夏枯草抗腫瘤有效部位的提取方法及其提取物在製備抗腫瘤藥物方面的應用的製作方法
2023-04-27 20:39:16 3
專利名稱:夏枯草抗腫瘤有效部位的提取方法及其提取物在製備抗腫瘤藥物方面的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種夏枯草抗腫瘤有效部位提取方法及其在抗腫瘤方面的作用。
技術背景
夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L的乾燥成熟果穗，主要產於河 南省確山縣等地，具有清熱解毒、散結消腫之功效，可用於治療瘰癘癭瘤、乳癰腫痛等病症。 夏枯草治療惡性淋巴瘤由來已久，許多偏方、驗方都把夏枯草作為治療惡性淋巴瘤的主藥。 本專利申請人根據多年應用以夏枯草為主藥的複方中藥製劑治療惡性淋巴瘤的臨床觀察， 發現其可使惡性淋巴瘤瘤體消退。現代藥理學研究證明，夏枯草煎劑在體外實驗中能誘導 SGC-7901癌細胞的凋亡，在體內實驗中對小鼠艾氏腹水瘤及肉瘤S180均有抑制作用。夏枯 草提取物對小鼠白血病P388細胞及人肺腺癌A549細胞具有細胞毒樣作用。經文獻檢索及 專利檢索尚沒有關於夏枯草有效提取部位抗惡性淋巴瘤的實驗研究報告。
以下是與本申請專利最接近的技術現狀。
(1)許多偏方、驗方應用夏枯草治療惡性淋巴瘤，均是簡單的水煮煎劑。例如李學 源等應用夏枯草、半枝蓮、昆布、海藻、烏骨藤等草藥用水將藥材浸沒、浸泡，按照常規的中 藥口服煎制方法加熱煎熬後過濾得濾液，通常將藥份煎熬2次，再將2次濾液進行混合勾 兌，口服製成治療癌症的藥物(申請號=02109997. 9授權公告號CN1169556C)
(2)武漢理工大學樓一層發明提出了一種治療高血壓的複方夏枯草膠囊及其製備 方法。該複方夏枯草膠囊以夏枯草、曼陀羅花、羅布麻、香蕉皮或者還有鉤藤、山楂、決明子、 菊花為原料，運用超臨界CO2萃取技術提取浸膏，經噴霧乾燥製成細粒，再用公知制膠囊技 術製成膠囊顆粒。本複方夏枯草膠囊含有效成分齊墩果酸>0.2mg/粒(0.33g)，還含金絲 桃甙及槲皮素，經毒性檢驗和臨床應用表明，未見明顯毒性反應，治療高血壓療效顯著(專 利號 ZL03118626. 2 授權公告號:CN1212854C)。
(3)江蘇康緣藥業股份有限公司肖偉等人發明涉及一種夏枯草提取物。所述提取 物的活性成分總酚酸的含量為60% -70%，迷迭香酸的含量為14% -21%。本發明夏枯草 提取物的酚酸部位具有抗炎、鎮痛作用，對類風溼性關節炎具有確切的治療作用，且其酚酸 部位具有增強免疫抑制作用(專利號ZL200410014142.X公告號CN1331488C)。本發明還 公開了該種方法與新用途。其夏枯草提取物的具體製備方法為①取夏枯草藥材，分別以藥 材4 12倍量的40% 85%乙醇回流提取2 4次，每次1 2. 5小時，濾過，合併醇提 液，回收乙醇至無醇味，濃縮至相對密度至1. 0 1. 15，靜置冷藏12 36小時，傾出上清 液，加醇至含醇量達60% 75 %，加入濃氨水使PH等於7-8，回收乙醇，濃縮液加5-15%的 HCL調PH為3-4，用乙酸乙酯萃取5-7次，每次用量為濃縮液的2-4倍，回收乙酸乙酯至密度 為1. 30-1. 40的稠膏，真空乾燥，粉碎即得。②第2種製備方法取夏枯草藥材，分別以藥材 4 12倍量的40% 85%乙醇回流提取2 4次，每次1 2. 5小時，濾過，水煎液濃縮至 密度至1. 0 1. 15，上大孔樹脂柱，用8-10倍柱體積水洗脫，水洗液棄去，再用12-14倍柱
3體積的50% -70%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇至密度為1. 30-1. 40的稠膏，真空乾燥， 粉碎即得。③第3種製備方法取夏枯草藥材，分別以藥材4 12倍量的40% 85%乙酸 乙酯回流提取2 4次，每次1 2. 5小時，濾過，回收乙酸乙酯液並濃縮至密度至1. 3 1. 4的稠膏，加藥材0. 5-1. 0倍量的0. 1 % -0. 5 %的NaOH溶解，再用10 % -20 %的HCL調 PH至3-4，加乙酸乙酯萃取5-7次，合併乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至密度為1. 30-1. 40 的稠膏，真空乾燥，粉碎即得。上述提取物的幹膏得率為1. 5% -3. 5% .
