明的組合物用來預防和/或修復外部侵害所引起的DNA損傷。「外部侵害」表示可以由環境引起的侵害。實例包括這樣侵害，例如汙染，UV輻射，或者刺激性化學物質如表面活性劑、防腐劑或香料，機械侵害如擦傷、修面或脫毛。然而，優選地，外部侵害主要是UV輻射，特別是UVB輻射。本發明的另一個目的涉及包含所述肽化合物和化妝品可接受的介質的化妝品組合物用於預防和/或治療皮膚老化的跡象和光老化的用途。「皮膚老化的跡象」包括但不限於由皮膚老化引起的所有明顯表現。具體地，這是指皺紋、深粗皺紋、細紋、裂痕、皮膚和皮下組織的下垂、皮膚彈性喪失、和呆滯(sluggishness)、緻密性和色調喪失以及真皮萎縮。此外，「皮膚老化的跡象」還表示毛孔增大、瑕疵、褪色、老年斑、角化症、膠原喪失以及真皮和表皮中的其他變化，但是還表示由於老化的皮膚和角質附屬物外觀的任何變化，例如角質層表面粗糙，但是還表示不系統地表現為改變的外觀的皮膚的任何內部改變，例如真皮變薄。「光老化」表示由長期和累積暴露於太陽所引起的皮膚過早老化。優選地，本發明涉及如上文所述的組合物用於改善皮膚的屏障功能以及表皮的水合的用途。
最後，本發明的最後一個目的涉及化妝品治療方法，其特徵在於將包含有效量的本發明的肽化合物的組合物局部施用於待治療的皮膚或角質附屬物，以預防和/或治療皮膚老化的跡象和光老化以及預防和/或修復UV輻射引起的損傷。在一具體實施方案中，在皮膚暴露於太陽之前施用所述組合物，因此是優異的預處理以預防DNA水平的損傷。在本發明的第二實施方案中，將所述組合物作為曬後護理施用於皮膚以修復DNA水平的任何皮膚損傷。在本發明的最後一個優選實施方案中，在早上作為抗老化日間護理施用所述組合物，或者在睡前作為夜間修復護理施用所述組合物。如果用作日間護理，通過限制DNA水平的損傷的出現，所述組合物會提供關於環境侵害如UVB輻射的皮膚保護。作為夜間護理，所述組合物會通過修復白天所引起的皮膚損傷來發揮作用。


圖I是顯示用通過siRNA/胱天蛋白酶-14基因轉染的正常人角質形成細胞(NHK)進行的免疫印跡結果的直方圖。圖2a和2b是顯示在接受UV輻射的正常人角質形成細胞(NHK)上進行的2個彗星(comet)測試結果的直方圖。以下實施例描述和證實肽化合物的效力，例如本發明描述的那些效力，但是不應當理解為限制本發明。
實施例實施例I :在肽SEQ ID No:2的存在下，正常人角質形成細胞中胱天蛋白酶_14表達的研究這個研究的目的是測定胱天蛋白酶-14在通過本發明的肽處理或未處理的正常人角質形成細胞中的表達方案將培養的正常人角質形成細胞NHK用1%或3%-肽SEQ ID No: 2處理24小時。然後將細胞洗滌，用3. 7%-多聚甲醛固定，在BSA (稀釋至l/100th)的存在下使用O. 1%-triton。將細胞在胱天蛋白酶-14-特異性小鼠單克隆抗體(BD Biosciences)的存在下溫育,然後在與螢光標記偶聯的二抗的存在下溫育。然後將細胞通過落射螢光顯微鏡(Nikon EclipseE600顯微鏡)檢查。益果相對於對照條件，在肽處理的NHK細胞中觀察到光強度的增加。螢光的這種增加是劑量依賴性的，因為當加入3%的肽溶液時螢光比1%時更強。因此，肽SEQ ID No:2激活NHK中的胱天蛋白酶-14表達。實施例2:在用肽SEQ ID No:2處理的HNK中通過siRNA研究胱天蛋白酶-14表達為了定量本發明的肽對NHK群體中胱天蛋白酶-14過量表達的效力，利用siRNA技術「消除」編碼胱天蛋白酶-14的基因。 述將NHK細胞在6-孔板中培養至60%匯合，然後用20 μ L的1%-肽SEQID No: 2處理。