核苷酸多態性的檢測方法

2023-05-25 07:44:11 4

專利名稱：核苷酸多態性的檢測方法
技術領域：
本發明涉及可用於檢測基因中鹼基置換的核苷酸(供本發明方法用的寡核苷酸)、使用所述核苷酸檢測基因中鹼基置換的方法、以及用於所述方法的試劑盒。
背景技術：
已知屬於同一物種的生物個體基因組中所含的遺傳密碼相互並不相同，在鹼基序列中存在差異，被稱為多態性。其中一個至數十個鹼基缺失或插入的鹼基序列、其中特定鹼基序列被複製的鹼基序列等都被稱為多態性。其中一個鹼基被另一鹼基取代的鹼基序列被稱為單核苷酸多態性(SNP)。
據說單核苷酸多態性以約1/100-1/1000鹼基的速率存在。因此，人類基因組上存在的SNP數目估計是3-10×106。注意到SNP作為用於搜索與疾病相關的基因的指標，或者作為用於獲得有關對疾病的感病性或對藥物的敏感性(作用或副作用)方面差異的信息的指標。用於檢測SNP的方法正在研究之中。
用於檢測SNP的常規方法一般分為基於雜交的方法、基於引物延伸的方法和應用酶的底物專一性的方法。
在雜交方法中，通過探針與核酸樣品的雜交來檢測鹼基置換的存在。按照所述方法，必需確定探針和雜交條件，以便使雜交可受僅一個鹼基差別的影響。因此，難以建立高度可再現的檢測系統。
例舉應用如美國專利第5,660,988號中所述的循環探針反應來檢測突變的方法。在所述方法中，將具有可容易切割的鍵合的核酸探針與目標核酸分子雜交。如果目標核酸分子沒有鹼基置換，則探針被切割，反之，如果所述核酸分子有鹼基置換，則探針不被切割。鹼基置換則通過檢測從被切割探針釋放的片段的產生程度並對其進行定量來檢測。然而，如果依照此方法檢測痕量的靶核酸，則可能需要相當長的時間來達到所述方法可以檢測到來自探針的切割產物的水平，因為切割產物的量很少。
應用如美國專利第5,210,015號和第5,487,972號中所述的TaqMan方法來檢測突變的方法是另一方法的例子。在該方法中使用與螢光染料和猝滅劑連接的TaqMan探針。使用兩種探針(一種含有鹼基置換，而另一種不含鹼基置換)作為TaqMan探針。所述探針與目標核酸分子雜交，並且引物從上遊開始延伸。只有當目標核酸分子不含鹼基置換時，所述探針才由於DNA聚合酶的5』→3』外切核酸酶活性而被切割。鹼基置換則通過檢測發射的螢光來檢測。然而，所述方法有問題，因為所述方法需要具有5』→3』外切核酸酶活性的聚合酶、使用3』末端被封閉的標記核苷酸以及嚴格的溫度調節的PCR，因而檢測需要的時間長。
其中使用酶的方法包括其中使用DNA聚合酶的方法。這樣的方法還分為如下三組(1)其中使用3』末端退火至待檢測鹼基置換的鹼基部分的引物，基於引物延伸反應的存在檢測鹼基置換的方法，如美國專利第5,137,806號中所述；(2)其中使用其中待檢測的鹼基置換位點位於從3』末端起第二個核苷酸上的引物，基於引物延伸反應的存在檢測鹼基置換的方法，如WO 01/42498中所述；和(3)其中使用3』末端退火至鄰近待檢測鹼基置換的鹼基的3』鹼基上的引物，通過鑑別摻入到引物中的鹼基，測定在目標位點上存在突變和所述位點上的鹼基的方法。
其中使用DNA連接酶的方法是已知的，按照所述方法，鹼基置換基於探針與相鄰探針連接的存在進行檢測。所述探針的末端部分對應於待檢測鹼基置換的鹼基部分。
其中使用DNA聚合酶或DNA連接酶的方法可能不能夠精確檢測出由於鹼基置換引起的引物(或探針)和靶核酸之間的錯配。具體地說，即使引物或探針有錯配，這樣的酶也可以起始酶促反應，從而提供錯誤結果。
因為由於靶核酸和引物之間的錯誤退火引起的可能的假陽性或者由於所使用的連接酶或聚合酶造成的錯誤，所以必需非常嚴格地控制反應條件(特別是反應溫度)等，因而有涉及可再現性的問題。
最後，包括其中使用具有識別和切割雙鏈核酸中特定結構的活性的酶的方法，例如在美國專利笫5,846,717號中所述的侵入者(invader)方法。切割酶已知是這樣的酶。通過檢查探針的切割來檢測鹼基置換是可行的。設計所述探針使其形成為所述酶所識別的結構，如果鹼基置換存在(或不存在)的話。然而，其中使用具有識別和切割雙鏈核酸中特定結構的活性的酶的方法就其靈敏度而論有問題。具體地說，按照所述方法，由於從不同的靶核酸分子產生一種信號，所以不可能從痕量的核酸樣品中獲得足以檢測出鹼基置換的信號。自然，有可能通過重複探針切割反應來增強所述信號，雖然必需預先擴增靶核酸，以便獲得強的信號。因此，如果依照此方法檢測痕量的靶核酸，則可能需要相當長的時間來達到可以檢測到來自探針的切割產物的水平，因為切割產物的量很少。
由於所述方法有如上所述的幾個問題，因此一直需要可以用來精確檢測鹼基置換的方法。
發明目的本發明的主要目的是解決上述問題，並且提供即使使用痕量的核酸樣品也能精確而極好再現性地檢測鹼基置換(例如SNP)的方法。
發明概述為了解決如上所述的問題，需要可以用來精確檢測鹼基置換並且獲得作為強信號的結果的方法。
本發明人製備了一種核苷酸。所述核苷酸能夠退火至待檢測鹼基置換的靶核酸上。通過DNA聚合酶從其3』末端的DNA延伸反應當所述核苷酸處於完整狀態時則不被起始。核酸酶對所述核苷酸的切割受退火的模板鏈的鹼基序列的影響。此外，本發明人建立了使用所述核苷酸可以用來精確而高靈敏度地檢測靶核酸中鹼基置換的方法。因而完成了本發明。
本發明概述如下。本發明的第一個方面涉及一種用於檢測靶核酸中特定鹼基上存在鹼基置換的方法，所述方法包括(1)將含有靶核酸的樣品與一種核苷酸混合，其中所述核苷酸(A)在3』末端被修飾，致使不發生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定鹼基的區上的鹼基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基和在所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定鹼基和在所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產生一個新的3』末端；(2)用所述核酸酶和所述DNA聚合酶處理所述混合物；且(3)檢測所述核酸酶有無切割所述核苷酸。
以下方法作為第一方面的用來檢測鹼基置換的方法的例子；其中所述核酸酶為核糖核酸酶H，並且所述核苷酸在含對應於所述特定鹼基的鹼基的區中含有一個核糖核苷酸的方法；以及其中所述核酸酶為限制性酶，並且所述核苷酸在含對應於所述特定鹼基的鹼基的區中含有一個限制性酶的識別序列的方法。
本發明的第二個方面涉及一種用於檢測靶核酸中鹼基置換的方法，所述方法包括(1)將含有靶核酸的樣品與一種核苷酸混合，其中所述核苷酸
(A)在3』末端被修飾，致使不發生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定鹼基的區上的鹼基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產生一個新的3』末端；(2)用所述核酸酶和所述DNA聚合酶處理所述混合物；且(3)檢測所述核酸酶有無切割所述核苷酸。
其中所述核酸酶是一種錯配特異性核酸酶的方法為第二個方面的檢測方法的例子。
在第一個或第二個方面的檢測方法中所使用的所述核苷酸可以具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中沒有鹼基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中不產生錯配，或者它可以具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中有鹼基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中不產生錯配。
以下方法例證了第一個或第二個方面的實施方案其中鹼基置換的存在基於通過所述DNA聚合酶的作用產生的延伸產物的存在來測定的方法；和其中鹼基置換的存在基於通過所述核酸酶的作用產生的從所述核苷酸釋放的3』部分的片段的存在來測定的方法。此外，延伸產物或所述核苷酸3』部分的片段可以利用與所述核苷酸連接的標記來檢測。可以用螢光物質作為標記。此外，可以使用與螢光物質和能夠猝滅螢光的物質連接的核苷酸，其中當核酸酶進行切割或切割後DNA延伸時發射螢光。在其中使用螢光標記的核苷酸的實施方案中，可以使用螢光偏振法進行檢測。
就在第一個或第二個方面用於檢測鹼基置換的方法中所使用的所述核苷酸而論，在3』端對所述核苷酸進行修飾的例子為修飾核糖3-位上的羥基。在本發明用於檢測鹼基置換的方法中所使用的所述核苷酸可以含有核苷酸類似物和/或經修飾的核苷酸。雖然並不打算限制本發明，但是例如可以優選使用脫氧核糖肌苷核苷酸、脫氧核糖尿嘧啶核苷酸等作為核苷酸類似物，而可以優選使用(α-S)核糖核苷酸作為經修飾的核糖核苷酸。此外，第一個或第二個方面的方法還可以包括一個核酸擴增步驟，其中用通過所述DNA聚合酶的作用產生的延伸產物作為模板。
本發明的第三個方面涉及一種用於分析等位基因的基因型的方法，所述方法包括按照第一個或第二個方面的方法檢測鹼基置換。
本發明的第四個方面涉及一種用於檢測靶核酸中特定鹼基上鹼基置換的核苷酸，所述核苷酸(A)在3』末端被修飾，致使不發生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定鹼基的區上的鹼基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產生一個新的3』末端。
以下核苷酸為第四個方面的核苷酸的例子在所述靶核酸中含有對應於所述特定鹼基的鹼基的區中含有核糖核苷酸的核苷酸，其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核糖核酸酶H切割；以及在所述靶核酸中含對應於所述特定鹼基的鹼基的區中含有限制性酶識別序列的核苷酸，其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸被所述限制性酶切割。
本發明的第五個方面涉及一種用於檢測靶核酸中特定鹼基上鹼基置換的核苷酸，所述核苷酸(A)在3』末端被修飾，致使不發生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定鹼基的區上的鹼基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產生一個新的3』末端。
其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述核苷酸和所述靶核酸之間有錯配、則所述核苷酸被錯配特異性核酸酶切割的核苷酸是第五個方面的核苷酸的例子。
第四個或第五個方面的核苷酸可以具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中沒有鹼基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中不產生錯配；或者它可以具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中有鹼基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中不產生錯配。
第四個或第五個方面的核苷酸可以具有連接的標記化合物。其位置可以位於所述核酸酶切割位點3』或5』的部分。例如，可以使用螢光物質作為標記化合物。通過進一步連接能夠猝滅螢光的物質，可以製備當所述核酸酶進行切割或者所述切割後DNA延伸時發射螢光的核苷酸。
就第四個或第五個方面的核苷酸而論，在3』端對所述核苷酸進行修飾的例子為修飾核糖3-位上的羥基。本發明的核苷酸可以含有核苷酸類似物和/或經修飾的核苷酸。雖然並不打算限制本發明，但是例如可以優選使用脫氧核糖肌苷核苷酸、脫氧核糖尿嘧啶核苷酸等作為核苷酸類似物，而可以優選使用(α-S)核糖核苷酸作為經修飾的核糖核苷酸。
本發明的第六個方面涉及一種用於檢測靶核酸中鹼基置換的試劑盒，所述試劑盒含有第四個或第五個方面的所述核苷酸。
以下試劑盒是第六個方面的試劑盒的例子含有核酸酶和/或DNA聚合酶的試劑盒；還含有用於檢測DNA延伸物存在的試劑的試劑盒；和還含有用於實施核酸擴增法的試劑的試劑盒。
附圖簡述

圖1圖示說明依照本發明用於檢測鹼基置換的方法來檢測人類基因中鹼基置換的結果。
圖2圖示說明依照本發明用於檢測鹼基置換的方法來檢測人類基因中鹼基置換的結果。
