利用ctk7a抑制組蛋白乙醯轉移酶及其方法

2023-04-30 16:36:56 2

專利名稱：利用ctk7a抑制組蛋白乙醯轉移酶及其方法
技術領域：
本公開涉及通過薑黃素衍生物，特別是CTK7A用於抑制組蛋白乙醯轉移酶的方法。本公開也涉及P300自動乙醯化誘導的識別及其由CTK7A的抑制。本公開也涉及NPMl 與GAPDH過度表達的誘導和相應的組蛋白高度乙醯化及其方法。
背景技術：
口腔癌是人類癌症的最常見類型之一，世界範圍內年發病率是274，000例1O菸草使用和酒精攝入是口腔癌發生的主要危險因素。然而，菸草致癌物質和酒精誘導口腔癌中上皮細胞的轉化和惡性發展的確切機制未被很好理解2。過去的十年已經看到顯示染色質結構-功能在一些疾病表現中的關鍵作用的快速增加的證據3』4。從遺傳變異和/或一組更多樣化的基因外改變(後生變化，印igenetic changes)可引起疾病發病機制的事實看，這是顯而易見的3』4』5_1(1。染色質作為動態實體在像轉錄、修復和複製等所有細胞核相關的現象中起關鍵性作用"_12。染色質的翻譯後修飾在保持染色質結構-功能中發揮重要作用，且因此調控基因表達、細胞生長和分化。已顯示細胞轉錄狀態的幹擾能夠導致發育缺陷13。此外，也已經顯示不同染色質組分的功能障礙和組蛋白的共價修飾能夠引起疾病發病機制3』
4，13，14
O可逆的組蛋白乙醯化是被很好描述的表觀遺傳修飾之一，且由組蛋白乙醯轉移酶 (HAT)和組蛋白去乙醯化酶(HDAC)催化，其影響組蛋白和非-組蛋白蛋白質的乙醯化，從而在下遊生物學功能中起顯著作用16』17。改變的HAT和HDAC活性現在已知在包括癌症在內的一些疾病中發揮重要作用7_9』15』18』19。該組蛋白乙醯轉移酶，P300是整體轉錄輔助激活因子且是細胞中主要HAT2°。高水平的p300已經在一些腫瘤中被觀察到21』μ。此外，ρ300乙醯轉移酶中的突變在原發腫瘤和細胞系中被發現η。相似地，Ρ300位點異質性的喪失與結腸直腸、乳腺癌及與腦癌(成膠質細胞瘤)有關19』23。雖然這些數據表明CBP、p300和PCAF 基因的參與，但是這些乙醯轉移酶的HAT活性沒有作為惡性腫瘤的起因被確認19。最近，不同癌症中組蛋白修飾的改變已經被報導。H4的賴氨酸16乙醯化喪失和賴氨酸20甲基化被發現與原發腫瘤和腫瘤細胞系有關5。在另一項研究中，癌細胞組蛋白修飾的大量改變被發現可預測臨床出現前列腺癌7。然而，一個罕見的例外，組蛋白的高度乙醯化已經在肝細胞癌中被觀察24。除了癌症之外，賴氨酸乙醯轉移酶的功能障礙已經在其它疾病中被涉及炎症過程、亨廷頓病、心臟病、糖尿病和AIDS25—28。這些觀察顯示乙醯轉移酶的特定和相關的無毒抑制劑能夠被認為是新一代治療劑，特別地，用於癌症。最近，一些HAT抑制劑已經被發現15』29，其已經顯示在癌症、HIV和心臟病中具有潛在的臨床作用％』3(^2。然而，HAT抑制劑在癌症表現中的效果仍未被測試。癌症以高增殖細胞為標記，其已經避開了細胞的凋亡機制且因此具有抗凋亡細胞的過度表達。NPMl (也被稱為B23)m和GAPDH34』35是那些已知在很多癌症中被頻繁上調的基因中的兩個。這兩種蛋白被認為是細胞增殖的正調節物。

發明內容
因此，本公開涉及一種通過4-(3，5-二(3-甲氧基-5-氧化苯乙烯)-4，5_ 二氫-IH-吡唑-1-基)苯甲酸鈉(CTK7A)抑制組蛋白乙醯轉移酶(HAT)的方法，所述方法包括用CTK7A孵育HAT的步驟；一種識別口腔鱗狀細胞癌中組蛋白高度乙醯化的方法，所述方法包括步驟(a)從KB細胞中分離組蛋白並用抗乙醯化H3抗體對該組蛋白進行免疫組織化學分析，以及(b)進行免疫印跡來識別口腔鱗狀細胞癌中組蛋白的高度乙醯化；一種治療癌症的方法，所述方法包括將治療上可接受量的CTK7A，可選地連同藥學上可接受的賦形劑一起給予需要其的對象的步驟；一種通過核磷蛋白(NPMl)識別p300自動乙醯化的誘導的方法，所述方法包括步驟(a)在NPMl存在下，在HAT測試緩衝液中孵育全長放射性標記的p300，隨後加入[3H] 乙醯CoA，以及(b)通過螢光顯影和放射自顯影識別p300的自動乙醯化；一種通過4-(3， 5-二 (3-甲氧基-5-氧化苯乙烯)-4，5-二氫-IH-吡唑-1-基)苯甲酸鈉(CTK7A)抑制 