蛋白質作為破乳劑的用途的製作方法

2023-05-04 16:09:06 2

專利名稱：：蛋白質作為破乳劑的用途的製作方法蛋白質作為破乳劑的用途發明領域本發明涉及至少一種疏7K蛋白或者至少一種疏7K蛋白衍生物的用途，用於改進包含至少兩種斜目的組合物的相分離；涉及分離包含至少兩種斜目的組合物中至少兩種'^目的方法；也涉及包括至少一種^^物和至少一種疏7jc蛋白或其衍生物的製劑，所述4^^選自燃料、可燃物、原油、7K溶^y油溶f生聚絲溶液。技術背景疏水蛋白是絲狀真菌如"fit裂褶菌(5^fe印M/"wowi附"朋)所特有的大約100至150個M酸的小蛋白質。通常具有八個半^酸單元。疏水蛋白顯示出對界面的^親和力，因jtbii合^^4面，其通過形成兩親性膜以改變界面的'J"錄。例如，用疏水蛋白包被鐵IU^(Teflon)可以獲得親水表面。疏水蛋白可以從天然源中分離。製備疏水蛋白及期汙生物的方法也是已知的。例如，DE102005007480.4^Hf了製備疏7JC蛋白及^f;f生物的方法。5賄技^旨出疏7K蛋白在多種應用中的用途。W096/41882指出疏7jC蛋白可以作為享l/f匕劑、增稠劑或者表面活性劑，用以賦予疏水表面親水l"生、提高親7K物質的防水性、製備水包油乳劑或油包7jC乳劑。該文件^旨出疏水蛋白的藥物用途，例如可以製備骨劑或霜劑，以及化妝品方面的用途，例如狄防護或製備、狄劑或狄劑。除》力卜，W096/41882要求保護的組合物，尤其是藥物用途的組^包含疏7JC蛋白。EP-A1252516^^f了婦0至80'C條陣下利用含疏水蛋白的溶液包被窗、隱形眼鏡、生物傳感器、醫療設備、實施測定或貯自容器、船體貨艙、固詢^^立或框架或轎車車體。WO03/53383公開了疏7jC蛋白在化妝品應用中處理角蛋白材料的用途。WO03/10331公開了疏水蛋白^J(L出表面活性的H貧。該文件-^Hf了疏水蛋白包被的傳感器(如測量電極)，該傳感器非^H^接有^f^質如電活性物質、WO2004/000880^/^開了疏水蛋白或疏水蛋白樣物質包被的表面，其進一步公開了可以添加疏7JC蛋白穩定水包油乳劑或油包7ML劑。WO01/74864涉及J^7JC蛋白才條白質，也/>開了這些蛋白可以用刊l、定棘劑和乳劑。原則上，利用蛋白質進^f封目分離是已知的。GB195，876^開了利用膠^M皮壞油包7ML劑的方法。所述的膠體實例為蛋白質或多糖，蛋白質如明膠、峰白和白蛋白，多紛口阿拉伯膠或黃蓍膠。JP-A11-169177公開了具有脂肪酶活性的蛋白質^皮壞乳劑中的用途。WO06/60916公開了由至少一種7K溶1"生蛋白質、至少一種水溶性多#至少一種水溶I"生聚合物如聚環氧乙烷組成的無表面活性劑的混合物，其不同的應用也包括反乳化原油。以上引用的文件中無一公開iti^水蛋白斜目分離中的用途。
發明內容利用蛋白質的優點在於其是自然存在並且可以生物降解的物質，所以不會導致4^f可持久的環嫂汙染。對於很多;^J^莫的工業應用，例如當分離原油7KIL劑時，儘可能夾的進^4目分離是很重要的。本發明的目的是提^-"種利用蛋白質進^^目分離的iJ^法。才娥本發明，通過利用至少一種疏水蛋白來說包含至少兩種^目的組楊的相分離來實現該目的。在這方面，##本發明，原則上可以使用任意量的疏水蛋白，只要確保改進包含至少兩種^目的組^稱的相分離。在本發明中，"改淑目分離"可以理解為當混合物中添加某物質時比沒有添加該物質的同一混M^A更快的兩種'^目的分離，或者指只有添加了該物質才能進行兩種斜目的分離。在本發明中，疏水蛋白也可以理解為^^亍生物或者麟的疏7JC蛋白。開，如DE102005007480.4。在這方面，用於所述製備方法的合適的宿主微生物(生產微生物)可以為原核生物(包括古生菌)或真核生物，尤其為包括嗜鹽菌(/^/o6"cfeW")和曱烷球菌(/Me幼fl"0acc/)的細菌、真菌、昆蟲細胞、植物細胞和哺乳動物細胞，更優選大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(5"7/船艦gfi^m.w附)、米麴黴(Ape/"^/^o/jzefl)、構巢麴黴(zlspw7/ws附V/"/"ws1)、黑麴黴(爿印e/^7/"s)、巴斯德畢赤酵母(屍iV^/"/;"sto/^)、假單胞菌屬物種(i^em/owowos印")、乳酸桿菌(/actokd///)、多形漢遜酵母(^awseww/flf/w/y/Mo/^/f")、裡氏木黴(7>/c/rofife/7Mfl)、SF9(或相關細胞)等。