圖3圖示說明依照本發明用於檢測鹼基置換的方法來檢測人類基因中鹼基置換的結果。
圖4圖示說明依照本發明用於檢測鹼基置換的方法來檢測人類基因中鹼基置換的結果。
圖5是一幅曲線圖，圖示說明依照本發明用於檢測鹼基置換的方法來檢測人類基因中鹼基置換的結果。
圖6圖示說明依照本發明用於檢測鹼基置換的方法來檢測人類基因中鹼基置換的結果。
圖7圖示說明依照本發明用於檢測鹼基置換的方法來檢測人類基因中鹼基置換的結果。
圖8圖示說明依照本發明用於檢測鹼基置換的方法來檢測人類基因中鹼基置換的結果。
發明詳述此中所用的「鹼基置換」是指核酸中特定位點上的鹼基被另一鹼基取代。鹼基置換導致在生物個體中遺傳信息方面的差別。遺傳信息方面的差別被稱為多態性或變異。此中所用的鹼基置換包括多態性和變異方面的鹼基置換。所述鹼基置換也包括人工引入核酸中的鹼基置換。
對於所述鹼基置換中被置換鹼基的數目並無具體限制。可以有一個或多個置換。
本發明特別適用於檢測基因組多態性或變異，尤其是基因中的單核苷酸多態性(SNP)。
在下文，將詳細描述本發明。
(1)本發明的核苷酸本發明的核苷酸具有能夠退火至靶核酸中含有待檢測鹼基置換的位點的區上的鹼基序列。所述核苷酸如果它處於完整狀態則不充當通過DNA聚合酶延伸DNA的引物，而只有當它被核酸酶切割時它才可以充當引物。對於所述核苷酸的長度並無具體限制，只要它具有如上所述的特性。按照本發明既可以使用寡核苷酸，也可以使用多核苷酸。使用通常8-50個鹼基、優選10-40個鹼基、更優選12-30個鹼基的寡核苷酸作為本發明的核苷酸。
通常，本發明的核苷酸是一種含有脫氧核糖核苷酸的寡核苷酸。任選的是，它可以含有核糖核苷酸、或者核苷酸的類似物或衍生物(修飾物)。例如，具有諸如肌苷或7-脫氮鳥嘌呤的鹼基作為其鹼基部分的核苷酸類似物或者具有核糖衍生物的核苷酸類似物可以用作核苷酸類似物。經修飾的核苷酸的實例包括其中與磷酸基團連接的氧原子被硫原子取代的(α-S)核苷酸以及連接了標記化合物的核苷酸。此外，本發明的核苷酸可以含有如PNA；Nature，365566-568(1993)中所述的肽核酸。雖然並不打算限制本發明，但是所述核苷酸類似物或衍生物優選摻入在所述摻入並不影響所用核酸酶作用的位點上。將核苷酸類似物摻入到本發明的核苷酸中對於抑制所述核苷酸自身高級結構的形成以及所述核苷酸退火至靶核酸上的穩定性是有效的。因此，所述核苷酸可以含有核苷酸類似物和/或經修飾的核苷酸，只要在本發明用於檢測鹼基置換的方法中可以使用的核苷酸的功能得以保留。
按照本發明使用的所述核苷酸具有供檢測靶核酸中特定鹼基上的鹼基置換用的以下特性(A)在3』末端被修飾，致使不發生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定鹼基的區上的鹼基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基(即在所述特定鹼基之間形成氫鍵)的鹼基之間有錯配(或者如果沒有錯配的話)，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配(或者如果有錯配的話)，則所述核苷酸被核酸酶切割，產生一個新的3』末端。
所述核苷酸被核酸酶切割後的5』部分的片段仍可以退火至靶核酸上。由於在所述核苷酸5』部分的片段的3』末端上的核糖或脫氧核糖的3-位上存在一個羥基，因此DNA可以由DNA聚合酶從所述末端開始延伸。因而，所述核苷酸如果具有可被核酸酶切割的鹼基序列，則充當引物的前體。
如上所述，本發明的核苷酸在3』末端被修飾，致使它不能用於通過DNA聚合酶的DNA延伸反應中。對於修飾方法並無具體限制，只要可以達到上述目的。其實例包括在雙脫氧核苷酸的3』末端添加一個在核糖3-位上的羥基上修飾的核苷酸或者添加一個具有由於空間位阻而幹擾DNA聚合酶延伸的修飾的核苷酸。可以使用烷基化或其它已知的修飾方法作為修飾核苷酸的核糖3-位上的羥基的方法。例如，DNA延伸反應可以為氨基烷基化所阻止。
本發明的核苷酸具有能夠在所用條件下退火至靶核酸中待檢測鹼基置換的區的鹼基序列。所述核苷酸具有與靶核酸基本互補的序列，並且不必具有與所述靶核酸完全互補的鹼基序列，只要對目標鹼基上置換的檢測不受幹擾。
當本發明的核苷酸退火至靶核酸上並且在合適的核酸酶和合適的DNA聚合酶的存在下保溫時，所述核苷酸的切割受到靶核酸中存在鹼基置換即在於由所述核苷酸退火至靶核酸上所形成的雙鏈核酸中存在錯配的位點的影響。用所述靶核酸作為模板的DNA延伸僅當所述核苷酸被切割而產生一個新的3』末端時才發生。因此，人們可以根據DNA延伸的存在而獲得有關存在錯配或者存在鹼基置換的信息。
按照本發明，製備所述核苷酸致使如果存在待檢測的鹼基置換則產生錯配是可能的，並且製備所述核苷酸致使如果存在鹼基置換則不產生錯配也是可能的。此外，人們可以如下獲得有關存在鹼基置換的信息，並且同時獲得置換鹼基類型的信息製備四種類型的核苷酸，它們分別具有置於對應於目標鹼基的位置上的四種類型鹼基的其中一種；然後檢查導致延伸的引物中所含的鹼基的類型。
如上所述，本發明的核苷酸由於被核酸酶切割而轉變成能夠進行DNA延伸的引物。所述核苷酸中位於所述核酸酶切割位點5』的部分充當進行DNA延伸的引物。對於所述核酸酶並無具有限制，只要它根據在由於所述核苷酸退火至靶核酸上而形成的雙鏈核酸中存在錯配而切割(或者不切割)所述核苷酸。其實例包括核糖核酸酶H、限制性酶和錯配特異性核酸酶。
核糖核酸酶H(RNA酶H)是一種識別由DNA和RNA組成的雙鏈核酸並且選擇性地切割RNA鏈的酶。通過將核糖核苷酸置於核苷酸中對應於待檢測置換的鹼基的位點上，可以製備僅當沒有錯配時才被核糖核酸酶H切割的核苷酸。
關於按照本發明使用的核糖核酸酶並無具體限制，只要它具有識別由含核糖核苷酸的本發明核苷酸和與其互補的DNA組成的雙鏈核酸並且在核糖核苷酸部分選擇性地切割的活性。例如，來自大腸桿菌(Escherichia coli)的核糖核酸酶H或者來自屬於芽孢桿菌屬(Bacillus)嗜熱菌、屬於棲熱菌屬(Thermus)細菌、屬於熱球菌屬(Pyrococcus)細菌、屬於棲熱袍菌屬(Thermotoga)細菌或屬於古生球菌屬(Archaeoglobus)細菌的核糖核酸酶H優選作為這樣的酶使用。雖然並不打算限制本發明，但是所述核糖核酸酶H優選在與同時使用的DNA聚合酶的相同反應條件下表現出高活性。如果本發明的核苷酸與核酸擴增反應聯合使用，則優選使用在進行所述反應的條件下表現出其活性的核糖核酸酶H。例如，如果使用包括在高溫下反應或處理的核酸擴增反應(例如PCR)，則最好使用耐熱性核糖核酸酶H。例如，來自熱堅芽孢桿菌(Bacillus caldotenax)、激烈熱球菌(Pyrococcusfuriosus)、Pyrococcus horikoshii、Thermococcus litoralis、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)或詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannashi)的核糖核酸酶H可以作為耐熱性核糖核酸酶H使用。
限制性酶是一種識別DNA中特定鹼基序列(4-8個鹼基)並且在所述序列內或其周圍的位置進行切割的酶。如果待檢測置換的鹼基部分與限制性酶的識別序列重疊，則製備用以包括所述序列的核苷酸可以用來檢測鹼基置換。如果在核苷酸和靶核酸之間產生錯配，則不發生限制性酶的切割。人們可以根據所述結果獲得有關存在鹼基置換的信息。如果使用這樣的核苷酸，則必需製備對所述限制性酶的切割不敏感的靶核酸。例如，通過使用對應於所用限制性酶的修飾性甲基化酶，使所述特定鹼基甲基化，而特異性地給靶核酸賦予對限制性酶的抗性是可行的。
可以使用識別靶核酸和核苷酸之間的錯配並且進行切割、並且與上述兩種類型的核酸酶不同的酶。Mut H或類似的酶可以作為這樣的酶使用。
本發明的核苷酸被所述核酸酸酶切割，產生一個新的3』末端，然後從所述末端起始DNA延伸。對於該步驟中所使用的DNA聚合酶並無具體限制，只要它能夠根據作為模板的DNA的序列，從引物的3』末端進行DNA延伸。其實例包括大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenow片段、T7 DNA聚合酶、來自屬於芽孢桿菌屬嗜熱菌的DNA聚合酶(BstDNA聚合酶、BcaDNA聚合酶)、來自棲熱菌屬細菌的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶等)和來自嗜熱古細菌的α-型DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶等)。
如果本發明的核苷酸與基因擴增反應結合使用，則選擇適合於基因擴增反應的DNA聚合酶來使用。
由於被核酸酶切割而產生的本發明核苷酸3』部分的片段仍可以退火至靶核酸上(如果它足夠長的話)，雖然它可以從所述靶核酸中釋放出來(如果它短的話)。如果使用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，則所述片段當通過所述DNA聚合酶進行DNA延伸時與所述靶核酸解離。如果使用具有5』→3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶，則所述片段被所述DNA聚合酶降解。
雖然並不打算限制本發明，但是例如在使用核糖核酸酶H作為核酸酶的情況下，具有由以下通式表示的結構的寡核苷酸可以用作本發明的核苷酸通式5』-dNa-Nb-dNc-N』-3』(a11或11以上的整數；b1或1以上的整數；c0或者1或1以上的整數；dN脫氧核糖核苷酸；N核糖核苷酸；N』經修飾致使不發生由DNA聚合酶進行延伸的核苷酸)。
在所述通式中由Nb表示的部分含有與作為置換檢測研究對象的鹼基相對應的鹼基。此外，所述核苷酸可以含有核苷酸類似物或衍生物(經修飾的核苷酸)，只要不消除所述核苷酸的功能。
實例為作為由所述通式表示的嵌合寡核苷酸的核苷酸，其中N』是經修飾的脫氧核糖核苷酸，a是11或11以上的整數，b＝1-3，c＝0-2。對於與作為鹼基置換檢測對象的鹼基相對應的鹼基並無具體限制，只要它位於由Nb表示的部分中。在本發明的一個實施方案中，例如，可以優選使用一種這樣的核苷酸其中由(dNc-N』)表示的部分的長度為3個鹼基，而與待檢測鹼基置換的鹼基相對應的鹼基位於由Nb表示的部分的3』末端。這樣的核苷酸在檢測鹼基置換方面表現出良好的特異性。
可以促進通過用核酸酶進行切割從本發明的核苷酸釋放的或者通過切割後DNA延伸反應時產生的產物(延伸產物)釋放的3』部分的片段的檢測，並且鹼基置換的存在可以方便地通過適當標記所述核苷酸加以證實。
對於標記核苷酸的方法並無具體限制。例如，可以使用放射性同位素(32P等)、染料、螢光物質、發光物質、各種配體(生物素、洋地黃毒苷等)和酶。來源於標記核苷酸的產物的存在可以用適用於該標記的檢測方法加以證實。不能直接檢測的配體，可以與具有可檢測標記的配體結合物質結合使用。例如，通過聯合使用來自配體標記的核苷酸的產物和酶標記的抗配體抗體並且擴增該信號，可以高靈敏度地檢測靶核酸。
螢光標記的核苷酸的實施方案的實例包括用螢光物質和具有適當間隔的猝滅所述螢光物質所發射螢光的作用的物質標記的核苷酸。這樣的引物如果它處於完整狀態則不發射螢光。然而，如果它被核酸酶切割並且使螢光物質和猝滅物質相距一定距離，則它發射螢光。由於這樣的核苷酸在與DNA延伸反應起始的同時發射螢光，因此人們可以通過直接觀察反應期間的反應混合物而獲得有關存在鹼基置換的信息。
(2)本發明用於檢測鹼基置換的方法將如以上(1)中所述的本發明核苷酸用於本發明用於檢測鹼基置換的方法中，所述方法包括
(1)將含有靶核酸的樣品與所述核苷酸混合；(2)用核酸酶和DNA聚合酶處理所述混合物；且(3)檢測所述核酸酶有無切割所述核苷酸。按照如以上(1)中所述的本發明核苷酸的特徵，根據核苷酸被核酸酶切割的存在，確定鹼基置換的存在。
在本發明用於檢測鹼基置換的方法中，可以使用單鏈或雙鏈核酸(DNA或RNA)作為靶核酸。根據所使用的核酸酶，可能難以使用RNA作為靶核酸。在這種情況下，可以通過用RNA作為模板製備cDNA並且使用cDNA作為靶核酸，檢測所述RNA中的鹼基置換。
按照本發明，可以使用含有靶核酸的樣品進行檢測反應。