P300的自動乙醯化的方法，所述方法包括步驟(a)將全長放射性標記的p300與預定濃度的CTK7A，可選地連同HDAC抑制劑的混合物一起反應並孵育，以及(b)進行濾膜結合分析且通過螢光顯影和放射自顯影識別P300自動乙醯化的抑制；以及一種識別導致組蛋白高度乙醯化的由一氧化氮(NO)誘導的NPMl和GAPDH過度表達的方法，所述方法包括步驟(a) 用S-亞硝基-穀胱甘肽(GSNO)處理KB細胞約M小時，隨後裂解細胞以獲得細胞裂解物， (b)用抗-乙醯賴氨酸抗體免疫沉澱該細胞裂解物並且使用抗-NPMl和抗-GAPDH抗體通過免疫印跡對該免疫沉澱物進行分析，以及(c)使用抗-乙醯化H3K14抗體同時對來自被處理細胞的組蛋白進行免疫印跡，用於導致組蛋白高度乙醯化的NO誘導的NPMl和GAPDH過度表達的識別。


圖1 顯示KB細胞中組蛋白被高度乙醯化。圖2a:顯示組蛋白乙醯化作用的免疫組織化學檢測和口腔癌樣品中不同蛋白質的表達。圖2b 顯示比較不同患者樣品的腫瘤中和各自鄰近正常組織中組蛋白H3的蛋白質水平和乙醯化狀態的免疫印跡分析(左圖)以及各自條帶的定量化(右圖)。圖3a 顯示人類口腔癌中iNOS和C0X-2表達的免疫組織化學檢測。圖3b 顯示GSNO誘導NPMl和GAPDH的表達。細胞用指定濃度的GSNO處理Mh。圖3c 顯示KB細胞在200 μ M GSNO或GSH存在下24h的生長。細胞裂解物用抗-乙醯賴氨酸抗體被免疫沉澱，且免疫沉澱物用抗-NPMl (左圖)和抗-GAPDH(右圖)抗體通過免疫印跡被分析。圖3d 顯示IFN γ處理提高了 NPMl和GAPDH的乙醯化，其被iNOS抑制劑 1400ff(100yM)徹底破壞。圖顯示暴露於IFN γ後GAPDH轉運到KB細胞的細胞核。KB細胞用IFN γ (IOng πιΓ1)處理1 且用抗-GAPDH抗體(綠色)和DAPI (藍色)染色。圖3f 左圖顯示p300fl的自動乙醯化用3H-乙醯CoA在NPMl存在或缺少下被檢測。GAPDH(600ng)被用作陽性對照。右圖顯示NPMl以濃度依賴的方式提高p300的自動乙醯化。圖3g:顯示NO引起的組蛋白HIM的高度乙醯化。組蛋白從GSNO處理的KB細胞中被分離且用抗-乙醯化的HI14抗體被進行免疫印跡。圖4a 顯示CTK7A的結構式。圖4b 顯示各種重組體HATs、HMTs和HDACs的抑制曲線。圖4c 顯示CTK7A是p300的非競爭性抑制劑。CTK7A對p300介導的高純度HeLa 核組蛋白乙醯化的作用的Lineweaver-Burk圖。圖4d (A)顯示CTK7A在體外抑制全長p300的自動乙醯化。自動乙醯化分析在有指定濃度的CTK7A的3H-乙醯CoA缺少或存在下使用p300fl被進行。圖4g 圖4d(B)顯示通過濾膜結合(Filter binding)組蛋白乙醯轉移酶(HAT)分析法， 薑黃素對P300活性的抑制效應。圖4d (C)顯示通過濾膜結合組蛋白乙醯轉移酶(HAT)分析法，CTK7A對p300活性的抑制效應。圖如(A)顯示CTK7A在體外抑制PCAF自動乙醯化。圖4e(B)顯示通過濾膜結合組蛋白乙醯轉移酶(HAT)分析法，薑黃素對PCAF活性的抑制效應。圖如(C)顯示通過濾膜結合組蛋白乙醯轉移酶(HAT)分析法，CTK7A對PCAF活性的抑制效應。圖4f 顯示CTK7A在體外抑制p300自動乙醯化。圖4g 顯示CTK7A抑制KB細胞中組蛋白乙醯化。圖fe 顯示CTK7A抑制KB細胞的生長。圖釙顯示CTK7A抑制傷口癒合。圖5c 顯示CTK7A誘導KB細胞中多倍體。圖5d 顯示CTK7A誘導KB細胞中衰老-相關β -半乳糖表達(SA-β -gal)。圖k 顯示CTK7A通過抑制細胞周期素E的表達來影響細胞周期進程。圖5f 顯示CTK7A抑制細胞周期素E啟動子中H3乙醯化。圖6a 顯示攜帶KB細胞異種移植物的裸鼠用磷酸鹽緩衝鹽水(對照)或用CTK7A 腹膜內注射處理，100mg/Kg體重，一日兩次。一元方差分析顯示腫瘤大小顯著不同(ρ < 0. 05)。圖6b 顯示CTK7A抑制裸鼠中組蛋白乙醯化。來自對照和CTK7A處理的小鼠的KB 細胞瘤被用於使用指定抗體的免疫組織化學檢測。GAPDH IHC中箭頭標誌顯示GAPDH的核定位，而在CTK7A處理的腫瘤中它不存在。圖6c 顯示來自對照和CTK7A處理的小鼠的KB細胞瘤被用於使用指定抗體的免疫組織化學檢測。圖7 顯示引起組蛋白和非組蛋白蛋白質高度乙醯化的假定後生信號通路。
具體實施例方式
