一種利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法與流程

2023-04-24 09:06:23 3

本發明涉及毒素降解技術領域，更具體地，涉及一種利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法。

背景技術：

黃麴黴毒素是一類化學結構相似的化合物的統稱，為二氫呋喃香豆素的衍生物。黃麴黴毒素主要是由黃麴黴（A.flavus）和寄生麴黴（A.parasiticus）產生的次生代謝化合物，是世界公認的天然致癌性最強的毒素，1993年被世界衛生組織（WHO）的癌症研究機構劃定為I類致癌物。我國黴菌毒素汙染率高達90%，黴菌汙染在我國氣候溫暖且溼潤的南方地區尤為嚴重。黃麴黴毒素廣泛存在於食品、農產品和動物飼料中，嚴重汙染小麥、玉米等糧油製品，在一些發酵醃製產品中也有黃麴黴毒素的檢出。黃麴黴毒素不僅致癌性、致畸性居首位，而且結構十分穩定，在食品的熱加工環節難以被破壞。

目前已經被人類發現且分離出的黃麴黴毒素及其衍生物有20多種，其中黃麴黴毒素B1致癌性與致畸性高居首位，黃麴黴毒素B1（AFB1）無色、無嗅、無味，在糧食作物中經常能被檢測到。

T-2毒素是單端孢黴烯族真菌毒素中毒性最強的一種，主要危害動物體內細胞分裂旺盛的器官，如胸腺、骨髓、淋巴、肝臟等，引起動物造血組織和免疫器官的出血性綜合症，抑制DNA的合成、轉錄與蛋白質的翻譯表達，T-2毒素可以使細胞內細胞色素氧化酶活力降低，心肌組織中ATP含量下降，導致心肌細胞不可逆損傷，引起心肌功能紊亂；T-2毒素經口、皮膚、呼吸道暴露，可引起機體器官和組織損傷；其具有較高的穩定性，不易揮發，且具有很強的耐熱性和紫外線耐受性。在室溫下放置6～7年毒性不減，是食品生產和加工中影響危害很大的一類真菌毒素。

近些年國內外的研究中可以見到利用特定菌株與真菌毒素相結合從而達到降解液體基質中AFB1與T-2毒素，酸奶中的乳酸菌對AFB1以及T-2毒素是否有降解作用，目前尚未有人作出相關研究。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的：

乳酸菌在降解食品中真菌毒素中的應用，所述乳酸菌為保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乾酪乳桿菌，所述真菌毒素為AFB1和/或T-2毒素。

本發明還提供一種利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法，是將保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乾酪乳桿菌同時加入食品中，培養68～72 h，所述真菌毒素為AFB1和/或T-2毒素。

研究發現將三種乳酸菌加入到食品中，三種菌能夠聯合降解食品中的毒素，另外還發現三種菌對AFB1的降解能力並不受初始毒素濃度的影響，但三種菌的聯合作用對T-2毒素的降解作用中可以看出隨著初始濃度的升高，三株菌的聯合解毒能力下降，因此，優選地，當真菌毒素為T-2毒素時，其食品中的T-2毒素含量為20～250 ng/mL或40 ng～500 ng/g時，降解效果好。當真菌毒素為AFB1毒素時，其食品中的AFB1毒素含量為5～100ng/mL或者10～200 ng/g時，降解效果好。

優選地，所述食品選自魚露和醃製魚肉中的一種或兩種。

更優選地，所述醃製魚肉為醃製羅非魚。

優選地，上述方法中，保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乾酪乳桿菌的添加量為109 cfu/mL，所述保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乾酪乳桿菌的添加比例為1:1:1。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

本發明通過提供了乳酸菌在降解食品中真菌毒素中的應用，所述乳酸菌為保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乾酪乳桿菌，所述真菌毒素為AFB1和/或T-2毒素，通過共培養，研究保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌以及乾酪乳桿菌對AFB1以及T-2毒素的降解作用的異同。該研究可以有效的應用於實際生活生產當中，將有效地降低AFB1以及T-2毒素對食品的汙染，對食品的現代化生產中降解黃麴黴毒素與T-2毒素具有理論指導意義和實際價值。

附圖說明

圖1為保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乾酪乳桿菌的菌落特徵，其中圖1A為保加利亞乳桿菌，圖1B為嗜酸乳桿菌，圖1C為乾酪乳桿菌。

圖2為保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乾酪乳桿菌的細胞形態特徵，其中圖1A為保加利亞乳桿菌，圖1B為嗜酸乳桿菌，圖1C為乾酪乳桿菌。

