基於穀氨酸脫氫酶的工程菌及其實現方法
2023-07-20 14:22:46
基於穀氨酸脫氫酶的工程菌及其實現方法
【專利摘要】一種灰略紅鏈黴菌(Streptomyces griseorubens)胞內穀氨酸脫氫酶編碼基因及其應用。通過將該穀氨酸脫氫酶編碼基因構建到表達載體上，並將該重組表達載體導入大腸桿菌進而得到可發酵合成穀氨酸脫氫酶的轉基因重組大腸桿菌。本發明克服現有技術中由於穀氨酸脫氫酶多為胞內表達且表達量較低導致的應用範圍和效果嚴重受限等不足，應用基因工程手段實現其體外的大量表達合成。此外，本發明通過在重組蛋白添加聚組氨酸標籤的方法，方便了後期蛋白的純化。本發明可為穀氨酸脫氫酶的規模化發酵生產提供一種新方法。
CGMCC NO.5706
20120109
【專利說明】基於穀氨酸脫氫酶的工程菌及其實現方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及的是一種生物基因工程【技術領域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰 略紅鏈黴菌的基於穀氨酸脫氫酶的工程菌及其實現方法。
【背景技術】
[0002] 氮是植物生長發育過程中最重要的營養元素之一。目前，維持或提高作物產量的 主要方法是大量施肥，然而氮肥的大量施用，不僅增加了農民的生產成本，而且會加劇水體 的富營養化及溫室氣體的排放。
[0003] 對作物而言，能夠吸收同化Nor、NH4+及氨態N等不同氮素形態。植物以NO廠為 氮源時，氮同化可以分為3個階段：（1)氮的無機同化（Ν0Γ - NO2 - NH4+) ; (2)氨的同化，SP NH4+經過穀氨酸脫氫酶（GS)合成穀氨醯胺，再由穀氨醯胺經穀氨酸脫氫酶（GOGAT)合成谷 氨酸；（3)氨的有機同化，即由穀氨醯胺和穀氨酸合成其它胺基酸，進而合成蛋白質和其他 物質；(4)氨的異化，即在穀氨酸脫氫酶作用下將穀氨酸催化分解為α -酮戊二酸和氨。谷 氨酸脫氫酶是作為一種不需氧的脫氫酶，既能利用NAD+又能利用NADH+作為還原當量。由 此可見，穀氨酸脫氫酶在氮代謝轉化通路中起著十分關鍵的作用。
【發明內容】
[0004] 本發明針對現有技術存在的由於穀氨酸脫氫酶在生物體內多為胞內酶且表達量 較低導致的應用範圍和效果嚴重受限等不足，提出一種基於穀氨酸脫氫酶的工程菌及其實 現方法，能夠應用基因工程手段實現其體外的大量表達合成，此外本發明通過在重組蛋白 添加聚組氨酸標籤的方法，方便了後期蛋白的純化，可為穀氨酸脫氫酶的規模化發酵生產 提供一種新的途徑。
[0005] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0006] 本發明涉及一種穀氨酸脫氫酶的工程菌，該工程菌為外源表達穀氨酸脫氫酶的大 腸桿菌。
[0007] 所述的胞內穀氨酸脫氫酶具體為灰略紅鏈黴菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1穀氨酸脫氫酶編碼基因 SG - GH的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，胺基酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
[0008] 所述的穀氨酸脫氫酶編碼基因通過全基因組測序和PCR擴增的方式克隆獲得。
[0009] 所述的灰略紅鏈黴菌（Streptomyces griseorubens)，命名為JSD -1，現保藏於中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽區北辰西 路1號院3號，郵編：100101，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
[0010] 本發明涉及上述工程菌的實現方法，以灰略紅鏈黴菌基因組DNA為模板，與含有 酶切位點的引物進行PCR擴增得到編碼穀氨酸脫氫酶的核苷酸序列；然後將擴增得到的核 苷酸序列連接到表達載體PET - 22b (+);之後將該穀氨酸脫氫酶表達載體轉化到大腸桿菌 表達菌株內，獲得穀氨酸脫氫酶過表達重組菌株。
[0011] 所述的含有酶切位點的引物序列，包括：