可以使用可能含有核酸的任何樣品或生物體，例如不但限於細胞、組織(活檢樣品等)、全血、血清、腦脊髓液、精液、唾液、痰、尿液、糞便、毛髮和細胞培養物。雖然並不打算限制本發明，但是可以對試樣實施本發明的方法，優選在將其適當加工後，例如在將其轉化為人們可以使用DNA聚合酶進行反應的形式之後。這樣的加工包括裂解細胞以及從樣品中提取並純化核酸。
依照本發明用於檢測鹼基置換的方法，根據待用核苷酸被切割的存在及切割後DNA延伸反應的存在，測定鹼基置換的存在。對於所述測定方法並無具體限制，可以使用分析核酸的已知方法。用於測定DNA延伸反應存在的方法的實例包括以下方法其中分離所產生的延伸產物以通過凝膠電泳(瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠等)或毛細管電泳加以證實的方法；和其中通過質譜法測量延伸產物的長度增加的方法。在另一個實施方案中，例子為其中測定將核苷酸摻入延伸產物中的方法。在該方法中，人們可以獲得作為在大分子延伸產物中摻入的合適標記的三磷酸核苷酸的量的、有關已合成延伸產物的量的信息。可以測定所產生的延伸產物的量，例如，在通過酸沉澱或凝膠電泳從未反應的核苷酸中分離所述產物之後測定。此外，可以使用其中通過酶促方法檢測DNA延伸反應時產生的焦磷酸的方法。
按照本發明的檢測方法，可以採用已知的核酸擴增反應，進一步擴增所述延伸產物。鑑於高靈敏度地檢測鹼基置換，這樣的實施方案是有用的。
可以使用其中用具有與作為模板的核酸互補的序列的引物的各種核酸擴增法作為核酸擴增反應，但不限於此。例如，可以使用已知的擴增法，例如聚合酶鏈式反應(PCR，美國專利第4,683,195號、第4,683,202號和第4,800,159號)、鏈置換擴增(SDA，JP-B7-114718)、自動維持序列擴增(3SR)、基於核酸序列的擴增(NASBA，日本專利第2650159號)、轉錄介導擴增(TMA)以及核酸的等溫嵌合引物起始的擴增(ICAN，WO 00/56877)。在這樣的方法中，可以通過用本發明的核苷酸作為引物來合成與作為模板的DNA鏈互補的DNA，檢測靶核酸中的鹼基置換。
如果採用上述核酸擴增法來實施本發明用於檢測鹼基置換的方法，則使用本發明的核苷酸作為在所述方法中所使用的引物中的至少一種，在所述反應系統中包括適用於所述核苷酸的核酸酶。
按照採用如上所述的核酸擴增反應來檢測鹼基置換，可以根據通過所述反應的特異性擴增產物的產生，測定鹼基置換的存在。雖然並不打算限制本發明，但是對於所產生的擴增產物，可以使用例如凝膠電泳、使用具有與擴增產物互補的序列的探針的雜交、使用螢光標記核苷酸的螢光偏振法、TaqMan法等。另外，也可以使用適用於相應基因擴增法的檢測反應。
當使用本發明的檢測方法在基因組水平上分析鹼基置換時，可以使得反應系統的體積更小且可以結合使用提高集成程度的裝置，以便分析大量的鹼基序列。其中通過使用最近的超精細加工技術集成了本發明的檢測方法或分析方法的基本過程(例如從細胞提取DNA、核酸擴增反應、目標DNA的檢測等)的幾平方釐米至指尖大小的微晶片可以結合使用作為這樣的裝置。任選的是，可以結合凝膠電泳或毛細管電泳及與檢測探針的雜交的過程。這樣一種系統被稱為微晶片—毛細管電泳(CE)微晶片或納米晶片。
任何核酸擴增反應都可以用於這樣的系統，只要目標DNA片段使用所述反應來擴增。雖然並不打算限制本發明，但是例如可以優選使用可以用來在等溫條件下擴增核酸的方法，例如ICAN法。由於聯合使用這樣一種方法可以簡化所述系統，因而所述方法非常優選用於如上所述的集成系統。此外，利用按照本發明的技術，可以構建更高度集成的系統。
通過在本發明的核苷酸中包括經修飾的核苷酸和/或通過在本發明的方法中適當調節反應溫度，可以改進檢測鹼基置換的特異性。
具有標記的如以上(1)中所述的本發明核苷酸可以促進證實DNA延伸反應的存在，並且可用於本發明用於檢測鹼基置換的方法中。在這種情況下，延伸反應的存在通過適用於標記的如上所述的方法檢測來源於所述核苷酸的標記物質加以證實。
例如，如果使用連接了螢光物質的本發明核苷酸並且如果將所述標記與用作引物的部分連接，則可以利用螢光檢測延伸產物。如果將標記連接於位於核苷酸中的核酸酶切割位點3』的部分，則由於DNA聚合酶或類似酶的5』→3』外切核酸酶活性，而將所述片段轉變為更小的分子等，根據3』片段與靶核酸的解離，可以檢測延伸反應的存在。對於涉及螢光標記核苷酸分子量變化的這樣的實施方案，優選使用螢光偏振法。
如果使用通過連接螢光物質和具有猝滅來自螢光物質發射的螢光的作用致使不發射螢光的物質而標記本發明的核苷酸，則在延伸反應起始的同時發射螢光。因此，可以非常容易地檢測鹼基置換。
在上述相應的實施方案中，通過利用在對應於待檢測鹼基置換的位點的位置上分別具有腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)以及可辨別的不同標記的核苷酸，人們可以獲得有關存在鹼基置換的信息，並且同時獲得置換鹼基類型的信息。
本發明的核苷酸可以用於PCR中，以檢測鹼基置換。在這種情況下，用本發明的核苷酸取代PCR引物的其中一種，還將適用於所述核苷酸的核酸酶加入到正常反應混合物中，供PCR用。通過選擇在所述條件下不失活的核酸酶進行PCR，可以高靈敏度地檢測鹼基置換。
包括人在內的高等動物的細胞通常都是具有一對染色體的二倍體。因此，當染色體上的特定鹼基可能存在鹼基置換時，則有如下的三種可能的情況純合子(純合型)，其中細胞的兩條染色體均沒有鹼基置換；純合子(純合型)，其中兩條染色體上均存在鹼基置換；和雜合子(雜合型)，其中僅一條染色體具有鹼基置換。
通過將本發明用於檢測鹼基置換的方法用於從二倍體細胞製備的核酸樣品，檢查所述二倍體細胞或具有所述細胞的個體的基因型對於基因中的特定鹼基是純合型還是雜合型是可能的。雖然並不打算限制本發明，但是例如當用對應於四種類型的鹼基並且如果沒有錯配則被切割的核苷酸實施本發明的方法時，對於來源於基因型為雜合型的細胞的核酸樣品，核苷酸由於核苷酸被切割而檢測到兩種核苷酸的信號。另一方面，對於來源於基因型為純合型的細胞的核酸樣品，僅檢測到一種核苷酸的信號。另外，同時測定所述純合型有無鹼基置換是可能的。如上所述，本發明的方法可用來檢測等位基因中的鹼基置換。
(3)本發明用於檢測鹼基置換的試劑盒本發明提供用於如上所述按照本發明檢測鹼基置換的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒含有本發明的核苷酸。它可以含有一組分別含有四種類型的鹼基之一的核苷酸，所述核苷酸可以用來測定鹼基置換的存在，並且同時測定被置換鹼基的類型。此外，所述試劑盒可以含有適用於所述核苷酸的核酸酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶的底物(dNTP)、適用於反應的緩衝液等。或者，所述試劑盒可以含有用於檢測引物-延伸產物的試劑。優選含有用於製備核酸擴增法中所使用的反應混合物的試劑的試劑盒，作為用於結合核酸擴增法檢測鹼基置換的試劑盒。
實施例以下實施例更詳細地說明本發明，但不應解釋為限制本發明的範圍。
參比實施例1激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)RNA酶HII基因的克隆(1)從激烈熱球菌製備基因組DNA將含有1％胰蛋白腖(Difco Laboratories)、0.5％酵母膏(DifcoLaboratories)、1％可溶性澱粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jmarine S Solid(Jmarine Laboratory)、0.5％Jmarine S Liquid(Jamarine Laboratory)、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppmKAl(SO4)2、0.1ppm H3BO4、0.1ppm Na2MoO4·2H2O和0.25ppmNiCl2·6H2O的2L培養基置於2 L培養瓶中，於120℃滅菌20分鐘，通入氮氣，以除去溶解氧。然後在培養基中接種激烈熱球菌(從德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Microorganismen)購買；DSM3638)，於95℃不振蕩培養16小時。培養後，通過離心收集細胞。
然後將所得細胞懸浮於4ml 25％蔗糖、50mM Tris-HCl(pH8.0)中。向其中加入0.4ml 10mg/ml氯化溶菌酶(lysozyme chloride)(NacalaiTesque)的水溶液。讓混合物於20℃反應1小時。反應後，向反應混合物中加入含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM Tris-HCl(pH8.0)的24ml混合物、0.2ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和2ml 10％十二烷基硫酸鈉水溶液。將混合物於37℃溫育1小時。
反應後，混合物經過苯酚-氯仿抽提，然後乙醇沉澱，製備約1mg基因組DNA。
(2)RNA酶HII基因的克隆Pyrococcus horikoshii的完整基因組序列已經發表[DNA Research，555-76(1998)]。已知在基因組中存在一個編碼RNA酶HII同源物的基因(PH1650)(SEQ ID NO1，National Institute of Technology andEvaluation: http://www/nite.gojp/的主頁)。
搜索了PH1650基因(SEQ ID NO1)和激烈熱球菌的部分發表的基因組序列(University of Utah，Utah Genome Centerhttp://www.genome.utah.edu/sequence.html的主頁)之間的同源性。結果，發現一個高度同源的序列。
根據所述同源序列，合成引物1650Nde(SEQ ID NO2)和1650Bam(SEQ ID NO3)。
用參比實施例1-(1)中獲得的200ng激烈熱球菌DNA作為模板，用20pmol 1650Nde和20pmol 1650Bam作為引物，在100μl體積中進行PCR。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)作為DNA聚合酶，按照所附的方案進行PCR。如下進行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘，進行30個循環。約0.7kb的擴增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。將所得的DNA片段插入到質粒載體pET3a(Novagen)的NdeI位點和BamHI位點之間，製備質粒pPFU220。
(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的鹼基序列的測定按照雙脫氧法，測定在參比實施例1-(2)中獲得的插入到pPFU220中的所述DNA片段的鹼基序列。
所測定的鹼基序列的分析表明，存在一個推定編碼RNA酶HII的可讀框。所述可讀框的鹼基序列示於SEQ ID NO4中。從所述鹼基序列導出的RNA酶HII的胺基酸序列示於SEQ ID NO5中。
用質粒pPFU220轉化的大腸桿菌JM109被命名和指定為大腸桿菌JM109/pPFU220，並且於2000年9月5日保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心(International Patent OrganismDepository，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan，保藏號為FERM P-18020以及以保藏號FERM BP-7654保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心，(轉至國際保藏機構的日期2001年7月9日)。