的核酸序列的表達構建體以及包括至少一種所述表達構建體的載體的用途。所述的構建體優選包含特定編碼序列的5，上遊啟動子和3，下遊終止子，適用的情況下也包括其他常規調控元件，其中的每一個與編碼序列有效連接。根據本發明，"有效連接，，指按啟動子、編碼序列、終止子以及適用情況下的附加調控元件的有序排列，從而使每一調控元件能夠實現其表達編碼序列的預期功能。有效連接序列的實例為尋靶序列、增強子、聚腺苷化信號等。其他調控元件包括可選擇標記、擴增信號、複製起點等。合適的調控序列的實例描述於Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中。除了這些調控序列，在實際的結構基因的上遊可能仍然存在對這些序列的天然調控，且適用的情況下可以對其進行遺傳開了，尤其在EP-A0307815中。這些性質的添加劑主要用來防護閥座磨損，並且如WO87/01126中描述的，最好與常規燃料去汙劑如聚(異)丁烯胺或聚醚胺一起使用。包括磺酸基或其鹼金屬/鹼土金屬鹽(e)的添加劑優選烷基磺基琥珀酸酯的鹼金屬或鹼土金屬鹽，尤其正如EP-AO639632描述的。該性質的添加劑主要用來防護閥座磨損，優選與常規燃料去汙劑如聚(異)丁烯胺或聚醚胺一起使用。包括聚C2-C4氧化烯基團(f)的添加劑優選聚醚或聚醚胺，所述聚醚或聚醚胺可通過C2-C60烷醇、C6-C30烷二醇、單/雙-C2-C30烷胺、C1-C30烷基環己醇或Cl-C30-烷基酚與每羥基或氨基l-30mol的環氧乙烷和/或環氧丙烷和/或環氧丁烷反應獲得，對於聚醚胺，隨後與氨、一元胺或多元胺進行還原氨化。尤其在EP-A0310875，EP-A0356725，EP-A0700985和US4，877，416中已經描述了該性質的產物。對於聚醚，這些產物也達到浮選油質量的要求。在這點上一般的例子是十三烷醇或異十三烷醇丁氧基化物(isotridecanolbutoxylates)、異壬基酚丁氧基化物(isononylphenolbutoxylates)及聚異丁烯醇丁氧基化物(polyisobutenolbutoxylates)和丙氧基化物(propoxylates)以及它們與氨反應的相應產物。包括羧酸酯基(g)的添加劑優選具有長鏈烷醇或多元醇的單-、雙-或三羧酸酯類，尤其優選在100'C時，最小粘度為2mmVs，尤其正如DE-A3838918描述的。脂肪酸或芳香酸可以用作單-、雙-或三羧酸，而合適的酯醇(esteralcohol)或多元醇尤其為長鏈如6-24C原子的酯醇或多元醇。異辛醇、異壬醇、異癸醇、異十三烷醇的乙二酸酯、鄰苯二甲酸酯、異鄰苯二甲酸酯、對苯二酸酯和(偏)苯三酸酯都是酯類的一般代表。該性質的產物也達到浮選油質量的要求。包括具有羥基和/或氨基和/或醯氨基和/或亞氨基的琥珀酐衍生基團(h)的添加劑優選聚異丁烯琥珀酐相應的衍生物，所述的衍生物可以利用Mn=300-5000的常規或高活性的聚異丁烯與馬來酐通過加熱或氯化聚異丁烯反應獲得。在這方面，尤其關注的是脂肪族聚胺(例如乙二胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺或四亞乙基五胺)衍生物。該性質的汽油添加劑尤其在US4，849，572中已經描述了。包括由取代酚與醛和一元胺或多元胺通過曼尼希反應產生的基團(i)的添加劑優選聚異丁烯取代的酚類與曱醛和一元胺或多元胺(例如乙二胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺或四亞乙基五胺)反應的產物。所述的聚異丁烯取代的酚類可從Mn=300-5000的常規或高活性的聚異丁烯衍生獲得。該性質的"聚異丁烯曼尼希鹼"尤其在EP-A0831141中已經描述了。