應用濁點系統進行甾體生物轉化製備睪酮的方法
2023-06-02 10:47:26 1
專利名稱：應用濁點系統進行甾體生物轉化製備睪酮的方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域。具體涉及濁點系統在甾體生物轉化製備 睪酮中的應用。背暈技術微生物轉化疏水性化合物常受到一些因素的嚴重製約底物在水中的溶解 度小，限制了其生物利用度，而且產物/底物對微生物存在著抑制和毒害作用。 這些問題在生物降解有毒汙染物時也經常遇到。非水介質因其獨特的功能在生 物轉化中起著重要的作用，近年來取得了很大的進步。本發明人己經開發了一 種新系統，該系統是非離子表面活性劑膠束溶液，在溫度高於其濁點或有誘導 物存在的條件下，會自動分相形成表面活性劑稀相和富含表面活性劑的凝集層 相。即採用一種或一種以上非離子表面活性劑形成濁點低於微生物轉化培養溫 度的水溶液系統即濁點系統(cloud point system, CPS)，作為微生物轉化的介 質。在CPS中，形成了油包水和水包油的微觀乳濁液。表面活性劑液滴具有增 溶能力，充當著底物的儲藏庫和產物的抑制劑。強化了底物的利用度，排除了 產物的抑制。連續的表面活性劑相中存在水泡，相當於一個微反應器，能使微 生物免受表面活性劑的毒害作用。CPS應該具有較好的生物相容性。底物、產 物可在兩相中實現不同的分配，基於兩相系統的微生物轉化可能排除潛在的產 物、底物抑制或毒害。另外，如果產物和細胞能在不同相中分配就可通過萃取 分離細胞以替代常規的機械分離。表面活性劑膠束溶液具有增溶作用，能顯著 地增加疏水性物質的表觀溶解度，由此增強其生物利用度，刺激微生物轉化。 濁點系統的生物相容性和對底物生物利用度的強化作用已被證實。甾體類藥物是一大類在臨床上具有特殊治療作用，且其他藥物無法替代的 極其重要的藥物。其中，睪酮(17P-羥基雄甾-4-烯-3-酮，Testosterone, TS)作 為一種雄性激素藥物，可以促進雄性動物第二性徵的發育和性器官的成熟，近 年來作為替代療法被用於治療男性患者的原發性或繼發性性腺功能減退症。另 外，睪酮是蛋白同化激素的重要前體物質，蛋白同化激素的主要作用在於改善
蛋白代謝，促進蛋白質合成和減少蛋白質異生，減少鈣、磷排洩，減輕骨髓抑 制，恢復和增強體力、利尿降壓等。由於其具有顯著的抗衰老和抗癌作用，應 用範圍日益擴大。本發明人在中國發明專利200510024193.5中公開了應用高產突變菌株偶發 分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum) CGMCCNo. 1241製備睪酮的方法。基於濁點系統在疏水化合物生物轉化中的諸多優勢，本發明公開了將濁點 系統與高產菌株相結合運用於甾體生物轉化來製備睪酮的方法。發明內容本發明所要解決的技術問題在於通過設計合理的濁點系統提高生物轉化產 率，特別是提供通過甾體類底物轉化生產睪酮的濁點系統的優化生產方法。實 驗證明，在濁點系統中表面活性劑濃度和底物濃度對轉化產率具有較大的影響。 本發明通過選擇底物、表面活性劑濃度以及其它轉化培養參數，建立了製備睪 酮的適宜條件，轉化效果與傳統轉化系統相比有明顯提高。本發明中微生物菌種釆用偶發分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum) CGMCC No. 1241;轉化底物是動植物甾醇，可選自膽甾醇、谷甾醇、菜油甾醇或它們的 混合物。採用本發明方法進行睪酮製備時，為促使固體甾醇底物更好地溶解，改善 轉化效果，特別在轉化系統中添加非離子表面活性劑以形成濁點體系。轉化培 養基中可利用的碳源選自糊精、檸檬酸鹽、甘油、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、葡 萄糖、可溶性澱粉，或它們的組合，含量為1.0%-6.0%;氮源可選自酵母粉、復 合胺基酸、蛋白腖、玉米漿、尿素、硝酸鹽、銨鹽，含量0.2%-3.0%;轉化中可 適當添加磷酸鹽、鎂鹽、鈉鹽等無機鹽成分。本發明採用CGMCC No. 1241菌株在濁點系統中進行睪酮製備時，優選的 轉化培養基為葡萄糖2.0%-5.5%、酵母粉0.2%-2.0%、磷酸二氫鉀0.5%-1.5%、 動植物甾醇1.0%-4.0%;非離子表面活性劑採用Triton X-100和Triton X-114 的組合，兩者質量比是1:0.8-1.2，混合表面活性劑優選濃度為5%-10%;優選轉 化pH為5.5-7.0;轉化時間5-9天。本發明中涉及的轉化產物的分析採用HPLC方法，其中樣品處理步驟、系 統參數設置如下試樣製備取轉化液2ml，定量加入丙酮8ml，振蕩混勻後放置過夜。吸出 上層清液lml於15000rpm離心10分鐘，取離心所得上清液供HPLC檢測。 分析系統Agilent 1100色譜柱C18， ODS， 5(im， 4.6mmX250mm，檢測波長242nrn柱溫50°C流動相甲醇:水=80:20 (體積比) 流速0.8ml/min具體實施方式