(4)經純化的RNA酶HII製劑的製備用參比實施例1-(2)中獲得的pPFU220轉化大腸桿菌HMS174(DE3)(Novagen)。將所得的帶有pPFU220的大腸桿菌HMS174(DE3)接種到含有100μg/ml氨苄青黴素的2L LB培養基中，於37℃振蕩培養16小時。培養後，將經離心收集的細胞懸浮於66.0ml超聲處理緩衝液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺醯氟]中，進行超聲處理。將通過超聲處理懸浮液以12,000rpm離心10分鐘而獲得的上清液於60℃加熱15分鐘。然後再次以12,000rpm離心10分鐘，以收集上清液。從而獲得61.5ml熱處理上清液。
將所述熱處理上清液經過用緩衝液A[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系統(Amersham Pharmacia Biotech)進行色譜分離。結果，RNA酶HII流過RESOURSE Q柱。
將60.0ml所述流通RNA酶HII流分經過用緩衝液A平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系統，以0-500mM NaCl線性梯度洗脫。獲得用約150mM NaCl洗脫出的含RNA酶HII的流分。
用Centricon-10(Amicon)，通過超濾濃縮2.0ml所述RNA酶HII流分。將250μl所述濃縮液經過用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的Superdex 200凝膠過濾柱(AmershamPharmacia Biotech)，用同一種緩衝液洗脫。結果，RNA酶HII在相當於17千道爾頓分子量的位置洗脫出來。這一分子量對應於單體形式的RNA酶HII的分子量。
將洗脫出的RNA酶HII用作PfuRNA酶HII製劑。如下測定如此獲得的Pfu RNA酶HII製劑的RNA酶H活性。
將10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM二硫蘇糖醇(Nacalai Tesque)、0.003％牛血清白蛋白(fraction V，Sigma)、4％甘油、20μg/ml poly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)和30μg/ml poly(rA)(AmershamPharmacia Biotech)混合在一起。讓混合物於37℃保溫10分鐘，用作供測量RNA酶H活性用的底物溶液。
加入1μl 1M MnCl2至100μl底物溶液中。讓混合物於40℃保溫。加入適當稀釋的PfuRNA酶HII製劑至所述混合物中，以起始反應。於40℃反應30分鐘後，加入10μl 0.5M EDTA以終止反應。然後測量260nm的吸光度。
結果，加入Pfu RNA酶HII製劑的反應混合物的260nm的吸光度值，高於在加入Pfu RNA酶HII製劑之前加入10μl 0.5M EDTA的反應混合物的吸光度值。因此，表明該製劑具有RNA酶H活性。
(5)經純化的RNA酶H活性的測量(a)所用試劑溶液的製備供測定活性用的反應混合物在無菌水中含有指定終濃度的以下物質40mM Tris-HCl(pH7.7，37℃)、4mM氯化鎂、1mM DTT、0.003％BSA、4％甘油和24μM poly(dT)。
Poly[8-3H]腺苷酸溶液將370 kBq Poly[8-3H]腺苷酸溶液溶於200μl無菌水中。
聚腺苷酸溶液用無菌超純水將聚腺苷酸稀釋至3mM的濃度。
酶稀釋液在無菌水中含有指定終濃度的以下物質25mMTris-HCl(pH7.5，37℃)、5mM 2-巰基乙醇、0.5mM EDTA(pH7.5，37℃)、30mM氯化鈉和50％甘油。
熱變性小牛胸腺DNA的製備將200mg小牛胸腺DNA懸浮於100ml TE緩衝液中並讓其溶脹。基於在UV 260nm下測量的吸光度，用無菌超純水將溶液稀釋至1mg/ml的濃度。將所述稀釋液於100℃加熱10分鐘，然後在冰浴中快速冷卻。
(b)用於測量活性的方法加入7μl Poly[8-3H]腺苷酸溶液至以上(a)中製備的測定活性用的985μl反應混合物中。讓混合物於37℃保溫10分鐘。加入8μl聚腺苷酸至混合物中，使終濃度為24μM。再讓混合物於37℃保溫5分鐘。如此製備了1000μl Poly[8-3H]rA-poly-dT反應混合物。然後將200μl反應混合物於30℃保溫5分鐘。向其中加入1μl酶溶液的適當連續稀釋液。在規定時間內從反應混合物中取出每種樣品50μl，用於隨後的測量。將按分鐘計從加入酶至取樣的時間定義為Y。加入1μl所述酶稀釋液以取代酶溶液，製備總CPM或空白的50μl反應混合物。向樣品中加入100μl 100mM焦磷酸鈉、50μl熱變性小牛胸腺DNA溶液和300μl 10％三氯乙酸(對於測量總CPM，300μl超純水)。讓混合物於0℃保溫5分鐘，然後以10000rpm離心10分鐘。離心後，將250μl所得上清液置於小瓶中。向其中加入10ml Aqausol-2(NEN Life ScienceProducts)。在液體閃爍計數器中測量CPM。
(c)單位的計算按照以下公式計算每種酶的單位值單位/ml＝{(測量的CPM-空白CPM)×1.2*×20×1000×稀釋率}200(μl)/(總CPM×Y(min)×50(μl)×9**)1.2*每50μl總CPM中所含有的Poly[8-3H]rA-poly-dT量(nmol)9**校正係數。
參比實施例2得自閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)的RNA酶HII基因的克隆(1)從閃爍古生球菌製備基因組DNA將從8ml培養物收集的閃爍古生球菌(從德意志微生物和細胞保藏中心購買；DSM4139)細胞懸浮於100μl 25％蔗糖、50mM Tris-HCl(pH8.0)中。加入20μl 0.5M EDTA和10μl 10mg/ml氯化溶菌酶(Nacalai Tesque)的水溶液。讓混合物於20℃反應1小時。反應後，向反應混合物中加入含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM Tris-HCl(pH8.0)的800μl混合物、10μl 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和50μl 10％十二烷基硫酸鈉水溶液。將混合物於37℃溫育1小時。反應後，混合物經過苯酚-氯仿抽提，然後乙醇沉澱並風乾，然後溶於50μl TE中，獲得基因組DNA溶液。
(2)RNA酶HII基因的克隆閃爍古生球菌的完整基因組序列已經發表[Klenk，H.P.等，Nature，390364-370(1997)]。已知存在一個編碼RNA酶HII同源物的基因(AF0621)(SEQ ID NO13，http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.htlm)。
根據AF0621基因(SEQ ID NO13)的序列，合成引物AfuNde(SEQID NO14)和AfuBam(SEQ ID NO15)。
用參比實施例2-(1)中製備的30ng閃爍古生球菌基因組DNA作為模板，用AfuNde和AfuBam各20pmol作為引物，在100μl體積中進行PCR。用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)作為DNA聚合酶，按照所附的方案進行PCR。如下進行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘，進行40個循環。約0.6kb擴增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。然後將所得的DNA片段插入到質粒載體pTV119Nd(一種其中pTV119N的NcoI位點被轉變為NdeI位點的質粒)的NdeI位點和BamHI位點之間，構建質粒pAFU204。
(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的鹼基序列的測定按照雙脫氧法，測定在參比實施例2-(2)中獲得的插入到pAFU204中的所述DNA片段的鹼基序列。
所測定的鹼基序列的分析揭示出一個推定編碼RNA酶HII的可讀框。所述可讀框的鹼基序列示於SEQ ID NO16中。從所述鹼基序列導出的RNA酶HII的胺基酸序列示於SEQ ID NO17中。
用質粒pAFU204轉化的大腸桿菌JM109被命名和指定為大腸桿菌JM109/pAFU204，並且於2001年2月22日保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan，保藏號為FERM P-18221以及以保藏號FERM BP-7691保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心(轉至國際保藏機構的日期2001年8月2日)。
(4)經純化的RNA酶HII製劑的製備用參比實施例2-(2)中獲得的pAFU204轉化大腸桿菌JM109。將所得的帶有pAFU204的大腸桿菌JM109接種到含有100μg/ml氨苄青黴素的2L LB培養基中，於37.℃振蕩培養16小時。培養後，將經離心收集的細胞懸浮於37.1ml超聲處理緩衝液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺醯氟]中，進行超聲處理。將通過超聲處理懸浮液以12,000rpm離心10分鐘而獲得的上清液於70℃加熱15分鐘。然後再次以12,000rpm離心10分鐘，以收集上清液。從而獲得40.3ml熱處理上清液。
將所述熱處理上清液經過用緩衝液A[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系統(Amersham Pharmacia Biotech)進行色譜分離。結果，RNA酶HII流過RESOURSE Q柱。
所述流通RNA酶HII流分經過用緩衝液A平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系統(Amersham PharmaciaBiotech)進行色譜分離。結果，RNA酶HII流過所述RESOURSE S柱。
將40.0ml所述流通RNA酶HII流分用2L含有50mM NaCl的緩衝液B[50mM Tris-HCl(pH7.0)、1mM EDTA]透析3次，每次透析2小時。將40.2ml透析過的酶溶液經過用含有50mM NaCl的緩衝液B平衡的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系統，以50-550mM NaCl線性梯度洗脫。結果，獲得用約240mM NaCl洗脫出的含RNA酶HII的流分。
用Centricon-10(Amicon)，通過超濾濃縮7.8ml所述RNA酶HII流分。將從約600μl所述濃縮液分離出的4個部分分別經過用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM Tris-HCl(pH7.0)平衡的Superose6凝膠過濾柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用同一種緩衝液洗脫。結果，RNA酶HII在相當於30.0千道爾頓分子量的位置洗脫出來。這一分子量對應於單體形式的RNA酶HII的分子量。
將如上所述洗脫出的RNA酶HII用作Afu RNA酶HII製劑。
按照參比實施例1-(5)中所述的方法，用如此獲得的Afu RNA酶HII製劑測定酶活性。結果，觀察到所述Afu RNA酶HII製劑的RNA酶H活性。
如下計算以下實施例中耐熱性RNA酶H的單位值。
將1mg poly(rA)或poly(dT)(都得自Amersham Pharmacia Biotech)溶於含有1mM EDTA的1ml 40mM Tris-HCl(pH7.7)中，製備poly(rA)溶液和poly(dT)溶液。