為了更加明確地定義所列出的各個汽油添加劑，上述公開內容的現有技術文件在此明確引用作為參考。在這方面，用於給定應用的所述的添加劑的使用量對於本領域技術人員是顯而易見的。除此之外，根據本發明的製劑也可以結合其他常規的組分和添加劑。沒有任何顯著去汙效果的浮選油在此作為實例提及。合適的礦物浮選油是在礦物油加工過程生成的餾分，例如光亮油、或具有SN500-2000型粘度的基礎油，以及芳香爛、鏈烷烴和烷氧基烷醇(alkoxyalkanol)。精煉礦物油的過程中生成一種稱為"加氫裂化油"的餾分同樣適合本發明，所述"加氫裂化油"是在約360-500'C的範圍內沸騰，從在高壓條件下已經催化加氫、異構化並脫蠟的天然礦物油中獲得的真空蒸餾切取餾分。上述礦物浮選油的混合物也是合適的。可以用於本發明的合成浮選油的實施選自聚烯烴(聚(x烯烴或聚內烯烴)、(聚)酯、(聚)烷氧基化物、聚醚、脂肪族聚醚胺、烷基酚起始的聚醚、烷基酚起始的聚醚胺以及長鏈烯醇羧酸酯。合適的聚烯烴的實例為Mn-400-1800，尤其是以聚丁烯或聚異丁烯為基礎的烯烴聚合物(氬化的或非氫化的)。合適的聚醚或聚醚胺的實例為，優選包括聚C2-C4氧化烯基團的化合物，所述聚醚或聚醚胺可通過C2-C60烷醇、C6-C30烷二醇、單/雙-C2-C30烷基胺、Cl-C30烷基環己醇或Cl-C30烷基酚與每羥基或氨基l-30mol的環氧乙烷和/或環氧丙烷和/或環氧丁烷反應獲得，對於聚醚胺，隨後與氨、一元胺或多元胺進行還原氬基化。尤其在EP-A0310875，EP-A0356725，EP-AO700985和US4，877，416中已經描述了該性質的產物。可以利用的聚醚胺的實例為聚C2-C6氧化烯胺(poly-C2-C6-alkyleneoxideamine)或其功能衍生物。在這點上一般的例子是十三烷醇或異十三烷醇丁氧基化物、異壬基酚丁氧基化物及聚異丁烯丁氧基化物和丙氧基化物以及它們與M應的相應產物。長鏈烯醇的羧酸酯的實例為，優選具有長鏈烷醇或多元醇的單-、雙-或三羧酸酯類，尤其正如DE-A3838918描述的。脂肪酸或芳香酸可以用作單-、雙-或三羧酸，而合適的酯醇或多元醇尤其為長鏈如6-24C原子的酯醇或多元醇。異辛醇、異壬醇、異癸醇、異十三烷醇的乙二酸酯、鄰苯二甲酸酯、異鄰苯二甲酸酯、對苯二酸酯和(偏)苯三酸酯都是酯類的一般代表，例如雙-(正-或異-十三烷基)鄰苯二甲酸酯。其他合適的浮選油系統的實例已在DE-A3826608、DE-A4142241、DE-A4309074，EP-AO452328和EP-A0548617中描述，在此明確引用作為參考。尤其適合的合成浮選油的實例是具有約5-35個(例如約5-30個)C3-C6氧化烯單體的以醇起始的聚醚，所述氧化烯單體選自例如環氧丙烷、正環氧丁烷和異環氧丁烷單體，或其混合物。合適的起始醇的非限制實例是，具有長鏈烷基尤其是直鏈或支鏈C6-C18烷基的長鏈烷醇或長鏈烷基取代酚。十三烷醇及壬基酚作為優選的實施例提及。更多合適的合成的浮選油是烷氧基化的烷基酚，正如DE-A10102913.6所描述的那樣。在這方面，用於給定應用的所述浮選油的使用量對於本領域技術人員是顯而易見的。其他常規的添加劑為緩蝕劑，例如基於有機羧酸的銨鹽，所述鹽趨向形成膜，或者基於雜環芳香族化合物用於非鐵金屬腐蝕保護；抗氧化劑或穩定劑，例如基於胺(如對苯二胺、二環己基胺)或其衍生物，或基於酚(例如2，4-二-叔丁基苯酚或3，5-二-叔丁基-4-羥苯基丙酸)；其他常規破乳劑；抗靜電劑；茂金屬(例如二茂鐵)；甲基環戊二烯三羰基錳(methylcyclopentadienylmanganesetricarbonyl);潤滑添力口劑(力口某些脂肪酸、烯基琥珀酯、雙(羥烷基)脂肪胺、羥乙醯胺或蓖麻油)；以及染料(標記)。適用的情況下，為了降低燃料的pH值也添加胺。通常，添加到燃料中的所述含極性基團(a)-(i)的去汙添加劑的量為以重量計10-5000ppm,尤其為以重量計50-1000ppm。如果需要的話，為了該目的，所提及的其他成分和添加劑的添加量是常規的。