以下通過若干實例對本發明作進一步描述。但本發明的內容並不局限於此。 其中標明的轉化率均指摩爾轉化率；標明組分的百分含量之處均指重量與體積 之比(w/v);不同表面活性劑的配比是指它們之間的重量之比(w/w)。實施例l斜面培養基葡萄糖1.0%，酵母浸出粉1.0%，聚蛋白腖0.8%，瓊脂粉1.5%。 種子培養基葡萄糖1.0%，酵母浸出粉1.0%，磷酸二氫鉀0.2%。 轉化培養基葡萄糖4.0%，酵母浸出粉1.0%，磷酸二氫鉀0.7%，谷甾醇1.0%，表面活性劑(Triton X-100:Triton X-l 14= 1:1) 5.5%;消前pH 6.5。培養條件斜面培養溫度28。C，培養時間5天；種子液培養溫度28。C，培養時間2天；轉化培養溫度28。C，培養時間5天。搖瓶轉速220rpm/min,旋轉式搖床振蕩培養。轉化培養結束測得轉化率為82.4%。實施例2斜面培養基、種子培養基和各階段培養條件同實施例1。轉化培養基糊精4.0%，葡萄糖1.0%，蛋白腖1.2%，硝酸鉀0.1%，磷酸 二氫鉀0.5%，膽甾醇1.3%，表面活性劑(TritonX-lOO:TritonX-114= 1:1.2)6.0%; 消前pH5.8。轉化培養條件同實施例l。轉化培養結束測得轉化率為78%。實施例3斜面、種子培養所用培養基和培養條件同實施例l。
轉化培養基可溶性澱粉3.5%，葡萄糖1.5%，玉米漿2.0%，磷酸二氫鉀 0.8%，混合植物甾醇(兩者重量比為谷甾醇:菜油甾醇=2:1) 3.0%，表面活性劑 (Triton X-100:Triton X-114= 1:0.8) 8.0o/o，消前pH 6.8。轉化培養時間7天，其它培養條件同實施例1。 轉化培養結束測得轉化率為66%。實施例4斜面、種子培養所用培養基和培養條件同實施例l。轉化培養基葡萄糖5.0%，酵母浸出粉1.5%，磷酸二氫鉀1.2%，混合植 物甾醇(兩者重量比為谷甾醇:菜油甾醇=2:1) 3.5%，表面活性劑(Triton X-100:TritonX-114= 1:1) 9.0%，消前pH6.8。轉化培養時間8天，其它培養條件同實施例1。 轉化培養結束測得轉化率為61%。實施例5斜面培養基、種子培養基和各階段培養條件同實施例l。轉化培養基糊精1.0%，葡萄糖1.5%，玉米漿0.8%，蛋白腖0.8%，磷酸 二氫鉀0.5%，混合植物甾醇(兩者重量比為谷甾醇:菜油甾醇=2:1) 2.0%，表面 活性劑(Triton X-100:TritonX-114= 1:1) 6.5%，消前pH6.0。轉化培養時間6天，其它培養條件同實施例1。轉化培養結束測得轉化率為81.7%。
權利要求
1.濁點系統在甾體生物轉化製備睪酮中的應用方法。
2. 根據權利要求1所述的濁點系統在甾體生物轉化製備睪酮中的應用方法，其 特徵在於其中的濁點系統是通過在轉化培養基中添加非離子表面活性劑而形成 的。
3. 根據權利要求2所述，其特徵在於其中形成濁點系統所需添加的非離子表面 活性劑由TritonX-100與TritonX-114以1:0.8-1.2比例混合構成，優選添加量為 5%-腦。
4. 根據權利要求1和權利要求2所述，其特徵在於轉化採用的甾體底物是動植 物甾醇。
5. 根據權利要求4所述，其中的動植物甾醇可選自於膽甾醇、谷甾醇、菜油甾 醇或它們的混合物，加量以1%-4%為較適。
全文摘要
本發明屬於微生物技術領域。本發明提供了應用濁點系統進行甾體生物轉化製備睪酮的方法。通過選擇底物、表面活性劑濃度以及其它轉化培養參數，建立了製備睪酮的適宜條件，轉化效果與傳統轉化系統相比有明顯提高。
文檔編號C12P33/06GK101153314SQ20061011651
公開日2008年4月2日 申請日期2006年9月26日 優先權日2006年9月26日
發明者凌良飛, 梅 戈, 王志龍 申請人:上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司