本公開涉及一種通過4-(3，5-二(3-甲氧基-5-氧化苯乙烯)-4，5-二氫-IH-吡唑-1-基)苯甲酸鈉(CTK7A)抑制組蛋白乙醯轉移酶(HAT)的方法，所述方法包括用CTK7A孵育HAT的步驟。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，HAT選自包括p300/CBP(CREB結合蛋白)和PCAF(P300/CBP相關因子)或其組合的組。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，CTK7A的HAT抑制濃度範圍從約 25 μ M至約200 μ Μ,優選約40 μ M至約80 μ Μ。本公開也涉及一種識別口腔鱗狀細胞癌中組蛋白高度乙醯化的方法，所述方法包括步驟a.從KB細胞中分離組蛋白並用抗乙醯化H3抗體對該組蛋白進行免疫組織化學分析，以及b.進行免疫印跡來識別口腔鱗狀細胞癌中組蛋白的高度乙醯化。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，該抗乙醯化H3抗體選自包括抗-H3AcK14抗體和抗_H3AcK9抗體的組。本公開也涉及一種治療癌症的方法，所述方法包括將治療上可接受量的CTK7A，可選地連同藥學上可接受的賦形劑一起給予需要其的對象的步驟。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，CTK7A抑制HATs的乙醯轉移酶活性， 且因此抑制組蛋白高度乙醯化。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，給予的途徑是腹膜內 (intraperitonial)。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，CTK7A減小癌症的腫瘤大小約50%。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，CTK7A在癌細胞中誘導多倍體從而誘導像生長停滯這樣的衰老。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，癌症是口腔鱗狀細胞癌。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，CTK7A進一步連同後生(印igenetic) 藥物靶標分子或藥學上可接受的化學治療劑或其組合一起被給予。本公開也涉及一種通過核磷蛋白(NPMl)識別p300的自動乙醯化誘導的方法，所述方法包括步驟a.在NPMl存在下，在HAT測試緩衝液中孵育全長放射性標記的p300，隨後加入 [3H]乙醯CoA,以及b.通過螢光顯影和放射自顯影識別P300自動乙醯化。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，通過NPMl對p300自動乙醯化的誘導是由IFNy依賴NO合成激發的。本公開也涉及一種通過4-(3，5-二(3-甲氧基_5_氧化苯乙烯)一4，5-二氫-IH-吡唑-1-基)苯甲酸鈉(CTK7A)抑制p300自動乙醯化的方法，所述方法包括步驟a.將全長放射性標記的p300與預定濃度的CTK7A，可選地連同HDAC抑制劑的混合物一起反應並孵育，以及b.進行濾膜結合分析並且通過螢光顯影和放射自顯影識別P300自動乙醯化的抑制。本公開也涉及一種識別導致組蛋白高度乙醯化的通過一氧化氮(NO)誘導的NPMl 和GAPDH過度表達的方法，所述方法包括步驟
a.用S-亞硝基-穀胱甘肽(GSNO)處理KB細胞約M小時，隨後裂解細胞以獲得細胞裂解物，b.用抗-乙醯賴氨酸抗體免疫沉澱該細胞裂解物並且使用抗-NPMl和抗-GAPDH 抗體通過免疫印跡法分析該免疫沉澱物，以及c.使用抗-乙醯化的HI14抗體同時對來自被處理細胞的組蛋白進行免疫印跡， 用於識別導致組蛋白高度乙醯化的NO誘導的NPMl和GAPDH過度表達。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，NO合成由IFNy控制，且其中NO誘導的NPMl過度表達誘導p300自動乙醯化，並因此激發組蛋白高度乙醯化。在本公開的另一個實施例中，在所述方法中，GSNO是用於誘導NPMl和GAPDH過度表達的一氧化氮的活性供體。