適合本發明的燃料和可燃物是本領域技術人員已知的任意燃料和可燃物，例j口汽油，正j口例如Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,第5版1990，巻A16,pp.719ff所描述的。根據本發明，柴油機燃料、煤油和噴氣機燃料也是合適的燃料。特別的，含有以體積計最多60%(例如最多42。/。)的芳香族化合物以及以重量計最多2000ppm(例如最多150ppm)的石克的汽油是合適的。汽油中芳香族化合物的含量為，例如，以體積計在10-50°/。範圍內，例如30-42%，優選以體積計32-40%。汽油中硫的含量為，例如，以重量計在2-500ppm範圍內，例如5-150ppm，優選以重量計IO-IOOppm。此外，合適的汽油可以是，例如，具有以體積計高達50%的烯烴，例如以體積計6-21%，優選以體積計7-18%;具有以體積計高達5%的苯，例如以體積計0.5-1.0%，優選以體積計0.6-0.9%;和/或具有以重量計高達25%的氧，例如，以重量計高達10%或以重量計1.0-2.7%，優選以重量計1.2-2.0%。優選利用實例提及的汽油同時具有的芳香族化合物的含量為以體積計最多38%、烯烴的含量為以體積計最多21%、硫的含量為以重量計最多SO卯m、苯的含量為以體積計最多1.0%以及氧的含量以重量計1.0-2.7°/0。汽油中醇和醚的含量在很大範圍內變動。對於甲醇，以體積計通常的最大含量的實例為15%、對於乙醇，以體積計為65%、對於異丙醇，以體積計為20%、對於4又丁醇，以體積計為15%、對於異丁醇，以體積計為20%以及對於具有5個或更多C原子的醚，以體積計為30%。適合本發明的汽油的Sommer蒸汽壓通常為最多70kPa，尤其為60kPa(每種情況均為37。C)。通常，汽油的RON為75至105。相應的MON的常規範圍為65至95。利用常規方法(DINEN228)確定所述標準。以下實施例對本發明進行更詳細的說明。實施例實施例l克隆vaad-His一yaaE-HiSf的初步工作利用寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)實施聚合酶鏈式反應。所用的模板DNA為細菌枯草桿菌的基因組DNA。得到的PCR片段包括枯草桿菌yaaD/yaaE基因的編碼序列，其末端分別為NcoI及BglII的限制性切割位點。純化並利用限制性內切酶NcoI及Bg瓜切割PCR片段。該DNA片段用作插入物並克隆入QiagenpQE60載體中，所述載體事先已經利用限制性內切酶Neol及Bgin線性化。由此得到載體pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5，可用於表達分別由YAAD::HIS6和YAAE::HIS6組成的蛋白質。Hal570:gcgegcccatggctcaaacaggtactgaHal571:gcagatctccagccgcgttcttgcatacHal572:ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc實施例2yaad疏水蛋白DewA-HiSf的克隆利用寡核苷酸KaM416和KaM417實施聚合酶鏈式反應。所用的模板DNA為黴菌構巢麴黴的基因組DNA。得到的PCR片段包括疏水蛋白基因dewA的編碼序列和編碼N-末端Xa因子蛋白酶裂解位點的序列。純化並用限制性核酸內切酶BamHI切割PCR片段。該DNA片段用作插入物並克隆入事先已經通過限制性核酸內切酶BamHI線性化的pQE60YAAD^2載體中。由此得到的載體#508，可用於表達包含YAAD::Xa::dewA::HIS6的融合蛋白質。KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC實施例3vaad-疏水蛋白RodA-HiSf的克隆利用寡核苷酸KaM434和KaM435克隆質淨立#513，方法與克隆質淨立#508類似。KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG實施例4yaad-疏水蛋白BASF1-His^的克隆利用寡核苷酸KaM417和KaM418克隆質粒#507，方法與克隆質粒#508類似。