(4)楊孟君發明公開了一種納米複方夏枯草製劑藥物(中藥飲片、膠囊、注射劑 或膜劑)，它是以納米夏枯草、納米香附、納米甘草、納米僵蠶、納米白芍、納米當歸、納米陳 皮、納米桔梗、納米川芎、納米紅花、納米昆布、納米浙貝母、納米玄參、納米烏藥為原料，按 比例配製，製成新的藥物製劑，其顆粒細度達1200-1500目，粒徑為0. l-200nm，其中絕大部 分粒徑小於lOOnm，並具有新的物性。採用微波萃取、減壓濃縮、超音速射流技術噴霧乾燥 等步驟製成。該藥物生物利用度高，主治癭瘤瘰癧、結核作痛，治療效果顯著。(申請號 01100229. 8 公開號CN1363306)
現有的專利技術表明，夏枯草多是作為治療高血壓，抗炎、鎮痛作用提取製作的。
發明內容
本發明的目的是確定夏枯草的抗腫瘤有效部位，提供一種低毒高效的抗腫瘤新藥 的提取方法，以提高腫瘤的治癒率。
本發明採用的技術方案是一種夏枯草抗腫瘤有效部位的提取方法，取夏枯草花 穗，用85% 96%的乙醇浸泡於提取器內，加熱、回流、提取；將所得提取液濃縮至幹得浸 膏，用容積比為1 0.5 1.2的氯仿和水或乙酸乙酯和水對所得浸膏進行萃取，分別收集 有機相和水相，濃縮至幹；取有機相，用容積比為5 10 2 5 2 6的氯仿、甲醇、水 進行溶解，待靜置後，分出上層，將上層溶液濃縮至幹；取上層殘留物加流動相溶解，比例按 每毫克上層殘留物加0. 5 5毫升的流動相，進行反相柱層析，以甲醇-水流動相洗脫，收 集30% 80%甲醇洗脫液，將各個相的洗脫液濃縮至幹，即得抗腫瘤有效部位。
所述夏枯草花穗為乾燥花穗，用85% 96%的乙醇浸泡於多功能提取器內，24 36小時後加熱、回流3 6個小時得提取液；將提取液減壓濃縮至幹得浸膏，用容積比為 1 0.5 1.2的氯仿和水或乙酸乙酯和水對所得浸膏進行萃取，分別收集有機相和水相， 減壓濃縮至幹；取有機相，用容積比為5 10 2 5 2 6的氯仿、甲醇、水進行溶解， 待靜置3 6小時後，分出上層，將上層溶液減壓濃縮至幹；取上層殘留物加水或甲醇溶解， 比例按每毫克上層殘留物加0. 5 5毫升的水，用大孔吸附樹脂或ODS柱吸附，以甲醇-水 溶液洗脫，收集30% 80%甲醇洗脫液，將各個相的洗脫液減壓濃縮至幹，即得抗腫瘤有 效部位。
所述的夏枯草抗腫瘤有效部位在製備抗腫瘤藥物方面的應用。
國外將夏枯草作為自愈性和保健性產品，國內將夏枯草作為蔬菜食用，說明夏枯 草安全、毒性小。臨床觀察研究表明單用夏枯草治療淋巴瘤近期有效率為12%，夏枯草與 化療藥物合用治療復發性淋巴瘤有效率提高18%，患者生存期延長。採用本發明所述技術 方案確定的夏枯草有效部位在體外實驗中可明顯抑制人B淋巴瘤Raji細胞、人T淋巴瘤 Jurkat細胞、人白血病K562細胞和人乳腺癌435S細胞增殖；體內初步的實驗研究表明，夏枯草有效部位對接種荷T淋巴瘤EL-4細胞的小鼠具有明顯的抑瘤效應，並可明顯延長其生 存期。夏枯草有效部位抗腫瘤作用肯定，毒性相對較低，一旦開發成功，將產生良好的經濟 效益和社會效益。
夏枯草主要產於河南，作為一傳統中藥，具有藥理作用廣泛、療效顯著、無明顯毒 副作用、資源豐富、價廉易得、可長期使用等優點，因其抗腫瘤作用明確，若從中開發出低毒 高效的抗淋巴造血系統腫瘤的藥物，必將大大提高淋巴造血系統腫瘤的治療效果，為國家 節約大量的經濟資源，並可將河南省豐富的夏枯草資源推向國際市場，為其進一步的開發 利用提供廣闊的空間。