圖3為MRS培養基中三種菌的生長曲線。

圖4為魚露中三種菌的生長曲線。

圖5為模擬醃製魚肉中三種菌的生長曲線。

圖6為AFB1的標準曲線。

圖7為T-2毒素的標準曲線。

具體實施方式

下面將結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟、條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若無特別說明，實施例中所用的實驗方法均為本領域技術人員所熟知的常規方法和技術，所使用的試劑或材料均為通過商業途徑得到。

具體實施方式中醃製魚肉為新鮮羅非魚肉加高濃度鹽水溶液醃製食品。

實施例1 保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌的分離鑑定

將發酵乳作濃度梯度稀釋，選取10-3、10-4、10-5三個稀釋度的液體各0.1mL塗布於已經配置好的MRS培養基上，37℃ 培養48h，48h後觀察菌落形態，將保加利亞乳桿菌疑似菌落與嗜酸乳桿菌疑似菌落分別劃線接種於MRS培養基上，37℃ 培養48h，48h後觀察菌落形態，並拍照。

將乳酸菌乳飲品作濃度梯度稀釋，選取10-3、10-4、10-5三個稀釋度的液體各0.1mL塗布於已經配置好的MRS培養基上，37℃ 培養48h，48h後觀察菌落形態，並拍照。將乾酪乳桿菌菌落劃線接種於MRS培養基中，37℃培養48h，觀察菌落形態並拍照。

將上述疑似菌落製成塗片，顯微鏡下觀察形態結構並拍照。

將保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌分別轉接於斜面MRS培養基中， 37℃ 培養24h後，保存至4℃ 冰箱。

1、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌在菌落形態方面有一定的區別，保加利亞乳桿菌菌落較大，嗜酸乳桿菌菌落較小，兩種菌菌落均為乳白色，表面溼潤，光滑，菌落為比較規則的圓形；乾酪乳桿菌菌落為乳白色，表面溼潤、光滑，邊緣整齊的圓形菌落。在添加Ca2+的培養基上，菌落周圍能形成明顯的、直徑約4～8mm的溶Ca2+圈（圖1）。

2、挑取保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌的疑似菌落進行革蘭氏染色並且在顯微鏡下觀察其形態和結構特徵；保加利亞乳桿菌為革蘭氏陽性菌，在顯微鏡下菌體較粗且長，兩端圓潤，在顯微鏡下可以明顯的觀察到異染顆粒；嗜酸乳桿菌為革蘭氏陽性菌，在顯微鏡下菌體較小且較細，兩端圓潤；乾酪乳桿菌為革蘭氏陽性桿菌，在顯微鏡下，菌體與保加利亞乳桿菌相比較細，較粗於嗜酸乳桿菌，菌體較長（圖2）。

3、經過72h的OD600測定，繪製得到保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌三種菌株在MRS培養基、魚露、醃製魚肉勻漿中的生長曲線，三株菌株在不同生長基質中的生長以及相互間的生長趨勢都表現出了差異性。

在MRS肉湯中，三種乳酸菌的長勢良好，均在20h左右結束對數期並達到最大值，在50h～60h左右結束穩定期，開始有下降的趨勢，OD值逐漸下降（圖3）。

在魚露中，三種乳酸菌的長勢相比在MRS肉湯中較弱，推測原因可能是由於鹽濃度過高，生長緩慢且平穩，生長曲線中並未表現出明顯的對數期，在40h左右結束穩定期，開始有下降的趨勢，之後OD值有明顯的下降（圖4）。

在模擬醃製魚肉過程中，三種乳酸菌的生長趨勢相比在MRS肉湯中較弱，推測原因可能是由於鹽濃度過高，導致乳酸菌生長遲緩，但由於魚肉中營養物質豐富，導致其生長情況優於魚露中乳酸菌的生長情況。由圖可知，保加利亞乳桿菌耐鹽性較差，在最初的40h生長情況較差，但在40h後，生長趨勢與嗜酸乳桿菌及乾酪乳桿菌基本相同。在72h生長曲線中並未表現出明顯的對數期與衰退期，推測可能由於鹽濃度過高，導致乳酸菌的生長趨勢有著明顯的延滯性（圖5）。

實施例2 乳酸菌聯合作用對AFB1與T-2毒素混合毒素的降解實驗

將1.0mg AFB1毒素標準品用乙腈溶解，置於10mL容量瓶中乙腈定容。配製成濃度均為0.1mg/mL標準儲備液。取1mL儲備液於10mL容量瓶甲醇定容，得濃度均為10μg/mL的AFB1毒素標準溶液。配得標準溶液均置於-20℃冰箱保存。