然後加入poly(rA)溶液(至終濃度為20μg/ml)和poly(dT)溶液(至終濃度為30μg/ml)至含有4mM MgCl2、1mM DTT、0.003％BSA和4％甘油的40mM Tris-HCl(pH7.7)中。讓混合物於37℃反應10分鐘，然後冷卻至4℃，製備poly(rA)-poly(dT)溶液。加入1μl適當稀釋的酶溶液至100μl所述poly(rA)-poly(dT)溶液中。讓混合物於40℃反應10分鐘。向其中加入10μl 0.5M EDTA，以終止反應。然後測量260nm的吸光度。作為對照，加入10μl 0.5M EDTA至反應混合物中，讓所得混合物於40℃反應10分鐘，然後測量吸光度。通過從無EDTA時反應物的吸光度中減去對照的吸光度，獲得一個數值(吸光度之差)。因此，基於所述吸光度之差，測量由於所述酶促反應從poly(rA)-poly(dT)雜合體中釋放的核苷酸的濃度。一個單位的RNA酶H定義為按照以下公式計算、增加相當於在10分鐘內釋放1nmol核糖核苷酸的A260的酶量單位＝[吸光度之差×反應體積(ml)/0.0152×(110/100)×稀釋率]實施例1人c-Ki-ras基因中鹼基置換的檢測(1)模板的製備製備分別具有人c-Ki-ras外顯子1中12號密碼子的序列GGT(Gly)、CGT(Arg)、TGT(Cys)或AGT(Ser)的DNA片段。簡而言之，將使用對應於ras Mutant Set c-Ki-ras 12號密碼子(Takara Shuzo)和rasGene Primer Set c-Ki-ras/12(Takara Shuzo)中的上述密碼子的模板DNA通過PCR獲得的擴增產物，克隆到載體pT7-Blue(Novagen)中。用如此獲得的重組質粒作為模板，使用M13引物M4和RV(都得自TakaraShuzo)，進行PCR。回收所得的擴增片段，分別命名為模板12G、12R、12C和12S。
(2)鹼基置換的檢測基於人c-Ki-ras外顯子1的鹼基序列，合成了具有SEQ ID NO7-9的鹼基序列、作為正向核苷酸供特異性地檢測模板12G用的三種嵌合寡核苷酸。每種嵌合寡核苷酸3』端核苷酸的核糖部分3-位上的羥基用氨基己基修飾。每種所述核苷酸都具有與人c-Ki-ras外顯子1的鹼基序列互補的序列，其中12號密碼子編碼Gly。合成了具有SEQ IDNO6的鹼基序列的寡核苷酸作為反義引物，供核酸擴增用。
製備含有正向核苷酸和反義引物各50pmol、1μl 0.25％丙二胺水溶液和1pg模板12G、12C、12R和12S之一作為模板的5μl總體積的反應混合物。通過在Thermal Cycler Personal(Takara Shuzo)中於98℃加熱2分鐘，然後於53℃加熱，使正向核苷酸和反義引物退火至所述模板上。向所述熱處理混合物中加入20μl含有0.625mM dNTP混合物、40mM Hepes-KOH緩衝液(pH7.8)、125mM乙酸鉀、5mM乙酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲基亞碸、16U在參比實施例1中描述的Pfu RNA酶HII、5.5U BcaBest DNA聚合酶(Takara Shuzo)和無菌水的混合物，使終體積為25μl。讓反應混合物於53℃保溫1小時。反應後，將每種反應混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結果示於圖1中。如圖1-1、圖1-2和圖1-3所示，將使用模板12G、12C、12R和12S的反應混合物分別上樣至所述瓊脂糖凝膠中的第1-4泳道。圖1-1、圖1-2和圖1-3分別顯示在反應中使用SEQ ID NO7、8和9的核苷酸的反應結果。
如圖1所示，使用SEQ ID NO7-9的核苷酸，僅當使用模板12G時才觀察到擴增產物，換句話說，當靶核酸的12號密碼子編碼Gly時才觀察到擴增產物。這些結果表明，通過使用本發明的核苷酸，可以鑑別靶核酸中的鹼基置換。此外，證明特異性擴增可以通過使用含有肌甘的核苷酸得到改進。
實施例2c-Ki-ras 12號密碼子的其它等位基因的檢測根據實施例1的結果，合成了具有SEQ ID NO10-12的鹼基序列的嵌合寡核苷酸，作為能夠特異性地鑑別實施例1-(1)中製備的12R、12C和12S中12號密碼子的鹼基的核苷酸。SEQ ID NO10、11和12分別顯示對應於其中12號密碼子編碼Cys、Arg和Ser的等位基因的鹼基序列。每種核苷酸3』端核苷酸的核糖部分3-位上的羥基用氨基己基修飾。使用這些核苷酸和SEQ ID NO6的反義引物，在實施例1-(2)中描述的反應條件下進行反應。反應後，將每種反應混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結果示於圖2中。如圖2-1、圖2-2和圖2-3所示，將使用模板12G、12C、12R和12S的反應混合物分別上樣至所述瓊脂糖凝膠中的第1-4泳道。圖2-1、圖2-2和圖2-3分別顯示在反應中使用SEQ ID NO10、11和12的核苷酸的反應結果。
如圖2所示，分別僅當結合使用SEQ ID NO10、11和12的核苷酸和模板12C、12R和12S時才觀察到特異性擴增產物。因而，本發明的核苷酸可以精確鑑別目標鹼基。此外，證明特異性擴增可以通過使用含有肌甘的寡核苷酸得到改進。
實施例3基因組DNA的等位基因特異性DNA擴增在如以上(2)中描述的條件下進行反應。在反應中，使用150ng或30ng人類基因組DNA(Clontech)(對其已經證實c-Ki-ras外顯子1中的12號密碼子編碼Gly(GGT))、SEQ ID NO7、10、11和12的核苷酸(分別對應於12號密碼子的Gly、Cys、Arg和Ser)(在實施例1和實施例2中，已經證明所述核苷酸能夠特異性地檢測12號密碼子的四個等位基因)以及SEQ ID NO6的反義引物。反應後，將每種反應混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結果示於圖3中。
如圖3-1、圖3-2和圖3-3所示，將使用SEQ ID NO7、10、11和12的核苷酸的反應混合物，分別上樣至所述瓊脂糖凝膠中的第1-4泳道。圖3-1和圖3-2分別顯示在反應中使用150ng和30ng人類基因組DNA的反應結果。
如圖3所示，僅當使用SEQ ID NO7的核苷酸時才觀察到DNA片段的擴增，與人類基因組DNA的量無關，而使用其它核苷酸沒有觀察到DNA片段的擴增。這些結果證明，本發明用於檢測鹼基置換的方法可以用於檢測基因組DNA中的特定等位基因。
實施例4使用不同RNA酶H的檢測檢查在如實施例1中描述的檢測鹼基置換中使用不同RNA酶H。
具體地說，使用如參比實施例2中描述的Afu RNA酶HII或MjaRNA酶HII取代Pfu RNA酶HII，Mja RNA酶HII得自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannashi)，如Structure，8897-904中所述的方法製備。使用SEQ ID NO7的核苷酸作為正向核苷酸，用SEQ ID NO6的寡核苷酸作為反義引物，在如實施例1中描述的條件下進行反應。反應後，將每種反應混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結果示於圖4中。如圖4-1和圖4-2所示，將使用模板12G、12C、12R和12S的反應混合物分別上樣至所述瓊脂糖凝膠中的第1-4泳道。圖4-1和圖4-2分別顯示在反應中使用Afu RNA酶HII和Mja RNA酶HII的反應結果。
如圖4所示，使用Afu RNA酶HII和Mja RNA酶HII，僅當使用模板12G時才觀察到擴增產物，換句話說，當所述靶核酸的12號密碼子編碼Gly時才觀察到擴增產物。這些結果表明，靶核酸中的鹼基置換可以用這些RNA酶H來鑑別。
實施例5用需要變性步驟的DNA擴增反應系統(PCR)檢測SNP用需要變性步驟的DNA擴增反應系統檢查本發明的方法。基於人c-Ki-ras外顯子1的鹼基序列，合成了SEQ ID NO25的嵌合寡核苷酸作為有義核苷酸，供特異性地檢測模板12G用。所述核苷酸3』端核苷酸的核糖部分3-位上的羥基用氨基己基修飾。也合成了具有SEQ IDNO18的鹼基序列的引物作為反義引物。製備含有所述合成核苷酸和引物(有義核苷酸和反義引物)各50pmol、2.5μl Ex Taq緩衝液(TakaraShuzo)、2μl 2.5mM dNTP混合物、50U Afu RNA酶HII和0.625U ExTaq DNA聚合酶(Takara Shuzo)的24μl總體積的反應混合物。向反應混合物中加入實施例1中製備的1μl 10ng/μl模板12G、12C、12R或12S的溶液。採用Thermal Cycler(Takara Shuzo)，如下進行PCR94℃5秒、59℃2分鐘和72℃5秒，進行25個或30個循環。在反應後，採用Agilent 2100 Bioanalyzer(Hewlett-Packard)，分析1μl每種反應混合物。結果示於圖5中。圖5是一幅曲線圖，圖示說明相應模板的目標擴增產物的量。縱軸代表目標擴增產物的量，橫軸代表PCR循環數。如圖5所示，僅當使用等位基因與檢測用引物相符的模板12G時才觀察到目標DNA的特異性擴增。因而，證明本發明的方法對於需要使作為模板的核酸變性的步驟的DNA擴增反應系統而言也是有效的。
實施例6K-ras 61號密碼子的等位基因特異性檢測檢查另一鹼基置換的檢測。具體地說，將分別具有使用SEQ IDNO19和20的DNA引物通過PCR擴增的人c-Ki-ras外顯子2中61號密碼子的序列CAA(Glu)、AAA(Lys)或GAA(Gln)的DNA片段克隆到載體pT7-Blue中。按照常規方法純化克隆了DNA片段的載體，分別命名為61Q、61K和61E。根據實施例1-(2)的結果，基於人c-Ki-ras外顯子2的鹼基序列，合成了SEQ ID NO21、22和23的嵌合寡核苷酸，作為供特異性地檢測相應載體61Q、61K和61E用的核苷酸。每種核苷酸3』端核苷酸的核糖部分3-位上的羥基都用氨基己基修飾。用所述核苷酸作為有義引物，用SEQ ID NO24的引物作為反義引物，進行以下的反應。製備含有所述合成寡核苷酸引物(有義引物和反義引物)各50pmol、1μl 0.05％丙二胺水溶液和10pg模板DNA 61Q、61K和61E之一的5μl總體積的反應混合物。通過在Thermal Cycler Personal(Takara Shuzo)中於98℃加熱2分鐘，然後於53℃加熱，使所述引物退火至所述模板上。向所述熱處理混合物中加入20μl含有0.625mMdNTP混合物、40mM Hepes-KOH緩衝液(pH7.8)、125mM乙酸鉀、5mM乙酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲基亞碸、11 UAfuRNA酶HII(Takara Shuzo)、5.5UBcaBest DNA聚合酶(Takara Shuzo)和無菌水的混合物，使終體積為25μl。讓反應混合物於58℃保溫1小時。反應後，將每種反應混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結果示於圖6中。圖6A是一幅電泳譜圖，代表用SEQ ID NO21的檢測61Q用引物進行檢測的結果。第1、2和3泳道分別代表用模板61Q、61K和61E作為模板獲得的結果。圖6B是一幅電泳譜圖，代表用SEQ IDNO22的檢測61K用引物進行檢測的結果。第1、2和3泳道分別代表使用模板61Q、61K和61E獲得的結果。圖6C是一幅電泳譜圖，代表用SEQ ID NO23的引物檢測61E的檢測結果。第1、2和3泳道分別代表用模板61Q、61K和61E獲得的結果。
如圖6A、圖6B和圖6C所示，證明使用SEQ ID NO21、22和23，以等位基因特異性方式，通過ICAN反應獲得目標DNA擴增產物。因而，證明本發明的方法當改變目的鹼基置換時也是有效的。
實施例7CYP2C19(636)的等位基因特異性檢測(1)檢查區分基因純合型和雜合型的檢測方法。選擇人CYP2C19中第636號鹼基的等位基因作為研究對象。首先，將使用SEQ ID NO26和27的DNA引物通過PCR擴增的、人CYP2C19中第636號鹼基為G或A的DNA片段克隆到載體pT7-Blue中。按照常規方法純化克隆這些DNA片段的質粒，命名為636G和636A。