改變的組蛋白乙醯化模式與包括癌症在內的一些疾病有關。組蛋白去乙醯化酶 (HDAC)的功能障礙和隨後發生的組蛋白低乙醯化以及非組蛋白蛋白質已經有原因地與癌症表現有關。不像大多數的癌症那樣，本公開報導在口腔癌患者樣品中組蛋白被發現是高度超乙醯化的。在機理上，由NPMl和GAPDH誘導的過度表達以及p300增強的自動乙醯化引起高度乙醯化，它是一氧化氮(NO)信號相關的(依賴的)。由新合成的、水溶性的、小分子抑制劑對P300乙醯轉移酶活性(HAT)的抑制能夠基本上延遲/抑制小鼠中異種移植口腔腫瘤的生長。因此，這些結果不僅明確了口腔癌的一個新的後生靶標，而且提出HAT抑制劑作為潛在的治療分子。本公開顯示組蛋白(H3)在口腔癌患者樣品中是高度乙醯化的，且與上調的NPMl 和GAPDH蛋白質水平呈正相關。本公開也提出了一種機制來解釋H3的高度乙醯化是如何能夠被NPMl和GAPDH以涉及p300乙醯轉移酶的一氧化氮(NO)依賴方式所調控的。此外， 水溶性HAT抑制劑，CTK7A已經顯示在裸鼠中抑制口腔腫瘤細胞的生長。實驗步驟分離自HeLa細胞核的組蛋白來自HeLa細胞核的核心組蛋白如別處所描述被純化31。來自杆狀病毒-感染的Sf21細胞的組蛋白修飾酶的純化 表達全長FLAG-標籤的CARMl、CBP和PCAF的重組杆狀病毒使用M2-瓊脂糖微球通過免疫親和層析而被純化隨後用FLAG肽洗脫。杆狀病毒表達的全長六溴氨酸-標籤p300 和G9a使用Ni-NTA親和層析如前所述30被純化。HAT 檢測進行HAT凝膠螢光顯影/放射自顯影檢測，如前所報導3°。P300HAT抑制的動力學分析在(0、30和5(^100￥74存在下如先前所報導」被執行。獲得的值使用Graphpad Prism軟體按雙倒數作圖法作圖。對於p300自動乙醯化檢測，p300全長(SOng)與蛋白質 (NPMl)或者不與蛋白質(NPMl)的反應在HAT檢測緩衝液中在30°C進行10分鐘，隨後加入 1 μ 1 的 4. 7Ci/mmol [3H]乙醯 CoA(NEN-PerkinElmer)並且進一步在一個 30 μ 1 反應中再孵育10分鐘。GAPDH被用作陽性對照。放射性標記的乙醯化的ρ300被螢光顯影隨後被放射自顯影處理。組蛋白去乙醯化酶檢測(HDAC檢測)及組蛋白甲基轉移酶(HMTase)檢測去乙醯化酶檢測按照每個標準實驗方案執行。對於SirT2去乙醯化酶檢測，50ng細菌表達的重組酶在輔因子NAD+存在或缺少下被添加。HMTase如前所述被執行31。細胞培養和全細胞提取物製備KB細胞在37°C 5% C02氣氛條件的加溼培養箱中被保持在含10%胎牛血清(FBS) 的杜爾貝科改良fegle培養基(DMEM)中。對於IFNy和GSNO處理，KB細胞在IFN γ IOng πιΓ1存在下分別再培養1 和Mh。用於共聚焦顯微鏡的細胞的免疫螢光染色如前所述被執行。CTK7A處理進行Mh，隨後是按照每個標準實驗方案μ的組蛋白的酸提取和免疫印跡。對於全細胞提取物製備，RIPA緩衝液(Tris-鹽酸50mM，pH 7. 4NP-401%，鈉-脫氧膽酸鹽 0.25%，NaCl 150mM, EDTA ImM，苯甲基磺醯氟(PMSF), ImM Na3VO4, ImM NaF 和蛋白酶抑制劑混合物(cocktail))被使用。免疫沉澱檢測全細胞提取物如上所述使用RIPA緩衝液被製備。前阻斷蛋白-G瓊脂糖凝膠結合抗體Gyg)與500 μ g全細胞裂解物在4°C過夜培養。在廣泛清洗後，珠結合蛋白通過與指定抗體的免疫印跡被分析。對於HDAC抑制劑處理，5mM 丁酸鈉、5mM煙醯胺和IOOng πιΓ1 TSA在細胞被收穫前IOh被加入。染色質免疫沉澱檢測(ChIP) 使用抗乙醯化Η3 (H3AcK9AcK14) (Santa Cruz)抗體進行ChIP檢測的下調 (pull-down)。KB細胞被保持在添加了 10 % FBS的DMEM中，用CTK7A處理，且細胞生長對小時。對於ChIP檢測，細胞如別處47所描述被處理。下調使用抗上述抗體的抗體進行，免疫沉澱樣品被脫去蛋白質且乙醇沉澱以回收DNA。使用細胞周期素E(或稱細胞周期蛋白E)啟動子區域的引物進行實時PCR分析。細胞周期素E啟動子區域的引物是 5， -GGCGGGACGGGCTCTGGG-3，和 5』 -CCTCGGCATGATGGGGCTG-3』免疫組織化學在脫蠟(cbparafinzing)之後，載玻片在乙醇中清洗。