然後，逐孔小心地滴加100 μ L先前製備的包含胱天蛋白酶-14的SiRNA和轉染試劑的混合物。將細胞培養板在37° C和5%C02下溫育72小時。每2天更換培養基。實施4種條件-條件I:不含siRNA和肽活性成分的對照-條件2=SiRNA轉染的細胞，不含肽活性成分-條件3:未轉染但用肽活性成分處理的細胞-條件4:用siRNA轉染並用肽活性成分處理的細胞利用常規免疫印跡技術(蛋白印跡)觀察胱天蛋白酶-14表達的定量，所述免疫印跡技術通過抗胱天蛋白酶-14抗體並根據常規方案進行。為了分析用siRNA轉染的NHK中由所述肽帶來的補償，與其基因未被siRNA消除的未處理的NHK進行比較。結果在條件I和3之間，發現加入所述肽導致胱天蛋白酶-14蛋白表達相對於對照增加20. 9%。在條件I和2之間，清楚看到siRNA對胱天蛋白酶-14蛋白表達的影響低30. 6%。然而，將肽SEQ ID No:2加入用siRNA轉染的細胞幫助恢復胱天蛋白酶-14，然後由於siRNA的存在的減少相對於對照條件僅14%。結論是本發明的肽SEQ ID No:2增加NHK中胱天蛋白酶_14的表達。實施例3 :在肽SEQ ID No: I的存在下，人皮膚活組織檢查中聚絲蛋白原/聚絲蛋白表達的研究這個研究的目的是測定本發明的肽對人皮膚活組織檢查中的聚絲蛋白和聚絲蛋白原(此後表示為聚絲蛋白原/聚絲蛋白)的量的影響。方案將人皮膚的樣品在空氣/液體界面培養。在第一條件下，將樣品用1%肽SEQ IDNo: I處理24小時和72小時。在第二條件下，將樣品用相同但濃度為3%的肽處理24小時和72小時。此後將這些皮膚樣品用甲醛固定，然後包埋入石蠟中。然後製備大小為2-3 μ m的切片。通過在胃蛋白酶中溫育來暴露特異性位點後進行免疫染色。然後，通過聚絲蛋白-特異性小鼠單克隆抗體(Tebu Santa Cruz),隨後與突光標記偶聯的二抗來進行免疫染色。然後利用落射螢光顯微鏡(Nikon Eclipse E600顯微鏡)檢測皮膚切片。益果在用本發明的肽處理的活組織檢查上觀察到原/聚絲蛋白染色的增加。注意到染色不僅是劑量依賴性的，而且其隨時間增加(24小時條件與72小時條件之間)。因此可以得出結論，肽SEQ ID No:l通過胱天蛋白酶-14表達和/或活性的增加，允許聚絲蛋白原切割為聚絲蛋白的增加。實施例4 =NHK細胞的彗星測試彗星測試是允許在細胞水平定量DNA損傷的測試。 述為了這個目的,將NHK細胞-在條件a下與濃度為1%和3%的序列SEQID No: 3的肽化合物培養24小時，然後用20mJ/cm2的UVB輻射照射，以觀察肽活性成分對細胞的保護效應；-在條件b下在第一步中，用20mJ/cm2的UVB輻射照射，然後用濃度為1%和3%的所述肽化合物處理24小時，以觀察活性成分對細胞的修復效應。在每種情況下，通過無肽活性成分存在來實現對照條件。然後通過胰蛋白酶處理(trypsination)來將細胞從它們的載體移出，然後在900rpm下離心5分鐘,之後濃縮和計數。然後將特定細胞計數(25，000個細胞)摻入O. 75%低熔點瓊脂糖凝膠中，然後沉積在預先用1%瓊脂糖包被的玻片上。然後將玻片在4° C下浸沒於裂解緩衝液中I. 5小時，然後在4° C下於鹼性溶液中20分鐘。然後裂解細胞，並且變性DNA。將玻片浸沒於電泳溶液中，然後施加電場(20V- 250mA)。因此使變性的DNA在瓊脂糖凝膠內於4° C下遷移。在玻片上施用DNA螢光染料(2 μ g/ml碘化丙啶)使得被損傷的情況下的DNA以彗星形式被觀測到。