具體實施方式
實施例1
一、提取步驟
a、河南確山縣採集的6月底7月初夏枯草花穗，用95%的乙醇浸泡於多功能提取 器內，30小時後加熱、回流5個小時得提取液，減壓濃縮提取液得浸膏，將所得浸膏一部分 進行體外腫瘤細胞抑制率實驗，另一部分進行下步提取。
b、將提取液減壓濃縮至幹得浸膏，用1 1的乙酸乙酯和水對所得浸膏進行萃取， 分別收集有機相和水相，減壓濃縮至幹，進行體外腫瘤細胞抑制率實驗。
C、根據體外腫瘤細胞抑制率實驗結果，取有機相，用容積比為8 5 3的氯仿、 甲醇、水進行溶解，待靜置5小時後，分別收集上、下層液，減壓濃縮至幹，進行體外腫瘤細 胞抑制率實驗。
d、根據體外腫瘤細胞實驗結果，取上層殘留物，按1 3比例(重量mg:容積ml) 加水溶解，ODS柱吸附後，用60%甲醇洗脫，將洗脫液減壓濃縮至幹，即得抗腫瘤有效部位。
e、所述的體外檢測腫瘤細胞抑制率實驗採用常規的MTT法。
f、最終所得的有效部位進行體內外抗腫瘤實驗。
二、夏枯草有效部位體外抗腫瘤實驗結果如下
從上表體外實驗結果可以看出
1.夏枯草有效部位可明顯抑制人B淋巴瘤Raji細胞、人T淋巴瘤Jurkat細胞、人 白血病K562細胞和人乳腺癌435S細胞增殖。
2.夏枯草有效部位對人B淋巴瘤Raji細胞、人T淋巴瘤Jurkat細胞、人白血病 K562細胞和人乳腺癌435S細胞的抑制作用呈明顯的劑量依賴關係。
三、夏枯草有效部位體內初步實驗表明
1.夏枯草有效部位對接種荷T淋巴瘤EL-4細胞的C57小鼠具有明顯的抑瘤效應。 夏枯草有效部位高劑量組(500mg/kg/d)、中劑量組(300mg/kg/d)、低劑量組(100mg/kg/d) 和環磷醯胺組(20mg/kg/d)抑瘤率分別為39. 54%,65. 26%,22. 30%和89. 39%。與陰性 對照組平均瘤體積相比，夏枯草中劑量組和高劑量組差異有統計學意義(P < 0. 05)。
2.夏枯草有效部位高劑量組(500mg/kg/d)、中劑量組(300mg/kg/d)、低劑量組 (100mg/kg/d)與陰性對照組相比可明顯延長接種荷T淋巴瘤EL-4細胞的C57小鼠的生存 期。
實施例2
一、提取步驟
a、河南確山縣採集的6月底7月初夏枯草花穗，用85%的乙醇浸泡於多功能提取 器內，24小時後加熱、回流3個小時得提取液，減壓濃縮提取液得浸膏，將所得浸膏一部分進行體外腫瘤細胞抑制率實驗，另一部分進行下步提取。
b、將提取液減壓濃縮至幹得浸膏，用1 0.5的氯仿和水對所得浸膏進行萃取，分 別收集有機相和水相，減壓濃縮至幹，進行體外腫瘤細胞抑制率實驗。
C、根據體外腫瘤細胞抑制率實驗結果，取有機相，用容積比為5 2 2的氯仿、 甲醇、水進行溶解，待靜置3小時後，分別收集上、下層液，減壓濃縮至幹，進行體外腫瘤細 胞抑制率實驗。
d、根據體外腫瘤細胞實驗結果，取上層殘留物，按1 0. 5比例(重量mg 容積ml) 加水溶解，大孔吸附樹脂柱吸附後，用30 %甲醇洗脫，將洗脫液減壓濃縮至幹，即得抗腫瘤 有效部位。
e、所述的體外檢測腫瘤細胞抑制率實驗採用常規的MTT法。
f、最終所得的夏枯草有效部位進行體內外抗腫瘤實驗。