抗原修復使用檸檬酸鈉 (IOmM pH 6. 0)在98°C進行5分鐘。染色使用Envision試劑盒(Dako，丹麥)進行。復染使用Mayer蘇木精進行，並在DPX中裝配且風乾。每個樣品標本在進行免疫組織化學之前被病理證實。對於統計分析，來自正常和腫瘤組織切片的細胞(來自總計5-6個獨立區域的100個細胞)被計數，並且記錄用於指定抗體的陽性細胞(棕色)的百分比。為了比較， 一元方差分析使用「Sigmaplot軟體」被執行。？_值< 0. 01被認為是統計學顯著，η = 31。異種移植生長檢測動物實驗得到授權的倫理委員的批准而執行。十六隻裸鼠(BALB/c)被包括在實驗中(10隻雄性小鼠和6隻雌性小鼠)。小鼠在無病原體環境中被保存在隔離器中。所有裸鼠在實驗開始時是3-4周大。KB細胞，hlO6個細胞被分別接種在每隻小鼠的右側和左側。 然後小鼠被分成兩組，每組(5雄和3雌)。在腫瘤長到大小明顯後，CTK7A處理以100mg/kg 體重/ 一日兩次被腹膜內給予(i.P)。腫瘤使用卡尺三天測量一次，且它們的體積利用公式:0.52xDlx(D2)2被計算，其中，『D1，和『D2，分別是最長和最短的尺寸。化合物(CTK7A) 最後劑量在宰殺它之前四小時被給予。腫瘤被切除，且放入液氮中或被固定在10%福馬林中1- 以製備用於IHC的塊。為了比較處理和對照的腫瘤大小，使用「Sigmaplot軟體」 進行一元方差分析。？_值< 0. 05被認為是統計學顯著的。螢光活化的細胞分選(FACS)
KB細胞以指定濃度在CTK7A存在或缺少下生長Mh。細胞在存在CTK7A、缺少血清下生長池，隨後加入10%血清。簡言之，細胞通過輕度胰酶消化(0.25% )被收穫，隨後在4°C以2000rpm離心10分鐘。細胞用冷PBS通過在4°C以2000rpm離心10分鐘被清洗。 細胞被固定在隨著溫和渦旋滴加的冷70%乙醇中。樣品被靜止12小時，其後乙醇被去除， 隨後在冷PBS中清洗兩次。核糖核酸酶(100 μ g/ml)處理隨後在37°C被給予30分鐘以確保只有DNA染色。加入50 μ g/ml碘化吡啶用於染色。細胞使用BD FACScalibur設備的內置軟體通過用於細胞周期分布的流式細胞儀被分類和分析。分析在FL2通道中完成。體外傷口癒合檢測含10% FBS的培養基中的細胞被接種於30mm培養皿中。細胞長成片之後，等徑的傷口使用無菌塑料槍頭(200-μ 1)通過刮傷單分子層而形成。細胞用無血清培養基清洗兩次且用含有或沒有10% FBS的培養基再生。細胞用或不用HAT抑制劑連同10%血清一起處理Mh。傷口照片在相差顯微鏡下被拍攝。血清陽性和陰性細胞分別用作實驗的陽性和陰性對照。衰老相關β -gal (SA- β -gal)活性分析如前所述在KB細胞中分析SA- β -gal活性。[3H]胸腺嘧啶摻入量檢測細胞在24-孔平板中生長，且用化合物處理16h，隨後加入1微居裡[3H]胸腺嘧啶 (NEN, Perkin Elmer)。細胞進一步生長額外的他。此後，培養基被充氣，且細胞用Iml冰冷PBS清洗。細胞通過反覆凍融O次)被裂解。使用細胞收集器分離DNA，且使用液體閃爍計數器完成閃爍計數。CTK7A合成的一般程序該程序涉及下面兩步A.苯甲醯胼薑黃素(CTK7)的製備(不溶於水)將乙酸的4-胼基苯甲酸Qml)加入到薑黃素在甲醇中的溶液(10mg，0. 027Mmol) 中。保溫24h後，該溶劑在真空中被蒸發。剩餘的酸Q0mg，0. 135mmol)、和催化量的三乙胺 (18. 8 μ L，0. 135mmol)使用 TLC (CHCl3/MeOH = 4 1 ;Rf = 0. 5)利用反覆重結晶和過濾的方法被純化。這樣產生如暗橙色粉末樣的CTK7(7. 18mg，55%)，其通過H1 NMR、熔點測試、 溶解度試驗和ESI-MS進行分析。B. 4-(3，5-二 (3_甲氧基_5_氧化苯乙烯)_4，5_ 二氫-IH-吡唑基)苯甲酸鈉(CTK7A)的製備(溶於水)將(IOml)的乙醇鈉加入到CTK7在甲醇中的溶液中(50mg，0. 1031mmol)，且該反應混合物在室溫被攪拌90分鐘。該溶劑在真空中被蒸發，且殘餘物用己烷、乙醚和乙酸乙酯清洗。產物通過H1 NMR、溶解度試驗、熔點測試被證實。本公開通過下面的實施例和附圖被進一步闡述。然而，這些實施例並不被解釋為限制本公開的範圍。