[0012] GH -Nde I - F: GTACATATGCAGACCAAGCTGGACGAAGCCAAG
[0013] GH - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCGAGTTCCTGAGCAGCGTG
[0014] 所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，55°C退火15s，68°C延 伸2min ;30個循環後68°C終延伸5min。
[0015] 所述的大腸桿菌表達菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0016] 本發明涉及一種穀氨酸脫氫酶的工程菌的應用，將其用於穀氨酸脫氫酶的體外高 效表達，並最終實現穀氨酸的工業發酵生產。 技術效果
[0017] 現有穀氨酸脫氫酶在灰略紅鏈黴菌內為胞內酶且表達量很低，因此嚴重限制了其 使用範圍和效果；與現有技術相比，本發明提供了一種全新的穀氨酸脫氫酶基因序列；在 特殊條件下（如高溫以及鹼性）具有更穩定的生物學活性；本發明通過構建外源表達載體， 實現了穀氨酸脫氫酶的體外過表達，並通過在表達重組蛋白C端添加聚組氨酸標籤的方 法，維持蛋白活性的同時也最大程度的保證了蛋白純度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018] 圖1為基於KEGG的灰略紅鏈黴菌硝酸鹽代謝通路預測圖。
[0019] 圖2為穀氨酸脫氫酶基因表達水平示意圖。
[0020] 圖3為穀氨酸脫氫酶信號肽預測圖。
[0021] 圖4為穀氨酸脫氫酶空間結構模擬圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施 例。 實施例1
[0023] 本實施例包括以下步驟：
[0024] 步驟1)灰略紅鏈黴菌（Streptomyces griseorubens)的分離及培養：灰略紅鏈黴 菌（Streptomyces griseorubens)分離自上海市浦江鎮收集的腐爛稻杆，保藏編號為CGMCC No. 5706。將該菌種接種於LB液體培養基，32°C培養48h。
[0025] 上述LB液體培養基組分為：蛋白腖10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCl 10. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液體培養基中加入15. 0 - 20. 0g/L瓊脂即得LB固體培養基。
[0026] 步驟2)灰略紅鏈黴菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA提取：收集 2. OmL菌液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉澱，加入180 μ 1溶菌酶（20mg/mL)和 20 μ I EDTA 溶液（0· 5M, pH 8. 0)，37°C處理 45min，加入 4 μ I RNase A (100mg/mL)，震蕩混 勻15s，室溫放置5min，隨後按照細菌DNA提取試劑盒操作說明完成剩餘操作，得到高純度 基因組DNA。通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質量，確保無明顯RNA條帶，基因 組條帶清洗、完整、無降解、無汙染。
[0027] 步驟3)灰略紅鏈黴菌（Streptomyces griseorubens)基因組測序：確定全基因組 鳥槍法（WGS)策略，採用第二代測序技術，構建不同插入片段長度的文庫，採用Illumina平 臺進行測序。收集測序的原始數據，對帶接頭、低質量的數據進行過濾，隨後對去除接頭的 測序數據進行從頭拼接，最後進行缺口填補得到鏈黴菌基因組草圖。
[0028] 步驟4)蛋白編碼基因功能預測：採用Glimmer 3. 0軟體對全基因組序列進行基因 預測。基因預測模型選取自我訓練基因預測模型，即提取拼裝序列中最長的序列，以該序列 作為基因預測模型訓練的序列。然後以該序列構建的基因預測模型，對所有序列進行基因 預測，設定開放閱讀框的長度為ll〇bp，其餘參數為Glimmer 3.0的默認設置。