所用的模板DNA為人工合成的DNA序列，即疏水蛋白BASF1(見附錄，SEQIDNO.11和12)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實施例5yaad-疏水蛋白BASF2-Hise的克隆利用寡核苷酸KaM417和KaM418克隆質粒#506，方法與克隆質粒#508類似。所用的模板DNA為人工合成的DNA序列，即疏水蛋白BASF2(見附錄，SEQIDNO.13和14)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實施例6vaad-疏水蛋白SC3-His^的克隆利用寡核苷酸KaM464和KaM465克隆質津立#526,方法與克隆質粒#508類似。所用的模板DNA為普通裂褶菌cDNA(見附錄，SEQIDNO.9和10)。KaM464:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT實施例7重組大腸桿菌菌抹vaad-疏水蛋白DewA-His卩的發酵於15mlGrdner管中將表達yaad-疏水蛋白DewA-His6的大腸桿菌菌林接種於3mlLB液體培養基。37。C條件下在200rpm的振蕩器中溫育8小時。在每例中，用1ml預培養物接種2個包含250mlLB培養基(+100ng/ml氨苄青黴素)的ll具擋板的Erlenmeyer燒瓶，並在37。C於180rpm的振蕩器中溫育9小時。在20l的發酵罐中用0.5l預培養物(相對水測得OD6。。nm1:10)接種於13.5lLB培養基(+100ng/ml氨節青黴素)。在006111~3.5時加入140ml的100mMIPTG。3小時後，將發酵器冷卻至10。C，並通過離心移除發酵液。細胞沉澱用於進一步純化。實施例8重組疏水蛋白融合蛋白質的純化(具有C末端His6標籤的疏水蛋白融合蛋白質的純化)將IOOg細胞沉澱(100-500mg疏水蛋白)溶於50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)中，至總體積為200ml並重懸所迷細胞。用UltraturraxT25型(JankeandKunkel;IKA-Labortechnik)處理懸浮物10分鐘，然後與500單位的benzonase核酸酶(Merck，Darmstadt;訂貨號1.01697.0001)於室溫溫育l小時，以降解核酸。在細胞石皮碎前，利用玻璃管(Cartridge)(Pl)進行過濾。為破碎細胞並剪切殘留的基因組DNA,進行兩次1500bar勻漿(MicrofluidizerM-110EH;MicrofluidicsCorp.)。離心勻漿物(SorvallRC-5B，GSA轉子，250ml離心杯，60分鐘，4。C，12000rpm，23000g),將上清液置於冰上並將沉澱重懸於IOOml磷酸鈉緩衝液(pH7.5)。重複離心及重懸步驟三次，其中第三次的磷酸鈉緩衝液中包含l。/oSDS。重懸後，將混合物攪拌l小時，然後進行最終離心(SorvallRC-5B，GSA轉子，250ml離心杯，60分鐘，4°C,12000rpm，23000g)。SDS-PAGE分析表明，在最終離心後，疏水蛋白存在於上清液中(圖l)。該實驗顯示，疏水蛋白很可能以包涵體的形式存在於相應大腸桿菌的細胞中。將50ml含有疏水蛋白的上清液充填50ml鎳-瓊脂糖凝膠高效17-5268-02柱(Amersham),其中該柱用50mMTris-CI緩衝液(pH8.0)平衡。利用50mMTris-Cl緩沖液(pH8.0)洗柱，然後利用含有200mM咪唑的50mMTris-Cl緩衝液(pH8.0)洗脫疏水蛋白。為去除咪唑，用50mMTris-Cl緩衝液(pH8.0)透析溶液。圖l顯示了所製備的疏水蛋白的純化泳道A:充填於鎳-瓊脂糖凝膠柱的物質(l:10稀釋)泳道B:滲漏=洗滌步驟洗脫液泳道C-E:OD280峰值處的洗脫級分(WP1，WP2，WP3)泳道F:顯示所應用的分子量標準參照物圖l的疏水蛋白分子量約為53kD。