實施例1組蛋白在H3K14的高度乙醯化與口腔癌中NPMl和GAPDH的過度表達有關為了研究不同癌症中組蛋白乙醯化的情況，首先，組蛋白分離自不同的細胞系且使用抗-乙醯化組蛋白H3 (抗-H3AcK9AcK14)抗體進行免疫印跡分析。觀察到組蛋白在口腔(KB)和肝臟0fepG2)癌細胞系中是顯著高度乙醯化的(圖1)。如指出的組蛋白分離自不同細胞系的細胞，且使用抗-乙醯化H3 (抗-H3AcK9AcK14)抗體通過免疫印跡分析組蛋白乙醯化。抗-H3被用作上樣對照。雖然肝癌中組蛋白的高度乙醯化已經在最近被報導24， 但是對於口腔癌細胞系組蛋白H3的幾乎等效增強的乙醯化是相當引人關注的。這些結果使我們發現了來自口腔癌患者樣品的組織中組蛋白H3的乙醯化水平。通過應用免疫組織化學(IHC)(圖2a)和利用特定抗體(抗-H3AcK14和抗-H3AcK9)的免疫印跡(圖2b)分析，發現組蛋白(主要是H3K14)與正常組織相比在癌組織中是高度乙醯化的(圖加)。由於H3K14是體內p300介導的乙醯化的主要靶標，因此研究p300的表達水平。發現P300與鄰近的正常組織相比在惡性腫瘤部分顯著表達(圖加)。既然p300自動乙醯化促進它的乙醯轉移酶活性36，p300的自動乙醯化情況利用特別識別乙醯化-p300 (ac-p300) 分子％的多克隆抗體也被檢驗。引人關注的是，P300被發現在口腔癌樣品中時高度乙醯化的(圖加)。這些結果顯示高活性乙醯化-P300能夠參與到惡性口腔腫瘤中組蛋白在H3K14 的高度乙醯化。p300的自動乙醯化能夠被一些因子增強且其中的一些在不同癌症中過度表達。在本文中，發現在口腔腫瘤組織中，與每一例(患者樣品)中相應的正常組織相比GAPDH 和NPMl蛋白質水平顯著增加(圖加)。隨後，六對不同的組織樣品被取樣(腫瘤和相應鄰近的正常組織)，且蛋白質過度表達水平通過免疫印跡分析被測定。觀察到在所有六對組織樣品中，組蛋白H3高度乙醯化，如被抗-H3AcK9AcK14乙醯化特定抗體探測到的那樣(圖 2b)。請注意H3高度乙醯化遵循與所有被分析的癌組織中NPMl和GAPDH過度表達相同的模式。總之，這些數據顯示GAPDH和NPMl的過度表達與口腔癌中組蛋白高度乙醯化正相關。 在此被提出的一個有意義的問題是這與P300自動乙醯化有關的可能性。實施例2NO誘導的H3K14乙醯化與經由p300自動乙醯化的NPMl和GAPDH過度表達有關自由基氣體，NO,由一氧化氮合成酶(N0Q家族產生。NO是被確定為許多生理和病理條件的中介物的多效性信號分子41。由於發現在口腔癌中NO產量的增加伴隨炎症(主要是NFk-B響應)基因的同時上調42』43，因此假設NO信號可能與p300的自動乙醯化、GAPDH 和NPMl的過度表達以及組蛋白的高度乙醯化有關。觀察到iNOS水平在腫瘤組織樣品中確實顯著提高(圖3a)。也發現C0X2水平在這些腫瘤組織樣品中是較高的(圖加)。最近的報導提出NO依賴且細胞核定位的GAPDH提高p300自動乙醯化且因而提高它的催化活性37。 已發現GAPDH主要定位於口腔癌患者樣品的細胞核(圖加，如箭頭所指)。此外，觀察到當 KB細胞用NO供體，S-亞硝基-穀胱甘肽(GSNO)處理時，NPMl和GAPDH 二者的表達以濃度依賴的方式提高(圖北)。與先前的報導一致37，同樣發現GAPDH以NO依賴的方式被乙醯化(圖3c)。這些結果使我們確定了 NO對NPMl乙醯化的作用。引人關注的是，GSNO處理後，檢測到NPMl的乙醯化在KB細胞中急劇地提高(圖3c)。為了了解信號通路，KB細胞中IFN γ對GAPDH和NPMl乙醯化的影響被研究，如已知激活iNOS基因表達以產生NO44。發現IFN γ在KB細胞中以NO-依賴的方式有效地提高GAPDH和NPMl乙醯化(圖3d)，其通過特定iNOS抑制劑，N_(3_(氨甲基)苄基)乙脒 (1400W)處理而被破壞或降低。此外，發現IFNy處理能夠誘導胞液蛋白GAPDH易位到細胞核(圖!Be)。總之，這些結果顯示NO-信號參與KB細胞中NPMl和GAPDH的過度表達以及它們的乙醯化，這與觀察到的口腔癌組織樣品中NPM1、GAPDH和iNOS過度表達(如前所述)顯著相關。在腫瘤組織中，也發現組蛋白HI14是高度乙醯化的(圖加)。這些觀察促使我們研究NPMl對p300激活(自動乙醯化)的作用。p300自動乙醯化反應在NPMl和3H-乙醯-CoA存在下進行。