用質粒636G和636A以及通過將質粒636G和636A以1:1混合而製備的質粒636G/A作為模板。質粒636G和636A用作基因純合型的模型，而質粒636G/A用作基因雜合型的模型。接著，合成了SEQ IDNO28和29的核苷酸，分別作為供特異性地檢測636G和636A用的核苷酸。用所述核苷酸作為有義引物，用SEQ ID NO30的引物作為反義引物，進行以下的反應。製備含有所述合成寡核苷酸引物(有義引物和反義引物)各50pmol、1μl 0.05％丙二胺水溶液和1pg質粒636G、636A和636G/A之一作為模板DNA的5μl總體積的反應混合物。通過在Thermal Cycler Personal(Takara Shuzo)中於98℃加熱2分鐘，然後於53℃加熱，使所述引物退火至所述模板上。向所述熱處理混合物中加入20μl含有0.625mM dNTP混合物、40mM Hepes-KOH緩衝液(pH7.8)、125mM乙酸鉀、5mM乙酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲基亞碸、11U Afu RNA酶HII、5.5UBcaBest DNA聚合酶和無菌水的混合物，使終體積為25μl。讓反應混合物於53℃保溫1小時。反應後，將每種反應混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結果示於圖7A和7B中。圖7A是一幅電泳譜圖，代表使用核苷酸636G進行檢測的結果。第1、2和3泳道分別代表用質粒636G、636A和636G/A作為模板獲得的結果。
圖7B是一幅電泳譜圖，代表使用核苷酸636A進行檢測的結果。第1、2和3泳道分別代表用質粒636G、636A和636G/A作為模板獲得的結果。如圖7A和圖7B所示，證明可以使用所述核苷酸以等位基因特異性方式進行檢測。
(2)在與PCR-RFLP進行比較時用人類基因組DNA作為模板以進行分析。用150ng人類基因組DNA(Clontech)作為模板，如以上(1)中所述的方法進行SNP分型。結果示於圖7C中。圖7C是一幅電泳譜圖，代表人類基因組DNA SNP分型的結果。第1和2泳道分別代表使用核苷酸636G和636A獲得的結果。
如圖7C所示，僅當使用核苷酸636G時才檢測到擴增的目標DNA。所述基因組DNA的CYP2C19中第636號鹼基的等位基因被確定是純合型(636G/G)。
另一方面，使用人類基因組DNA，通過PCR-RFLP進行分型。使用150ng所述基因組DNA以及SEQ ID NO26和27的引物進行PCR。所得PCR擴增產物用BamHI處理，將反應混合物在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結果示於圖7D中。圖7D是一幅電泳譜圖，代表用人類基因組DNA作為模板通過PCR-RFLP分型的結果。第1和2泳道分別代表PCR擴增產物和用BamHI消化的PCR擴增產物的結果。
如圖7D所示，PCR擴增產物被BamHI完全消化。因而，所述基因組DNA的CYP2C19中第636號鹼基的等位基因，根據PCR-RFLP也被確定是純合型(636G/G)。證明採用本發明用於檢測鹼基置換的方法獲得的結果，與採用常規的通過PCR-RFLP進行SNP分型獲得的結果相一致。
(3)使用以上(1)中製備的質粒636G、636A和636G/A，檢查假定同源染色體基因型的檢測方法。如下進行反應。首先，合成了在5』末端上連接了可相互鑑別的螢光標記Rox(ABI)和Fam(ABI)的核苷酸636G和636A。使用含有等量的所述螢光標記核 苷酸的混合物。如以上(1)中所述的方法進行檢測。反應後，將每種反應混合物的一部分在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳，使擴增產物和未反應的螢光標記核苷酸完全分離。電泳後，用FM-BIO II Multi-View(Takara Shuzo)對所述瓊脂糖凝膠進行分析。結果，當用質粒636G作為模板時，僅觀察到來自螢光標記Rox的螢光信號。當用質粒636A作為模板時，僅觀察到來自螢光標記Fam的螢光信號。此外，當用質粒636G/A作為模板時，觀察到來自Rox和Fam兩者的螢光信號。根據這些結果，證明本發明的方法可用作可以用來分析同源染色體上基因型(純合型或雜合型)的方法。
實施例8用從全血提取的基因組DNA進行分型在徵得同意後從健康個體收集的全血樣品1-6號各200μl，用Dr.GenTLETM(Takara Shuzo)製備基因組DNA。用160ng所製備的基因組DNA作為模板以及用SEQ ID NO28和29的核苷酸作為引物，如實施例7-(1)中所述的方法進行SNP分型，以特異性地檢測等位基因636G和636A。結果示於圖8A-F中。圖8A-F是電泳譜圖，代表使用從血樣1-6號中提取的基因組DNA作為模板如實施例7-(1)中所述的方法進行分型的結果。第1和2泳道分別代表用SEQ ID NO28的核苷酸(用於檢測636G)和SEQ ID NO29的核苷酸(用於檢測636G)獲得的結果。基於如圖8A-F所示的擴增產物的譜圖，對於CYP2C19中第636號鹼基而言，相應血樣的等位基因分型如下(1G/A，2G/G，3G/A，4G/G，5G/G，6G/G)。另一方面，用同一基因組DNA作為模板，如實施例7-(2)中所述的方法通過PCR-RFLP進行分型。結果示於圖8G中。圖8G是一幅電泳譜圖，代表使用從血樣1-6號中製備的基因組DNA作為模板通過PCR-RFLP進行分型的結果。第1-6泳道分別代表用從血樣1-6號中提取的基因組DNA作為模板獲得的結果。圖8G顯示用相應的人血樣製備的DNA作為模板獲得的PCR擴增產物的切割譜圖，基於如圖8G所示的電泳結果，CYP2C19中第636號鹼基的等位基因分型如下(1G/A，2G/G，3G/A，4G/G，5G/G，6G/G)，所述結果與上述結果相一致。
如上所述，證明本發明的方法當使用實際臨床試樣時也是有效的。
工業應用性如上所述，本發明的核苷酸和使用所述核苷酸檢測鹼基置換的方法可用於檢測天然存在的或人工引入的鹼基置換。
按照本發明，可以便捷而可再現地檢測靶核酸中鹼基置換的存在。本發明的方法可以容易地與已知的核酸擴增法結合使用，並且可以用來高靈敏度地檢測鹼基置換。此外，通過結合使用具有合適序列的核苷酸，有可能獲得有關存在鹼基置換的信息，並且同時獲得有關被置換鹼基類型的信息。
本發明可用來檢測或鑑定生物體基因組DNA中所產生的鹼基置換(例如SNP)，例如多態性或變異。因而，本發明可用於基因組藥物開發領域和基因組醫學領域，以搜索人類的疾病基因，分析藥物抗性等。
序列表的獨立文本SEQ ID NO1編碼得自Pyrococcus horikoshii、具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO2PCR引物1650Nde，用於從激烈熱球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO3PCR引物1650Bam，用於從激烈熱球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO6嵌合寡核苷酸引物，用於擴增人c-Ki-ras基因的一部分的DNA。「核苷酸18-20為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸」SEQ ID NO7嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」SEQ ID NO8嵌合寡核苷酸引物前體，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸12-15為核糖核苷酸，核苷酸17為肌苷，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」SEQ ID NO9嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸14和15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」SEQ ID NO10嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」SEQ ID NO11嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」SEQ ID NO12嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，核苷酸17為肌苷，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」SEQ ID NO13得自閃爍古生球菌的AF0621基因的鹼基序列。
SEQ ID NO14PCR引物AfuNde，用於從閃爍古生球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO15PCR引物AfuBam，用於從閃爍古生球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO16得自閃爍古生球菌的RNA酶HII中ORF的鹼基序列。
SEQ ID NO17得自閃爍古生球菌的RNA酶HII的胺基酸序列。
SEQ ID NO18設計的PCR引物，用於擴增c-Ki-ras癌基因外顯子1的一部分。
SEQ ID NO19設計的PCR引物，用於擴增人c-Ki-ras癌基因外顯子2的一部分。
SEQ ID NO20設計的PCR引物，用於擴增人c-Ki-ras癌基因外顯子2的一部分。
SEQ ID NO21嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」
SEQ ID NO22嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」SEQ ID NO23嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」SEQ ID NO24嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸17-19為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸」SEQ ID NO25嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸16-18為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」SEQ ID NO26設計的PCR引物，用於擴增人CYP2C19基因的一部分。
SEQ ID NO27設計的PCR引物，用於擴增人CYP2C19基因的一部分。
SEQ ID NO28嵌合寡核苷酸，用於檢測人CYP2C19基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」SEQ ID NO29嵌合寡核苷酸，用於檢測人CYP2C19基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」SEQ ID NO30嵌合寡核苷酸引物，用於擴增人CYP2C19基因上的一部分。「核苷酸19-21為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸」
序列表110寶酒造株式會社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)120核苷酸取代的檢測方法130663051150JP 2001-392681512001-02-15150JP 2001-407211512001-02-16150JP 2001-1010551512001-03-30150JP 2001-1773811512001-06-12150JP 2001-2903841512001-09-25150JP 2001-3384401512001-11-02150JP 2001-3689291512001-12-03160302101211663212DNA213Pyrococcus horikoshii
4001atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660tga663210221133212DNA213人工序列220