某些較小的條帶代表疏水蛋白的降解產物。實施例9應用測試；通過改變水滴在玻璃上的接觸角對疏水蛋白進行表徵底物玻璃(窗玻璃，StiddeutscheGlas，Mannheim，Germany):^用如實施例8所述純化的疏水蛋白。-溶液中疏7jC蛋白的濃度100fig/ml，該溶液還另外包含50mM醋酸鈉緩衝液和0.1。/。聚氧乙烯(20)山梨聚糖單月桂酸酯(Tween20)，溶液的pH值為4-將玻璃板浸入該溶液過夜(溫度80。C)-此後，從該溶液中取出包被有疏水蛋白的玻璃板，並在蒸餾水中洗滌-此後，溫育，10分鐘/80。C/1%SDS蒸餾水溶液-蒸餾水洗滌-此後，在80。C條件下溫育10分鐘/1%SDS蒸餾水溶液-再次用蒸餾水洗滌風乾樣品，室溫確定已包被玻璃表面上5pl水滴的接觸角(以度表示)。在DataphysicsContactAngleSystemOCA15+，軟體SCA20.2.0(2002年ll月)儀器確定接觸角測量值。根據廠商的說明書進行測量。未處理玻璃的接觸角為30±5°;以實施例8的疏水蛋白(yaad-dewA-his6)包浮皮的玻璃板的接觸角為75±5。。==>接觸角的增加45。實施例10利用疏水蛋白濃縮物(V""^Xfl-dgH^-ff^)作為燃料的添加劑實驗原理現代燃料通常包含許多不同的添加劑(定義為添加劑包)。如果在燃料生產或銷售過程中接觸到水，這些添加劑能夠顯示出乳化作用，並導致不希望的燃料-水乳劑的形成。為了避免該結果，通常向燃料中添加破乳劑。利用實施例8(SEQIDNO.19和20)所描述的疏水蛋白濃縮物進4亍石皮乳化實驗。所述疏水蛋白濃縮物以乙醇稀釋並添加到市場上可以購買到的Eurosuper燃料(與EN228—致)中，所述燃料已含特效添加劑包A725mg/kg。該添加劑包主要包含聚異丁烯胺KerocomPIBA、浮選油混合物、溶劑、緩蝕劑及摩擦改性劑。製備含O.Ol、0.03、0.05、0.07、0.14和0.28mg疏水蛋白/kg的燃料樣品。只添加A，不含疏水蛋白的燃料作為參比(IO-Vl)。在另一個對比實驗(10-V2)中，使用市場上可以購買到的基於酚樹脂(ADX606，自Lubrizol)的破乳劑D1.45mg/kg。依照DIN51415使用每一個燃料樣品進行乳化實驗。在這方面，每例中80ml燃料和20ml水相互完全混合。此後，觀察到依賴時間的分層過程。利用規範標準分析，l表徵非常好的分層，較大的數代表越來越差的分層。所引用的DIN規範中包含所述細節。表l總結了實驗所獲得的結果。該表列出各種情況下l分鐘、5分鐘、30分鐘和60分鐘後相分離層的評定。通常，l或lb評定值需要在5分鐘後獲得。表ltableseeoriginaldocumentpage34A+0.03mgH./kglb11110-3A+0.05mgH./kglb11110-4A+0.07mgH./kglb11110-5A+014mgH./kglb11110-6A+0.28mgH./kg1111註解當沒有添加破乳劑時，僅僅觀察到非常慢的破乳化作用。評定值4是不能接受的；形成穩定的乳劑。甚至及其少量的疏水蛋白也顯示出非常好的破乳化效果。0.01ppm的疏水蛋白足可以在l分鐘內導致可接受的結果。為了達到與0.07mg疏水蛋白/kg相同的效果，需要向每kg燃料中添加1.45mg市場上可以購買的基於酚樹脂的破乳劑。因此，當使用疏水蛋白時，僅僅約常規破乳劑所需用量的l/20即可達到相同的效果。比較實施例ll使用其他蛋白質作為燃料添加劑利用與實施例IO相似的方法，測試非疏水蛋白在燃料中的用途。本實驗利用牛血清白蛋白(BSA)和酪蛋白進行。這些蛋白質是市場上可以購買的。也利用如SEQIDNo.15和16所示的yaad，即沒有連接疏水蛋白的融合配偶體本身。分別添加各蛋白質到市場上可以購買的Eurosuper燃料(與EN228—致)中，所述蛋白質的濃度為0.07mg/kg，所述燃料已含上述特效添加劑包A1000mg/kg。只添加A，不含蛋白質的燃料作為參比。如上所述，依照DIN51415使用每一燃料樣品進行乳化實驗。