[0029] 步驟5)KEGG是基因組注釋上應用最廣泛的的資料庫。KEGG注釋的主要目的包括 兩個：KO注釋，即將分子網絡的相關信息進行跨物種注釋；KEGG Pathway注釋，即代謝通路 注釋，獲得物種內分子間相互作用和反應的網絡。
[0030] 蛋白編碼基因的KO及Pathway注釋主要採用KEGG的KAAS自動化注釋系統完成。 KO注釋完成後，將KO映射到相應的KEGG Pathway通路上，便可得相應的KEGG代謝通路。 應用上述方法，目前已獲得灰略紅鏈黴菌JSD - 1內硝酸鹽代謝通路（圖1)。
[0031] 步驟6)灰略紅鏈黴菌總RNA的提取：將鏈黴菌接種於以KNO3為唯一氮源的無機 鹽培養基，32°C、150rpm條件下培養72h。每12h取樣，離心收集菌體沉澱，並按細菌總RNA 提取試劑盒要求提取高純度的鏈黴菌總RNA。
[0032] 上述無機鹽培養基組分為：葡萄糖20g/L，KH2PO4L Og/L，NaCl 0· 5g/ L，MgSO4O. 25g/L, CaCl2 ·2Η200· lg/L, FeSO4 ·7Η20 0· 01g/L 及 KN03(lg/L、3g/L、5g/L 和 IOg/ L) 〇
[0033] 步驟7)穀氨酸脫氫酶表達水平測定：根據穀氨酸脫氫酶基因序列，通過DNAMN 6. 0軟體設計特異性PCR引物，引物序列如下：
[0034] GF - F:AAACTGCCGACTGGGACC
[0035] GF - R:GCGGTCGGTGAGGTCTTC
[0036] 同樣的，根據16S rRNA的特異性序列設計引物，並作為內參基因，引物序列如下：
[0037] 16S rRNA - F:CGTATTCACCGCAGCAATGC
[0038] 16S rRNA - R:GCGAGGTGGAGCGAATCTCA
[0039] 以鏈黴菌總RNA模板進行反轉錄獲得cDNA文庫，並按照螢光定量PCR試劑盒要求 進行相關操作。設置三個重複，待實驗完成收集處理數據，分析在不同濃度KNO 3作用下，谷 氨酸脫氫酶的表達量（如圖2)。結果表明，隨著時間的延長和KNO3濃度的升高，該穀氨酸脫 氫酶的表達量顯著上調，證明該基因確實參與硝酸鹽的代謝過程。隨著硝酸鹽濃度的升高， 穀氨酸脫氫酶的表達量呈現先升高後下降的趨勢，且當硝酸鹽添加量為3g/L時，穀氨酸脫 氫酶的表達量達到最大。
[0040] 上述的螢光定量PCR的反應條件為：95°C預變性30s ;95°C變性10s，60°C退火 30s，72°C延伸15s，共40個循環。
[0041] 步驟8)穀氨酸脫氫酶膜定位預測：採用SignalP 4. 1分別對穀氨酸脫氫酶進行信 號肽模擬，如圖3所示。結果表明穀氨酸脫氫酶的N端不存在明顯的信號肽序列，推測該酶 為胞內酶。
[0042] 步驟9)穀氨酸脫氫酶胺基酸序列對比：在NCBI資料庫中搜索與灰略紅鏈黴菌 (Streptomyces griseorubens)穀氨酸脫氫酶序列相似度最高的蛋白質序列，可知本發明 所示序列與已知的穀氨酸脫氫酶胺基酸序列在一級結構上具有很高的相似度，相似度最大 可達99%。
[0043] 步驟10)穀氨酸脫氫酶3D模型預測：運用PHYRE 2在線程序對穀氨酸脫氫酶的3D 空間模型進行預測，結果如圖4所示。穀氨酸脫氫酶與PDB資料庫中已有蛋白模型的最高 相似度僅為18%，說明該酶在二級結構上與目前已報到的穀氨酸脫氫酶存在較大的差異。 儘管如此，預測結果仍然具有100%可信度。
[0044] 步驟11)穀氨酸脫氫酶表達載體構建：根據穀氨酸脫氫酶基因序列，設計含有酶 切位點的引物，序列如下：
[0045] GH -Nde I - F: GTACATATGCAGACCAAGCTGGACGAAGCCAAG
[0046] GH - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCGAGTTCCTGAGCAGCGTG
[0047] 以灰略紅鏈黴菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA為模板，用含有Nde I和EcoR I酶切位點引物進行PCR擴增獲得穀氨酸脫氫酶基因序列，使用DNA A -Tailing Kit加 A後連接到T - Vector PMDtm 19 - T，並將連接產物轉入DH5 α大腸桿菌內。在氨苄 (50 μ g/mL)抗性平板上挑選陽性克隆，搖菌提取質粒測序。隨後Nde I和EcoR I進行雙 酶切（37°C )，回收穀氨酸脫氫酶片段GH。用相同內切酶酶切表達載體pET - 22b(+)並回 收載體DNA片段。將GH與載體片段混合，T4DNA連接酶過夜連接（16°C )，將連接產物轉入 DH5a大腸桿菌感受態細胞內，通過抗性平板及菌落PCR篩選含有重組質粒的陽性克隆。挑 取陽性克隆接種於含有氨苄青黴素（50yg/mL)的LB液體培養基中，於180rpm、37°C條件下 培養16小時提取質粒測序，結果證實插入片段與基因組測序結果完全相同。
[0048] 上述GH基因擴增條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，55°C退火15s，68°C延 伸2min ;30個循環後68°C終延伸5min。
[0049] 步驟12)穀氨酸脫氫酶表達菌株的構建：將上述穀氨酸脫氫酶表達載體轉入大腸 桿菌Transetta (DE3)，並在含有氨苄青黴素（50 μ g/mL)和氯黴素（34 μ g/mL)的LB固體培 養基上篩選，獲得穀氨酸脫氫酶表達菌株。
[0050] 上述的Transetta(DE3)具有以下特徵：該菌株具有氯黴素（Canf)，且含有大腸杆 菌缺乏的6種稀有密碼子（AGA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)對應的tRNA，可有效提高外源基因， 尤其是真核生物及鏈黴菌等高GC含量生物基因在原核系統中的表達水平。
【權利要求】
1. 一種穀氨酸脫氫酶的工程菌，其特徵在於，該工程菌為外源表達穀氨酸脫氫酶的大 腸桿菌； 所述的胞內穀氨酸脫氫酶具體為灰略紅鏈黴菌（Streptomyces griseorubens)JSD-l 穀氨酸脫氫酶編碼基因 SG-GH的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2. 根據權利要求1所述的工程菌，其特徵是，所述的灰略紅鏈黴菌（Streptomyces griseorubens) JSD -1，現保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
3. -種根據權利要求1或2中所述的工程菌的實現方法，其特徵在於，以灰略紅鏈黴菌 基因組DNA為模板，與含有酶切位點的引物進行PCR擴增得到編碼穀氨酸脫氫酶核苷酸序 列；然後將擴增得到的核苷酸序列連接到表達載體PET-22b (+);之後將該穀氨酸脫氫酶表 達載體轉化到大腸桿菌表達菌株內，獲得穀氨酸脫氫酶過表達重組菌株。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵是，所述的含有酶切位點的引物包括： GH - Nde I - F:GTACATATGCAGACCAAGCTGGACGAAGCCAAG GH - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCGAGTTCCTGAGCAGCGTG〇
5. 根據權利要求3所述的方法，其特徵是，所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性 3min ;98°C變性 10s，55°C退火 15s，68°C延伸 2min ;30 個循環後 68°C終延伸 5min。
6. 根據權利要求3所述的方法，其特徵是，所述的大腸桿菌表達菌株為 Transetta(DE3)大腸桿菌。
7. -種根據上述任一權利要求所述的穀氨酸脫氫酶的工程菌的應用，其特徵在於，將 其用於穀氨酸脫氫酶的體外高效表達，並最終實現穀氨酸的工業發酵生產。
【文檔編號】C12P13/14GK104498419SQ201410705878
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月27日 優先權日:2014年11月27日
【發明者】周培, 馮海瑋, 王大欣, 俞明磊, 毛亮, 唐冬 申請人:上海交通大學