根據需要將AFB1標準溶液配製濃度為250、500、1000、2500、5000ng/mL的標準使用液；標準使用液現配現用，溶劑為30%甲醇溶液，配得標準使用液均置於-20℃冰箱保存。

根據T-2毒素的最低檢出量標準，同樣設置5個濃度梯度。將1.0mg T-2毒素標準品用乙腈溶解，置於10mL容量瓶中乙腈定容。配製成濃度均為0.1mg/mL標準儲備液。取2mL儲備液於10mL容量瓶甲醇定容，得濃度均為20μg/mL的T-2毒素標準溶液。配得標準溶液均置於-20℃冰箱保存。

根據需要將T-2毒素標準溶液配製濃度為1000、2500、5000、10000、12500 ng/mL的標準使用液；標準使用液現配現用，溶劑為30%甲醇溶液，配得標準使用液均置於-20℃冰箱保存。

為測定乳酸菌之間的相互作用對降解毒素的影響，以及乳酸菌對聯合毒性的降解作用，設置將兩種毒素混合，三種乳酸菌菌液混合，共同培養。

將AFB1與T-2毒素標準使用液回溫至室溫，並根據下表進行培養管的設置（如表1，表1中基液為魚露或魚肉與鹽水1:1混合製得的勻漿液）。每個濃度梯度設置一個平行，每組設置一個空白對照。

1、AFB1與T-2毒素的提取和檢測

培養管在37℃培養72小時後，對培養管中的毒素進行提取。配製30%的甲醇溶液，待用。

用移液槍分別吸取0.5mL培養液於已滅菌的1.5mL離心管中，加入1mL乙酸乙酯，使用旋渦混合儀震蕩60s，用離心機離心（7000 rpm，5min），用移液槍提取上層清液於5mL已滅菌的離心管中，反覆提取3次，合併提取液。將提取液於60℃的全自動氮吹儀下空氣吹乾。用移液槍吸取1mL 30%的甲醇溶液於離心管中，旋渦混合儀上震蕩30s溶解，用一次性無菌注射器吸取，並經過濾膜過濾在進樣小瓶中，編號，待測。

AFB1以及T-2毒素的檢測：1、質譜條件：噴霧電壓：4500V；鞘氣壓力：35au；輔助氣壓：15au；毛細管溫度：270°C；碰撞壓：1.5mTorr。採用MRM多反應監測方式，各參數見表2。

色譜條件：色譜柱：Hypersil Gold（100mm × 2.1mm，5μL）；流動相：甲醇-5mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）。進樣量：10μL；針頭到瓶底距離：1.0mm；進樣速度：10.0μL/s；淋洗體積：1500μL；淋洗速度：100.00μL/s；衝洗體積：1500μL；進樣速度：250.0μL/min。梯度洗脫條件見表3。流動相：A、甲醇 B：超純水。

將進樣小瓶按編號排列放置於進樣板上，通過LC-MS/MS檢測，記錄並分析實驗數據。

2、魚露與三種乳酸菌共培養對毒素的解毒能力實驗

將分離得到的三種乳酸菌與AFB1以及T-2毒素共同在魚露中共培養，72h後測定的結果如下。

由表4可知，在魚露中，三株乳酸菌對T-2毒素的聯合解毒能力弱於AFB1。相比較於三株菌的單獨解毒作用，三株菌的聯合解毒能力更好。

3、模擬醃製魚肉中三種乳酸菌對毒素的解毒能力實驗

將分離得到的三種乳酸菌與AFB1以及T-2毒素共同在模擬醃製魚肉中共培養，72h後測定的結果如下。

由表5可知，在模擬醃製魚肉中，低濃度下三株菌對T-2毒素的聯合解毒能力優於對AFB1的聯合解毒能力，隨著毒素濃度的增高，三株菌對AFB1的解毒能力逐漸高於T-2毒素的解毒能力；對比三株菌的單獨解毒作用，三株菌的聯合解毒能力更好。

經過試驗可知，從酸奶中分離得到的保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乾酪乳桿菌對AFB1以及T-2毒素均有不同程度的降解作用。

三株菌的聯合作用對T-2毒素的降解作用中可以看出隨著初始濃度的升高，三株菌的降解能力出現下降。但三株菌對AFB1的降解能力並不受初始毒素濃度的影響。