表2tableseeoriginaldocumentpage35註解當沒有添加破乳劑時，乳劑分離的發生與實施例10—樣慢。評定值4是不能接受的；形成穩定的乳劑。儘管所使用的蛋白質具有破乳化效果，但破乳化作用的速率低於使用疏水蛋白時的速率。實施例12利用疏水蛋白濃縮物(Vai^-J^M^H^-H一)作為原油的破乳劑利用實施例8(SEQIDNO.19和20)所描述的疏水蛋白濃縮物進行實驗。在該實驗中，將不同量的疏水蛋白濃縮物添加到50ml原油中(樣品exWintershallAG，Emlichheim，well301;在常規破乳化作用後，殘留的水含量約為3%)。原油中疏水蛋白的濃度為lppm、10ppm和40ppm。在勻漿化處理後，2000rpm離心混合物10分鐘。結果在表3中列出。表3tableseeoriginaldocumentpage36添加IOppm和40ppm疏水蛋白濃縮物之後，自由水相構成主要組分。實施例13利用疏水蛋白濃縮物(yaad-Xa-dewA-His6)作為分級聚合物利用實施例8(SEQIDNO.19和20)所述的疏水蛋白濃縮物進行實驗。在每例中，開始加入150g鈉鹽形式的聚丙烯酸(SokalanCP10S;Mw4000g/mol，依據DE19950941Al)到兩個玻璃燒杯中，之後分別添加75g異丙醇。攪拌混合物5分鐘，之後分別添加146g的異丙醇/水(1/1比率)並攪拌混合物5分鐘。添加50ppm疏水蛋白(1.64m，11.3mg/ml)到玻璃燒杯A中，並攪拌混合物5分鐘。疏水蛋白在澄清的溶液中形成白色條帶，5分鐘後該條帶完全溶解。兩個玻璃燒杯中都添加19.75g50。/。的NaOH，並攪拌混合物5分鐘。疏水蛋白存在時馬上形成乳狀溶液，而沒有疏水蛋白時形成濃烈的不透明溶液。在攪拌15分鐘後，分別轉移玻璃燒杯中的內容物到500ml分液漏鬥，輕搖漏鬥，觀察確定相分離所需要的時間長短。對於包含疏水蛋白的樣品，IO分鐘後可看到清楚的相分離；不含疏水蛋白時，最初形成泡沫狀的"過渡層，，；換句話說，沒有形成清晰的相界面。不含疏水蛋白時，清晰的相界面在40分鐘後才形成。分離直到清晰的相界面出現的時間-有疏水蛋白12分鐘-沒有疏水蛋白40分鐘實施例14，比較實施例1555。C時，疏水蛋白融合蛋白(vfrntZ-A^M/gn^-W/^)及牛血清白蛋白(BSA)在油-水乳劑中作為破乳劑的用途利用實施例8(SEQIDNO.19和20)所述的疏水蛋白濃縮物以及利用市場上可以買到的牛血清白蛋白(BSA)溶液進行實驗。如下測試破乳化能力所使用的油為液壓油。開始在IOOml量量筒中加入40ml蒸餾水，基於水量添加5ppm相關的蛋白質，或者基於總體系添加2.5ppm。然後加入40ml液壓油，並在55。C水浴中平衡該體系。溫度平衡時間為20分鐘。此後，利用葉片式攪拌機在1500rpm使油和水乳化15分鐘。使油在水相中乳化。此後，觀察相分離。所給出的是每例中再分離的水相的量，以ml表示。在一個實驗組中，所使用的兩種蛋白質的水性溶液是不經改變的。結果如曲線圖l所示。在第二個實驗組中，首先調節兩種蛋白質溶液，在室溫RT條件下，利用HCl調節pH值到l並在pH為l時放置24小時。此後，再一次利用NaOH調節pH值到7。結果如曲線圖2所示。2.5ppm蛋白質對油-水乳劑的破乳化時間(分鐘)曲線圖1:疏水蛋白(H'蛋白A)與牛血清白蛋白的比較，樣品未予改變2.5ppm蛋白質對油-水乳劑的破乳化時間(分鐘)曲線圖2:疏水蛋白(表示為H'蛋白A)與牛血清白蛋白的比較，在實驗前24h將各例中的樣品調節至pHl註解與沒有破乳劑的樣品相比，BSA僅能輕微提高油-水乳劑的破乳化速率。另一方面，當添加疏水蛋白時，可以觀察到破乳化作用顯著地加速。權利要求1.至少一種疏水蛋白在改進組合物相分離中的用途，所述組合物包含至少兩種液相。2.權利要求l的用途，其中所述至少一種疏水蛋白作為破乳劑。3.權利要求1或2的用途，其中所述至少一種疏水蛋白是疏水蛋白融合蛋白質。4.