NPMl被發現以劑量依賴的方式激活p300的自動乙醯化(圖3f)。 GAPDH被用作陽性對照，如前面所提出的那樣37。既然NO信號誘導p300-自動乙醯化，那麼 KB細胞中NO對H3K14乙醯化的作用接下來被研究。KB細胞的GSNO處理以濃度依賴的方式提高H3K14乙醯化的水平(圖3g)，這與如上所示NPMl和GAPDH水平相伴增加(圖3b) 是相似的。總之，這些數據顯示口腔癌中組蛋白高度乙醯化能夠通過過度表達的和自動乙醯化的P300以NO依賴的方式而獲得。實施例3CTK7A 是 HAT 抑制劑上面提到的結果清楚地證明了賴氨酸乙醯轉移酶p300的高-活性可能是負責口腔癌表現(manifestation)的因子之一。因此，p300HAT活性的抑制劑對證實乙醯轉移酶可能參與將是有用的。利用薑黃素作為合成子，一種水溶性衍生物，CTK7A為此目的而被合成(圖 4a)。發現 CTK7A 抑制 HAT p300/CBP 和 PCAF，但是如 G9a、CARMU Tip60、HDACl 和 SIRT2這樣的其它組蛋白修飾酶的活性甚至在100 μ M濃度仍不受影響(圖4b)。進一步動力學分析顯示當測試P300時，CTK7A對於兩種底物，乙醯-coA和核心組蛋白，遵循非-競爭類型的抑制模式(圖4c)。然而，正如預期的，CTK7A能夠以濃度依賴的方式有效地抑制體外p300(圖4c)和PCAF(圖4e)的自動乙醯化。此外，CTK7A同樣能夠抑制提高的p300 自動乙醯化，由HDAC抑制劑的混合物所調節(圖4f)。為了闡述細胞體系中CTK7A對組蛋白乙醯化抑制的影響，KB細胞用CTK7A處理，且正如預期的，它能夠有效抑制KB細胞中組蛋白乙醯化，與薑黃素母體化合物一樣有效31 (圖4g)。總之，這些結果顯示水溶性HAT抑制劑，CTK7A通過抑制p300自動乙醯化而在細胞體系中抑制組蛋白乙醯化。實施例4CTK7A抑制細胞增殖並誘導如生長停滯這樣的衰老由於P300/CBP是主要調控因子，並且參與細胞周期進程增殖、分化的調控以及保持組織穩態45，CTK7A在細胞中的生長抑制性能接下來被觀察。KB細胞用CTK7A處理並且被檢測生長抑制性能。CTK7A引起KB細胞增殖的劑量依賴抑制，如通過胸腺嘧啶摻入試驗進行分析(圖如)。阿黴素被用作陽性對照(圖fe)。CTK7A的抗增殖活性進一步通過傷口癒合檢測被確定。觀察到CTK7A處理的細胞在血清存在下顯示傷口癒合活性下降(圖恥)。 有和沒有血清的細胞分別被用作陽性和陰性對照(圖恥)。這些結果顯示CTK7A在KB細胞中的抗增殖作用。基於上述結果，也確定了 CTK7A對KB細胞的細胞周期的作用。KB細胞用增加濃度的CTK7A處理(圖5c)，這以濃度依賴的方式引起多倍體細胞(>4N)百分比的急劇增加(圖5c)。多倍體的誘導通常與已知與抗腫瘤過程有關的衰老有關46。發現 CTK7A處理的細胞誘導與作為衰老標記的β-半乳糖(SA-i3-gal)有關的衰老的表達(圖 5d)。這與較早的報導一致，報導中利用p300特定HATi，賴氨醯-CoA(乙醯-CoA的底物類似物)顯示了 P300在調控人類黑色素細胞的增殖和衰老中的作用。賴氨醯-CoA抑制增殖且誘導伴隨SA- β -gal表達的衰老-樣生長阻滯47。
細胞周期素E是衰老的關鍵調控因子，因為在過度表達條件下，它足以逃脫BRGl 和RAS-誘導的衰老48_49。考慮到p300/CBP調控很多細胞周期基因的表達，接下來測定CTK7A 對細胞周期素E的表達的影響。觀察到CTK7A在KB細胞中以濃度依賴的方式下調細胞周期素E的表達，而細胞周期素Dl受到輕微影響(圖k)。早前的工作顯示人類腫瘤細胞和小鼠胚胎成纖維細胞中細胞周期素E啟動子由可逆的乙醯化和去乙醯化循環調控5°_52。因此，為了解決細胞周期素E啟動子中CTK7A對乙醯化狀態的影響，進行染色質免疫沉澱檢測(ChIP)。ChIP檢測清楚地證實CTK7A抑制在細胞周期素E啟動子中的H3的乙醯化(圖 5f)。總之，這些結果顯示細胞周期素E下調可能是CTK7A的p300HAT抑制活性(其造成衰老-樣生長阻滯)的直接原因。實施例5CTK7A抑制腫瘤生長基於體外和細胞系的研究促使我們研究CTK7A在異種移植小鼠中的作用。發現 CTK7A在腹膜內(i.p)給予後對小鼠是無毒的。1個月期間，在劑量達到100mg/kg體重/ 一日兩次，沒有觀察到重量減輕。