定量軟體用來確定應用於每種測試條件的平均尾矩(Tail Moment)。這個參數提供DNA損傷水平的信息該參數越高，DNA損傷越大。結果結果如圖2a和2b所示。在條件a下，當所述肽作為預處理(濃度為1%或3%)施用時，尾矩降低57%，即細胞比施加UVB輻射的對照條件下遭受更少損傷。這些結果清楚地證實SEQ ID No:3的肽化合物對NHK細胞的保護效應。此外，當在沒有任何預處理的照射後施用所述肽(條件b)時，當以1%的濃度施用所述肽時，尾矩降低31%。當以3%的濃度施用所述肽時，尾矩降低58%。條件b下的這個測試證實肽SEQ ID No: 3對UV照射下的DNA的補救作用。實施例5 :肽SEQ ID No: 2對接受UVB輻射的人皮膚活組織檢查的療效的證實這個實驗的目的是測量本發明的肽化合物在人皮膚活組織檢查暴露於UVB輻射後的修復能力。UV輻射，特別是UVB輻射誘導發生在包含兩個相鄰的嘧啶(胸苷、胞嘧啶)的位點上的二聚化反應。然後形成幾種類型的光產物，其中有環丁烷-嘧啶二聚體或CPD。然而，已知當細胞受到基因毒性應激時，其分裂周期暫時停止以允許DNA修復並避免在隨後的細胞世代內發生突變。僅在此後繼續細胞增殖。如果損傷的比率或量太高，或者如果修復無效，細胞引發程序性細胞死亡過程凋亡。因此，通過抗(PD抗體免疫染色測量形成的光產物的量允許評價具有DNA修復作用的化合物的有效性。
_4] 接受UVB輻射的皮膚活組織檢杳上的CPD免疫染色方案將人皮膚活組織檢查在空氣/液體界面培養。使這些活組織檢查接受200mJ/cm2的UVB輻射。照射之後，在第一條件下，將肽SIQ ID No: 2的1%-溶液局部施用於該活組織檢查24小時。在第二條件下，將肽SIQ ID No:2的3%-溶液局部施用24小時。通過在照射之後局部施用PBS溶液來實現對照條件。為了染色環丁烷-嘧啶二聚體，將皮膚活組織檢查包入石蠟並製備3 μ m厚的組織切片。將玻片脫蠟，水合，並且用針對環丁烷-嘧啶二聚體的抗體(MBL D194-1，小鼠單克隆)然後與螢光標記偶聯的合適的二抗(InvitiOgen A21202)進行免疫染色。然後用落射螢光顯微鏡(Nikon Eclipse E 80i顯微鏡)檢查皮膚切片。 益果在對照條件下，當活組織檢查接受UVB輻射時觀察到的螢光較強。在利用肽SEQID No:2後處理測試的兩種條件下，均觀察到比用UVB輻射的對照條件弱很多的螢光。肽SEQ ID No:2提供更好和更顯著的DNA損傷修復，特別是作為胱天蛋白酶-14激活的結果。還觀察到這種修復作用是劑量依賴性的，因為施用更大量的活性成分時修復作用更顯著。實施例6 :防曬組合物
權利要求
1.以下通式(I)的肽化合物R1 - (AA)n-X1 -X2- He - Gln - Ala - Cys - Arg - Gly -X3- (AA)p - R2 其中X1為天冬氨酸、穀氨酸或者無胺基酸； X2為天冬醯胺、脯氨酸、絲氨酸或者無胺基酸； X3為天冬醯胺、精氨酸、亮氨酸或者無胺基酸； AA為任何胺基酸,並且η和P為0-2的整數； R1是游離的N-末端胺基酸的伯胺官能團； R2是C-末端胺基酸的羧基官能團的羥基，其被可以選自C1-C3tl烷基鏈的基團取代，或者是ΝΗ2、NHY或NYY基團，其中Y為C1-C4烷基鏈； 所述通式(I)的序列包含6-13個胺基酸殘基。