223PCR引物1650Nde，用於從激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因4002caggaggaga gacatatgaa aataggggga att 33210321133212DNA213人工序列220
223PCR引物1650Bam，用於從激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因4003
gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta 332104211672212DNA213激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)4004atgaaaatag ggggaattga cgaagcagga agaggaccag cgatagggcc attagtagta 60gctactgtcg tcgttgatga gaaaaacatt gagaagctca gaaacattgg agtaaaagac 120tccaaacaac taacacccca tgaaaggaag aatttatttt cccagataac ctcaatagcg 180gatgattaca aaatagtgat agtatcccca gaagaaatcg acaatagatc aggaacaatg 240aacgagttag aggtagagaa gtttgctctc gccttaaatt cgcttcagat aaaaccagct 300cttatatacg ctgatgcagc ggatgtagat gccaatagat ttgcaagctt gatagagaga 360agactcaatt ataaggcgaa gattattgcc gaacacaagg ccgatgcaaa gtatccagta 420gtttcagcag cttcaatact tgcaaaggtt gttagggatg aggaaattga aaaattaaaa 480aagcaatatg gagactttgg ctctgggtat ccaagtgatc caaaaaccaa gaaatggctt 540gaagagtact acaaaaaaca caactctttc cctccaatag tcagacgaac ctgggaaact 600gtaagaaaaa tagaggaaag cattaaagcc aaaaaatccc agctaacgct tgataaattc 660tttaagaaac ct 6722105211224212PRT213激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)4005Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile1 5 10 15Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile20 25 30Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr35 40 45Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala50 55 60Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn65 70 75
Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu80 85 90Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp95 100 105Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg110 115 120Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp125 130 135Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val140 145 150Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp155 160 165Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu170 175 180Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg185 190 195Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala200 205 210Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro215 220210621120212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸引物，用於擴增人c-Ki-ras基因的一部分的DNA。「核苷酸18-20為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸」4006ctattgttgg atcatatucg20210721118212DNA213人工序列
220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」4007tggtagttgg agcuggtg 18210821118212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸12-15為核糖核苷酸，核苷酸17為肌苷，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」4008tggtagttgg agcuggng 18210921118212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸14和15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」4009tggtagttgg agcuggtg 182101021118
212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」40010tggtagttgg agcuugtg 182101121118212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」40011tggtagttgg agcucgtg 182101221118212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，核苷酸17為肌苷，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」40012tggtagttgg agcuagng 18
21013211626212DNA213閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)40013atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca 60ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag 120ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag 180gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag 240attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt 300gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg 360agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc 420atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc 480ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca 540ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag 600acgcttgacg atttctaaac gaaacc 6262101421130212DNA213人工序列220
223PCR引物AfuNde，用於從閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因40014aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg 302101521130212DNA213人工序列220
223PCR引物AfuBam，用於從閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因40015tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc 3021016211638212DNA213閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)40016catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt 60gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa 120aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg 180gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac 240gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat 300gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 63821017211205212PRT213閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)40017Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly1 5 10 15Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu20 25 30Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg35 40 45Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu50 55 60
Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala65 70 75Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile80 85 90Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val95 100 105Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu110 115 120Arg Val Val Ala Glu His Lys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val125 130 135Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile140 145 150Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala155 160 165Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser170 175 180Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser185 190 195Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe200 2052101821120212DNA213人工序列220