二、夏枯草有效部位體外抗腫瘤實驗結果如下
從上表體外實驗結果可以看出
1.夏枯草有效部位可明顯抑制人B淋巴瘤Raji細胞、人T淋巴瘤Jurkat細胞和 人白血病K562細胞增殖。
2.夏枯草有效部位對人B淋巴瘤Raji細胞、人T淋巴瘤Jurkat細胞和人白血病 K562細胞的抑制作用呈明顯的劑量依賴關係。
三、夏枯草有效部位體內初步實驗表明
1.夏枯草有效部位對接種荷T淋巴瘤EL-4細胞的BALB/C小鼠具有明顯的抑瘤效 應。夏枯草有效部位高劑量組(400mg/kg/d)、中劑量組(200mg/kg/d)、低劑量組(IOOmg/ kg/d)和環磷醯胺組(30mg/kg/d)抑瘤率分別為 28. 44%,67. 75%,22. 70%和 68. 90%。與 陰性對照組平均瘤體積相比，夏枯草中劑量組和高劑量組差異有統計學意義(P < 0. 05)。
2.夏枯草有效部位高劑量組(400mg/kg/d)、中劑量組(200mg/kg/d)、低劑量組 (100mg/kg/d)與陰性對照組相比可明顯延長接種荷T淋巴瘤EL-4細胞的BALB/C小鼠的生 存期。
實施例3
一、提取步驟
a、河南確山縣採集的6月底7月初夏枯草花穗，用96%的乙醇浸泡於多功能提取 器內，36小時後加熱、回流6個小時得提取液，減壓濃縮提取液得浸膏，將所得浸膏一部分 進行體外腫瘤細胞抑制率實驗，另一部分進行下步提取。
b、將提取液減壓濃縮至幹得浸膏，用1 1.2的乙酸乙酯和水對所得浸膏進行萃取，分別收集有機相和水相，減壓濃縮至幹，進行體外腫瘤細胞抑制率實驗。
C、根據體外腫瘤細胞抑制率實驗結果，取有機相，用容積比為10 5 6的氯仿、 甲醇、水進行溶解，待靜置6小時後，分別收集上、下層液，減壓濃縮至幹，進行體外腫瘤細 胞抑制率實驗。
d、根據體外腫瘤細胞實驗結果，取上層殘留物，按1 5比例(重量mg:容積ml) 加水溶解，ODS柱吸附後，用80%甲醇洗脫，將洗脫液減壓濃縮至幹，即得抗腫瘤有效部位。
e、所述的體外檢測腫瘤細胞抑制率實驗採用常規的MTT法。
f、最終所得的夏枯草有效部位進行體內外抗腫瘤實驗。
二、夏枯草有效部位體外抗腫瘤實驗結果如下
取，分別收集有機相和水相，減壓濃縮至幹，進行體外腫瘤細胞抑制率實驗。
C、根據體外腫瘤細胞抑制率實驗結果，取有機相，用容積比為7 4 5的氯仿、 甲醇、水進行溶解，待靜置4小時後，分別收集上、下層液，減壓濃縮至幹，進行體外腫瘤細 胞抑制率實驗。
d、根據體外腫瘤細胞實驗結果，取上層殘留物，按1 2比例(重量mg 容積ml) 加甲醇溶解，ODS柱吸附後，用50%甲醇洗脫，將洗脫液減壓濃縮至幹，即得抗腫瘤有效部 位。
e、所述的體外檢測腫瘤細胞抑制率實驗採用常規的MTT法。
f、最終所得的有效部位進行體內外抗腫瘤實驗。
二、夏枯草有效部位體外抗腫瘤實驗結果如下
從上表體外實驗結果可以看出
1.夏枯草有效部位可明顯抑制人B淋巴瘤Raji細胞、人T淋巴瘤Jurkat細胞、人 白血病K562細胞和人乳腺癌231細胞增殖。
2.夏枯草有效部位對人B淋巴瘤Raji細胞、人T淋巴瘤Jurkat細胞、人白血病 K562細胞和人乳腺癌231細胞的抑制作用呈明顯的劑量依賴關係。
三、夏枯草有效部位體內初步實驗表明
