樟柳鹼在製備預防或治療腎纖維化的藥物中的應用的製作方法
2023-08-06 05:22:56 2
本發明屬於醫藥領域，具體涉及樟柳鹼在製備預防或治療腎纖維化的藥物中的應用。
背景技術：
腎纖維化是各種慢性腎臟疾病(ckd)發展至終末期腎衰竭的最終共同通路和病理基礎，是嚴重危害人類生命健康的重要疾病之一。腎間質纖維化的特徵是大量的細胞外基質(ecm)成分進行性地沉積於腎小管及小管周圍毛細血管間隙內，破壞了正常的腎小管和腎間質結構，最終導致腎臟完全喪失臟器功能。腎間質纖維化的發病機制十分複雜，涉及細胞表型轉換、氧化應激、炎症反應、多種細胞因子與細胞間相互作用等過程，阻止甚至於逆轉腎間質纖維化的進展對於ckd的治療具有十分重要意義。
目前臨床上尚缺少能有效治療腎間質纖維化的藥物，現有的治療措施主要在於控制原發疾病及其惡化因素，如：降血糖、降血壓、控制感染、調脂以及改善腎臟局部的微循環等。但這些方式僅能非常有限地減緩疾病的發展，當進展至腎纖維化不可逆階段或出現嚴重的腎功能損傷時，患者只能通過血液透析、腹膜透析、腎移植來維持生命，這給患者及其家庭和社會都帶來了沉重的負擔。臨床上現有的抗纖維化藥物存在毒性大、安全性低等問題，在實際應用中存在很大的局限，因此，從天然產物中尋找高效低毒的的潛在抗纖維化藥物具有重要意義。
樟柳鹼(anisodine)，化學式為c17h21no5，相對分子量為319.35，化學結構如下：
是由我國科學家首次從唐古特山莨菪根中分離得到的一種新型抗膽鹼能藥物，臨床上主要使用的是它的氫溴酸鹽。氫溴酸樟柳鹼是白色結晶，易溶於水，不溶於氯仿、乙醚，無臭，味苦，具有解除平滑肌痙攣、抑制唾液分泌、散瞳等抗膽鹼能作用。目前在臨床中樟柳鹼可用於治療血管性頭痛、視網膜血管痙攣、中心性視網膜病變、缺血性視神經病變、急性癱瘓、震顫麻痺、支氣管哮喘、暈動病、有機磷中毒等。
目前已經有關於氫溴酸樟柳鹼的成品藥物或複方製劑的應用，例如中國專利97120175公開了一種複方樟柳鹼注射液，通過樟柳鹼與普魯卡因、維生素b12、透明質酸等聯用，克服了單用對眼缺血療效不好、不良反應多的弊端，對眼缺血的有效率達到了90％以上。中國專利200410098938中公開了一種複方樟柳鹼口服液，使用起來較注射液更為方便，減輕了患者的痛苦，隨時隨地可自行服用，大大提高了患者的依從性。中國專利200510132127中公開了一種樟柳鹼和普魯卡因的複方製劑，能夠有效治療間質性肺炎和肺纖維化、腦梗塞、缺血性心腦血管疾病、缺血性眼病等疾病。中國專利200810006924中公開了氫溴酸樟柳鹼用於製備治療弱視的藥物中的用途，所製得的藥物可以是注射劑、滴眼劑，也可以是片劑、膠囊劑、口服液、滴丸等口服製劑。中國專利201210274372中公開了氫溴酸樟柳鹼用於治療抑鬱症藥物中的用途，其對於興奮缺乏、快感消失、興奮程度降低、體重增加量降低等抑鬱症狀具有很好的治療效果。但現有技術中，沒有記載樟柳鹼可以用於治療腎纖維化的文獻報導。
技術實現要素：
本發明所解決的技術問題是提供樟柳鹼的新用途，具體的是樟柳鹼在製備預防或治療腎纖維化的藥物中的應用。
本發明活性成分樟柳鹼優選採用氫溴酸樟柳鹼。其功效體現在氫溴酸樟柳鹼可以降低血清中scr、bun的水平，抑制腎組織中α-sma，tgf-β蛋白的表達，證實了氫溴酸樟柳鹼具有抗腎纖維化的作用。
應用時預防或治療腎纖維化的藥物中可以含有0.1-99.9wt％的樟柳鹼作為活性成分，也可以與其他藥物進行復配製成複方藥物；按照藥學常規方法，加入藥學上可接受的載體製備成適宜的藥物劑型，具體的可以製成口服製劑或者注射劑，通過口服、肌肉注射、靜脈輸入或腹腔注射等方式給藥。例如軟膠囊劑、片劑、凍乾粉劑或注射劑。
通過實驗證明，氫溴酸樟柳鹼具有預防或治療腎纖維化的作用，可通過抑制腎組織中肌成纖維細胞的增殖活化從而改善腎纖維化，為臨床預防、治療腎纖維化提供了一種新的選擇。
具體實施方式
以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，說明但不限制本發明。
實施例：氫溴酸樟柳鹼對腎纖維化模型大鼠的治療作用
一、實驗方案
1、材料和方法
1.1實驗動物：6～8周齡清潔級健康雄性sd大鼠40隻，購買自北京華阜康科技有限公司。實驗動物飼養於四川大學生物治療國家重點實驗室動物中心恆溫、恆溼與空氣全循環過濾環境中。