權利要求3的用途，其中所述疏水蛋白融合蛋白質選自SEQIDNo:20所示的yaad-Xa-dewA-his、SEQIDNo:22所示的yaad-Xa-rodA-his及SEQIDNo:24所示的yaad-Xa-basfl-his中的至少一個，其中yaad也可以是20至293個胺基酸的截短的融合配偶體yaad，。5.權利要求1至4任一項的用途，其中包含至少兩種液相的組合物選自.-—包含油和水的組合物，-包含燃料或可燃物和水的組合物，-包含至少兩種液相的反應混合物。6.權利要求1至5任一項的用途，其中所述至少一種疏水蛋白基於總組合物的4吏用量為0.0001ppm至1000ppm。7.權利要求6的用途，其中組合物是原油-水組合物，所述至少一種疏水蛋白基於總組合物的使用量為lppm至800ppm,8.權利要求6的用途，其中組合物是燃料/可燃物-水組合物，所述至少一種疏水蛋白基於總組合物的使用量為O.OOl卯m至10ppm。9.權利要求1至8任一項的用途，其中除了所述的至少一種疏水蛋白外，還^f吏用至少一種能改進相分離的其他化合物。10.分離包含至少兩種液相組合物中至少兩種液相的方法，包括向所述組合物中添加至少一種疏水蛋白。11.權利要求10的方法，其中所述至少一種疏水蛋白是疏水蛋白融合蛋白質或其衍生物。12.權利要求ll的方法，其中所述疏水蛋白融合蛋白質選自SEQIDNo:20所示的yaad-Xa-dewA-his、SEQIDNo:22所示的yaad-Xa-rodA-his及SEQIDNo:24所示的yaad-Xa-basfl-his中的至少一個，其中yaad也可以是20至293個胺基酸的截短的融合配偶體yaad，。13.權利要求10至12任一項的方法，其中包含至少兩種液相的組合物選自—包含油和水的糹且合物，-包含燃料或可燃物和水的組合物，-包含至少兩種液相的反應混合物。14.權利要求10至13任一項的方法，其中所述至少一種疏水蛋白基於總組合物的使用量為0.0001ppm至1000ppm。15.權利要求14的方法，其中組合物是原油-水組合物，所述至少一種疏水蛋白基於總組合物的使用量為lppm至800ppm。16.權利要求14的方法，其中組合物是燃料/可燃物-水組合物，所述至少一種疏水蛋白基於總組合物的使用量為O.OOlppm至10ppm。17.根權利要求10至16任一項的方法，其中所述方法包括在添加所述至少一種疏水蛋白之前或之後提高包含至少兩種液相組合物的溫度。18.—種製劑，包括至少一種化合物和至少一種疏水蛋白，所述化合物選自燃料、可燃物、原油、水溶性或油溶性聚合物的溶液。19.權利要求18的製劑，其中存在於製劑中的所述疏水蛋白基於總制齊寸的量為O.OOOlppm至1000ppm。20.權利要求18或19的製劑，其中所述製劑包括至少一種燃料或可燃物和疏水蛋白/疏水蛋白衍生物，所述疏水蛋白或疏水蛋白衍生物基於總製劑的量為0.001ppm至0.5ppm。21.權利要求20的製劑，其中所述燃料或可燃物選自汽油、柴油機燃料或汽輪機燃料。22.權利要求18至21任一項的製劑，其中所述至少一種蛋白質是疏水蛋白融合蛋白質或其衍生物。23.權利要求22的製劑，其中所述疏水蛋白融合蛋白選自SEQIDNo:20所示的yaad-Xa-dewA-his、SEQIDNo:22所示的yaad-Xa-rodA-his及SEQIDNo:24所示的yaad-Xa^asfMiis中的至少一個，其中yaad也可以是20至293個胺基酸的截短的融合配偶體yaad，。全文摘要本發明涉及至少一種蛋白質特別是至少一種疏水蛋白或者至少一種疏水蛋白衍生物的用途，用於改進包含至少兩種液相的組合物的相分離；涉及分離包含至少兩種液相的組合物中至少兩種液相的方法；也涉及包括至少一種化合物和至少一種蛋白質特別是至少一種疏水蛋白或其衍生物的製劑，所述化合物選自燃料、可燃物、原油、水溶性/油溶性聚合物溶液。文檔編號B01D17/04GK101151081SQ200680010141公開日2008年3月26日申請日期2006年3月29日優先權日2005年4月1日發明者C·博爾施韋勒,C·科爾曼,D·波塞爾特,H-G·勒邁爾,M·古茨曼,M·基弗,M·考羅什,T·薩布科夫斯基,U·鮑斯,W·施密特申請人:巴斯福股份公司