1.夏枯草有效部位對接種荷T淋巴瘤EL-4細胞的C57小鼠具有明顯的抑瘤效應。 夏枯草有效部位高劑量組(500mg/kg/d)、中劑量組(300mg/kg/d)、低劑量組(100mg/kg/d) 和環磷醯胺組(20mg/kg/d)抑瘤率分別為34. 65%,60. 96%,19. 65%和83. 86%。與陰性 對照組平均瘤體積相比，夏枯草中劑量組和高劑量組差異有統計學意義(P < 0. 05)。
2.夏枯草有效部位高劑量組(500mg/kg/d)、中劑量組(300mg/kg/d)、低劑量組 (100mg/kg/d)與陰性對照組相比可明顯延長接種荷T淋巴瘤EL-4細胞的C57小鼠的生存 期。
13
權利要求
一種夏枯草抗腫瘤有效部位的提取方法，其特徵是取夏枯草花穗，用85％～96％的乙醇浸泡於提取器內，加熱、回流、提取；將所得提取液濃縮至幹得浸膏，用容積比為1∶0.5～1.2的氯仿和水或乙酸乙酯和水對所得浸膏進行萃取，分別收集有機相和水相，濃縮至幹；取有機相，用容積比為5～10∶2～5∶2～6的氯仿、甲醇、水進行溶解，待靜置後，分出上層，將上層溶液濃縮至幹；取上層殘留物加流動相溶解，比例按每毫克上層殘留物加0.5～5毫升的流動相，進行ODS反相柱層析，以甲醇-水溶液洗脫，收集30％～80％甲醇洗脫液，將各部分洗脫液濃縮至幹，即得抗腫瘤有效部位。
2.如權利要求
1所述的夏枯草抗腫瘤有效部位的提取方法，其特徵是所述夏枯草花穗 為乾燥花穗，用85% 96%的乙醇浸泡於多功能提取器內，24 36小時後加熱、回流3 6個小時得提取液；將提取液減壓濃縮至幹得浸膏，用容積比為1 0.5 1.2的氯仿和水 或乙酸乙酯和水對所得浸膏進行萃取，分別收集有機相和水相，減壓濃縮至幹；取有機相， 用容積比為5 10 2 5 2 6的氯仿、甲醇、水進行溶解，待靜置3 6小時後，分 出上層，將上層溶液減壓濃縮至幹；取上層殘留物加水或甲醇溶解，比例按每毫克上層殘留 物加0. 5 5毫升的水或2毫升的甲醇，用ODS柱吸附，以甲醇-水溶液洗脫，收集30% 80%甲醇洗脫液，將各部分洗脫液減壓濃縮至幹，即得抗腫瘤有效部位。
3.根據權利要求
1或2所述的夏枯草抗腫瘤有效部位在製備抗腫瘤藥物方面的應用。
專利摘要
夏枯草抗腫瘤有效部位的提取方法，取夏枯草花穗，用乙醇浸泡於提取器內，加熱、回流、提取；將所得提取液濃縮至幹得浸膏，用氯仿和水或乙酸乙酯和水對所得浸膏進行萃取，分別收集有機相和水相，濃縮至幹；取有機相，用氯仿、甲醇、水進行溶解，待靜置後，分出上層，將上層溶液濃縮至幹；取上層殘留物加流動相溶解，進行反相柱層析，洗脫，收集30％～80％甲醇洗脫液，將各個相的洗脫液濃縮至幹，即得抗腫瘤有效部位。採用本發明方案確定的夏枯草有效部位體外實驗可明顯抑制Raji細胞、Jurkat細胞、K562細胞和435S細胞增殖；體內實驗對荷T淋巴瘤EL-4細胞小鼠具有抑瘤效應，並可延長其生存期；抗腫瘤作用肯定，毒性低。
文檔編號A61K133/00GKCN101461842 B發布類型授權 專利申請號CN 200710300027
公開日2010年11月24日 申請日期2007年12月21日
發明者劉宏民, 張明智 申請人:張明智;劉宏民導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (3),