1.2材料：氫溴酸樟柳鹼(99％純)，購於中國藥品生物製品檢定所，兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白抗體、兔抗大鼠轉化生長因子-β抗體購自杭州華安生物。
1.3方法：
1.31動物模型的建立：大鼠以2％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉後取右側臥位固定，手術區域備皮，消毒。於左側肋腰點下方，脊柱旁左側作一縱行切口，分離輸尿管，5-0號絲線結紮輸尿管兩端，在兩結紮點中間剪斷輸尿管，逐層縫合製作uuo模型。假手術組僅開腹後左側游離輸尿管，不接扎和剪斷。
1.32實驗分組：將大鼠隨機分為假手術組(10隻)、uuo模型組(10隻)、uuo模型+氫溴酸樟柳鹼2.5mg/kg治療組(樟柳鹼低劑量組，10隻)、uuo模型+氫溴酸樟柳鹼5mg/kg治療組(樟柳鹼高劑量組，10隻)。於術後當日開始給藥，每天給藥一次。
1.33檢測項目：於術後第14天收集血標本，分離血清進行血肌酐(scr)和尿素氮(bun)檢測，處死動物，取手術側腎臟，1/3保存於4％多聚甲醛固定液中以備後續he、masson及免疫組織化學染色使用，其餘2/3平均分為10塊，在液氮中迅速冷凍後轉入-80℃低溫冰箱中保存，用於後續進行α-sma，tgf-β的免疫組化及westernblot檢測。
1.4數據處理：計量資料以表示，用spss22.0軟體統計分析。多樣本均數間比較用單因素方差分析(one-wayanova)，組間兩兩比較用lsd-t檢驗，方差不齊時使用dunnett，st3檢驗。
2、結果
2.1大鼠scr和bun的變化情況，見表1。
表1各組大鼠bun、scr水平(mmol/l、umol/l)
註：與假手術組比較：#p＜0.05；與模型組比較*p＜0.05
表1結果顯示：與假手術組相比，其餘各組大鼠血清中scr、bun水平均明顯升高(p＜0.05)；與模型組相比較，經氫溴酸樟柳鹼治療後血清中scr、bun水平均出現不同程度降低，以樟柳鹼高劑量組效果更為明顯(p＜0.05)。
2.2大鼠腎組織病理學觀察
①肉眼觀察：假手術組腎臟呈暗紅色，表面光滑，兩側腎臟對比無明顯差異，其餘各組腎臟體積明顯增大，顏色蒼白，皮質變薄。②光鏡檢測：假手術腎臟組織結構正常，間質內無炎細胞浸潤，masson染色僅腎小球和腎小管基底膜處可見少量的膠原藍染區。模型組腎小管上皮細胞萎縮，空泡樣變，管腔擴張明顯，部分管腔內可見蛋白管型，部分腎小管壞死，壞死區域可見纖維組織增生，腎間質大量炎細胞浸潤，masson染色可見大面積的膠原藍染區，腎間質內纖維組織增生較假手術組明顯增多。兩治療組病變較模型組有不同程度的改善，尤其以樟柳鹼高劑量組更為明顯，與模型組相比差異有統計學意義，見表2。
表2各組大鼠腎小管間質損傷指數、腎間質膠原相對面積評分(n＝10)
註：與假手術組比較：#p＜0.05、；與模型組比較*p＜0.05
2.3α-sma，tgf-β蛋白的表達
假手術組大鼠腎間質內幾乎不表達α-sma，其餘各組在腎間質及部分腎小管上皮細胞內可見不同程度的陽性表達；與模型組相比較，樟柳鹼高、低劑量組表達量明顯降低(p＜0.05)；樟柳鹼高劑量組與低劑量組相比差異無統計學意義(p＞0.05)，見表3。
在假手術組中tgf-β僅少量表達在腎小管、腎間質細胞的胞漿內；模型組腎組織中tgf-β的表達量明顯增加(p＜0.05)，主要以腎小管上皮細胞、腎間質區域為主。經樟柳鹼治療後tgf-β的表達量較模型組明顯降低(p＜0.05)，樟柳鹼高劑量與低劑量組相比差異無統計學意義(p＞0.05)，見表3。
表3各組大鼠腎組織α-sma，tgf-β蛋白的表達
註：與假手術組比較：#p＜0.05、；與模型組比較*p＜0.05
3結論
與模型組相比，經氫溴酸樟柳鹼治療後大鼠的scr、bun水平明顯將降低(p＜0.05)，腎間質纖維化程度明顯減輕(p＜0.05)，腎組織中α-sma、tgf-β的表達量明顯降低，提示氫溴酸樟柳鹼對uuo所致大鼠腎間質纖維化具有保護作用，其機制可能是通過抑制腎內tgf-β的表達，減少腎間質中固有成纖維細胞的增殖活化，從而改善腎間質纖維化。