223設計的PCR引物，用於擴增c-ki-ras癌基因外顯子1的一部分40018ctattgttgg atcatattcg202101921119212DNA213人工序列
220
223設計的PCR引物，用於擴增人c-ki-ras癌基因外顯子2的一部分40019ttcctacgga agcaagtag192102021120212DNA213人工序列220
223設計的PCR引物，用於擴增人c-ki-ras癌基因外顯子2的一部分40020cacaaagaaa gccctcccca 202102121118212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」40021tcgacacagc aggucaag 182102221118212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-
15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」40022tcgacacagc agguaaag 182102321118212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」40023tcgacacagc aggugaag 182102421119212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸17-19為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸」40024acaaagaaag ccctcccca192102521121212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。「核苷酸16-18為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」40025ttgtggtagt tggagcuggt g212102621122212DNA213人工序列220
223設計的PCR引物，用於擴增人CYP2C19基因的一部分40026tattatctgt taactaatat ga 222102721120212DNA213人工序列220
223設計的PCR引物，用於擴增人CYP2C19基因的一部分40027acttcagggc ttggtcaata 202102821118212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人CYP2C19基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」40028gtaagcaccc ccuggatc 182102921118212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸，用於檢測人CYP2C19基因上的核苷酸取代。「核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，並且3』端核苷酸的3』-OH基團用氨基己基保護」40029gtaagcaccc ccugaatc 182103021121212DNA213人工序列220
223嵌合寡核苷酸引物，用於擴增人CYP2C19基因的-部分。「核苷酸19-21為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸」40030ttggtcaata tagaatttug g 2權利要求
1.一種用於檢測靶核酸中特定鹼基上存在鹼基置換的方法，所述方法包括(1)將含有靶核酸的樣品與一種核苷酸混合，其中所述核苷酸(A)在3』末端被修飾，致使不發生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定鹼基的區上的鹼基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產生一個新的3』末端；(2)用所述核酸酶和所述DNA聚合酶處理所述混合物；且(3)檢測所述核酸酶有無切割所述核苷酸。
2.權利要求1的方法，其中所述核酸酶是一種核糖核酸酶H，並且所述核苷酸在含有對應於所述特定鹼基的鹼基的區中含有核糖核苷酸。
3.權利要求1的方法，其中所述核酸酶是一種限制性酶，並且所述核苷酸在含有對應於所述特定鹼基的鹼基的區中含有所述限制性酶的識別序列。
4.一種用於檢測靶核酸中特定鹼基上存在鹼基置換的方法，所述方法包括(1)將含有靶核酸的樣品與一種核苷酸混合，其中所述核苷酸(A)在3』末端被修飾，致使不發生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定鹼基的區上的鹼基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產生一個新的3』末端；(2)用所述核酸酶和所述DNA聚合酶處理所述混合物；且(3)檢測所述核酸酶有無切割所述核苷酸。
5.權利要求4的方法，其中所述核酸酶是一種錯配特異性核酸酶。
6.權利要求1或4的方法，其中所述核苷酸具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中沒有鹼基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中不產生錯配。
7.權利要求1或4的方法，其中所述核苷酸具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中有鹼基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中不產生錯配。
8.權利要求1或4的方法，其中基於通過所述DNA聚合酶的作用產生的延伸產物的存在，檢測所述核苷酸的切割。
9.權利要求1或4的方法，其中基於通過所述核酸酶的作用從所述核苷酸釋放的3』部分的片段的存在，檢測所述核苷酸的切割。
10.權利要求1或4的方法，其中利用與所述核苷酸連接的標記化合物，檢測所述核苷酸的切割。
11.權利要求10的方法，其中所述標記化合物連接到所述核苷酸上位於所述核酸酶切割位點3』的部分中。
12.權利要求10的方法，其中所述標記化合物連接到所述核苷酸上位於所述核酸酶切割位點5』的部分中。
13.權利要求10的方法，其中與所述核苷酸連接的標記化合物是一種螢光物質。
14.權利要求13的方法，其中還將能夠猝滅螢光的物質與所述核苷酸連接，並且當所述核酸酶進行切割時發射螢光。
15.權利要求13的方法，其中所述核苷酸的切割通過螢光偏振法來檢測。
16.權利要求1或4的方法，其中所述核苷酸在3』末端的修飾是修飾核糖3-位上的羥基。
17.權利要求1或4的方法，其中所述核苷酸含有核苷酸類似物和/或經修飾的核苷酸。
18.權利要求17的方法，其中所述核苷酸類似物是脫氧核糖肌苷核苷酸或脫氧核糖尿嘧啶核苷酸，而所述經修飾的核糖核苷酸是(α-S)核糖核苷酸。
19.權利要求1或4的方法，所述方法還包括一個核酸擴增步驟，其中用通過所述DNA聚合酶的作用產生的延伸產物作為模板。
20.一種用於分析等位基因的基因型的方法，所述方法包括按照權利要求19所限定的方法來檢測靶核酸中特定鹼基上鹼基置換的存在。
21.一種用於檢測靶核酸中特定鹼基上鹼基置換的核苷酸，所述核苷酸(A)在3』末端被修飾，致使不發生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定鹼基的區上的鹼基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產生一個新的3』末端。
22.權利要求21的核苷酸，所述核苷酸在含有對應於所述特定鹼基的鹼基的區中含有核糖核苷酸，其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核糖核酸酶H切割。
23.權利要求21的核苷酸，所述核苷酸在含有對應於所述特定鹼基的鹼基的區中含有限制性酶的識別序列，其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸被所述限制性酶切割。
24.一種用於檢測靶核酸中特定鹼基上存在鹼基置換的核苷酸，所述核苷酸(A)在3』末端被修飾，致使不發生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定鹼基的區上的鹼基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間沒有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定鹼基與所述核苷酸中對應於所述特定鹼基的鹼基之間有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產生一個新的3』末端。
25.權利要求24的核苷酸，其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中在所述核苷酸和所述靶核酸之間有錯配，則所述核苷酸被錯配特異性核酸酶切割。
26.權利要求21或24的核苷酸，所述核苷酸具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中沒有鹼基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中不產生錯配。
27.權利要求21或24的核苷酸，所述核苷酸具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中有鹼基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構成的複合物中不產生錯配。
28.權利要求21或24的核苷酸，所述核苷酸連接了標記化合物。
29.權利要求28的核苷酸，其中所述標記化合物連接到所述核苷酸上位於所述核酸酶切割位點3』的部分中。
30.權利要求28的核苷酸，其中所述標記化合物連接到所述核苷酸上位於所述核酸酶切割位點5』的部分中。
31.權利要求28的核苷酸，其中所述標記化合物是一種螢光物質。
32.權利要求31的核苷酸，所述核苷酸還連接了能夠猝滅螢光的物質，其中當所述核酸酶進行切割或者所述切割後DNA延伸時發射螢光。
33.權利要求21或24的核苷酸，其中所述核苷酸在3』末端的修飾是修飾核糖3-位上的羥基。
34.權利要求21或24的核苷酸，所述核苷酸含有核苷酸類似物和/或經修飾的核苷酸。
35.權利要求34的核苷酸，其中所述核苷酸類似物是脫氧核糖肌苷核苷酸或脫氧核糖尿嘧啶核苷酸，而所述經修飾的核糖核苷酸是(α-S)核糖核苷酸。
36.一種用於檢測靶核酸中鹼基置換的試劑盒，所述試劑盒含有由權利要求21或24限定的核苷酸。
37.權利要求36的試劑盒，所述試劑盒含有核酸酶和/或DNA聚合酶。
38.權利要求36的試劑盒，所述試劑盒還含有供檢測存在DNA延伸用的試劑。
39.權利要求36的試劑盒，所述試劑盒還含有供實施核酸擴增法用的試劑。
全文摘要
本發明提供一種可用於檢測基因上核苷酸多態性的核苷酸；一種使用該核苷酸檢測鹼基上核苷酸多態性的方法；以及用於所述方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1524127SQ0280793
公開日2004年8月25日 申請日期2002年2月14日 優先權日2001年2月15日
發明者佐川裕章, 小林英二, 加藤鬱之進, 之進, 二 申請人:寶生物工程株式會社