2.如權利要求I所述的肽化合物，其特徵在於其對應於下式之一(SEQ ID No: I)Asp - Pro - lie - Gln - Ala - Cys - Arg - Gly - NH2(SEQ ID No: 2) He - Gln - Ala - Cys - Arg - Gly - NH2(SEQ ID No:3)Asn - Arg - lie - Gln - Ala - Cys - Arg - Gly-NH2(SEQ ID No:4)Pro-IIe-Gln-Ala-Cys-Arg-Gly-Phe-NH2。
3.如權利要求I或2之一所述的肽化合物，其特徵在於其溶解於一種或多種生理學合適的溶劑中如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化二甘醇或丙氧基化二甘醇、環狀多元醇或者這些溶劑的任何混合物。
4.如前述權利要求之一所述的肽化合物，其特徵在於其用作藥物。
5.一種化妝品組合物，其包含權利要求1-3之一所述的肽化合物作為活性成分。
6.如權利要求5所述的化妝品組合物，其特徵在於其為適合局部施用的形式，包含化妝品可接受的介質。
7.如權利要求5或6之一所述的組合物，其特徵在於所述肽化合物以約O.0005-500ppm的濃度、優選O. 01_5ppm的濃度存在於所述組合物中。
8.如權利要求5-7之一所述的組合物,其特徵在於其進一步包含至少一種其他活性成分，所述活性成分促進所述肽化合物的作用。
9.如權利要求8所述的組合物，其特徵在於所述活性成分是具有抗皺活性的物質如自由基清除劑或抗氧化劑，或者刺激真皮大分子合成的物質，或者刺激能量代謝的物質。
10.包含權利要求1-3之一定義的肽化合物以及化妝品可接受的介質的化妝品組合物用於預防和/或修復DNA損傷，以及激活胱天蛋白酶-14和聚絲蛋白形成的用途。
11.如權利要求10所述的組合物的用途，其特徵在於所述損傷是由UV輻射誘導的。
12.如權利要求10所述的化妝品組合物用於預防和/或治療皮膚老化的跡象和光老化的用途。
13.如前述權利要求所述的組合物的用途，其特徵在於皮膚老化的跡象是指皺紋、深粗皺紋、細紋、裂痕、皮膚和皮下組織的下垂、皮膚彈性喪失、和呆滯、緻密性和色調喪失以及真皮萎縮。
14.如權利要求10所述的用途，其用於改善皮膚屏障功能和表皮水合。
15.一種化妝品治療方法，其特徵在於將包含有效量的權利要求1-3之一定義的肽化合物的組合物局部施用在皮膚上以預防和/或治療皮膚老化的跡象和光老化以及預防和/或修復UV福射引起的損傷。
16.如前述權利要求所述的化妝品治療方法，其特徵在於在暴露於太陽之前作為曬前護理施用所述組合物以防止DNA水平的損傷。
17.如權利要求15所述的化妝品治療方法，其特徵在於在暴露於太陽之後作為曬後護理施用所述組合物以修復DNA水平的損傷。
18.如權利要求15所述的化妝品治療方法，其特徵在於在早上作為抗老化日間護理施用所述組合物，或者在睡前作為夜間修復護理施用所述組合物。
全文摘要
本發明涉及作為胱天蛋白酶-14激活劑的通式(I)的肽化合物R1–(AA)n–X1–X2–Ile–Gln–Ala–Cys–Arg–Gly–X3–(AA)p–R2。本發明還涉及包含生理學可接受的介質中的至少一種通式(I)的肽的化妝品或藥物組合物，並且涉及所述組合物用於預防和/或修復DNA損傷、預防和/或治療老化的皮膚跡象和光老化以及改善皮膚屏障功能的用途。本發明還涉及用於預防和/或治療老化的皮膚跡象和光老化以及用於預防和/或修復UV輻射導致的損傷的化妝品治療方法。
文檔編號A61K38/04GK102947323SQ201180012252
公開日2013年2月27日 申請日期2011年2月1日 優先權日2010年2月5日
發明者C·達爾法拉, N·東洛熱, J-M·博託 申請人:Isp投資公司