為了測試CTK7A對腫瘤生長的影響，KB細胞OxlO6細胞) 被分別接種在每隻小鼠的右側和左側，100mg/kg體重/ 一日兩次腹膜內處理它們(細節見材料與方法)。CTK7A顯示強抗腫瘤活性(圖6a)。CTK7A處理的小鼠中KB細胞腫瘤比對照未處理小鼠小50%。異種移植小鼠之間腫瘤大小的區別(對照相對處理)是統計學顯著的(P < 0. 05)。H3乙醯化的水平和其它蛋白質(例如，NPMU GAPDH, p300)的水平使用 IHC測定。CTK7A處理的小鼠腫瘤對p300表達顯示邊際影響(圖6b)。觀察到CTK7A降低 7 H3K9、K14乙醯化(如H3AcK9AcK14探測到的)和ac_p300的水平(圖6b和圖6c)。進一步觀察CTK7A介導的HAT抑制對組蛋白乙醯化的位點特異性影響，IHC使用位點特異性抗體而完成。發現CTK7A抑制H3K14乙醯化比抑制H3K9乙醯化更有力(圖乩)，表明CTK7A 主要通過能引起腫瘤生長抑制的小鼠癌組織中P300自動乙醯化的抑制來介導組蛋白乙醯化的抑制。這些數據也與CTK7A對KB細胞的抗增殖效果一致(圖fe)。此外，GAPDH、NPM1 和iNOS的水平也被發現在CTK7A處理的小鼠中下調，這可能是因為CTK7A對小鼠腫瘤的抗增殖效果(圖6b)。此外，在很多細胞類型中由分裂素、生長因子、細胞激素和腫瘤促進因子誘導並且已經牽涉包括口腔癌在內的很多癌症的C0X2的水平也被發現在CTK7A處理的腫瘤中受到抑制(圖6b)。增殖標記物的下調也被觀察CTK7A處理的腫瘤中的Ki-67，其支持HATi、CTK7A的抗增殖性質(圖6c)。此處應注意在對照小鼠中，細胞核GAPDH被觀察到，而在CTK7A處理小鼠中，細胞核GAPDH不存在或非常微弱存在(圖6b)。這些結果顯示 CTK7A抑制裸鼠中腫瘤生長，雖然它有能力抑制p-300介導的乙醯化。雖然組蛋白和非組蛋白蛋白質的可逆的乙醯化是最好研究的後生標記之一，但是涉及這些現象的酶機制的調控僅最近才引起注意。HDACs的功能障礙和組蛋白以及非組蛋白蛋白質的隨之而來的低乙醯化在一些案例中已經與癌症表現因果相關53。關於HATs的功能障礙和癌症的報導相當少。此處，在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)，組蛋白H3(主要在K14)在 II級口腔腫瘤中是高度乙醯化的。組蛋白乙醯轉移酶P300的相關過度表達和高度乙醯化顯示P300的自動乙醯化能夠是負責組蛋白高度乙醯化的關鍵因子之一。發現也在口腔腫瘤中過度表達的組蛋白分子伴侶NPMl大概通過它的蛋白質分子伴侶活性誘導p300的自動乙醯化54。這些結果歸屬於多功能核仁蛋白NPMl的一個新功能。此外，這些研究也確立了一個表觀遺傳信號，IFN γ依賴的NO合成，它能夠作為對NPMl和GAPDH介導的p300增強的自動乙醯化以及因此的下遊效應的基本刺激(basic stimuli)。組蛋白修飾(特別是乙醯化)和癌症表現的相互關係還沒有很好地理解。由於癌症是一種多起源的多樣的疾病，它不遵循統一的細胞規則。然而，在前列腺癌病例中，已經顯示H3K9、K18、H4K12的甲基化和H4R3的二甲基化作用與腫瘤復發有關7。然而，參與這些改變的修飾中的組蛋白修飾酶還不為人們所知。換句話說，在改變的乙醯化和甲基化之後的分子機制還沒有被闡明。發現組蛋白在肝癌中在H3K9和H4K8是高度乙醯化的24。值得注意地，在這個案例中，參與高度乙醯化的酶機制也沒有被詳細研究。最近，CBP/p300的一個靶標H3K56增加的乙醯化在多發性癌症中觀察到8。也證實組蛋白、組蛋白分子伴侶 (NPMl)及代謝蛋白、GAPDH的高度乙醯化由極度活躍的、自動乙醯化的p300弓丨起。參與高度乙醯化這個過程的唯一的正循環能夠是癌症表現中的共有機制。口腔癌是一種炎症相關的疾病，其能夠引起NO產生，而NO產生能夠對癌症的發生和發展階段造成影響44。本公開提供了 NO產生與如NPMl和GAPDH的細胞增殖標記基因的過度表達之間的聯繫。這些觀察與增強的iNOS活性已經在人類腫瘤細胞系55』56和各種組織發生來源的患者腫瘤樣品44中檢測到的報導相一致。NOS活性已經發現與腫瘤發生、增殖和與癌症發生相聯繫的重要信號組分的表達有關44。已知幹擾素Y (IFNY)，一種促炎性細胞因子，激活iNOS以產生NO57。發現確實IFNy對口腔癌細胞系(KB細胞)的處理誘導 NO產生，它的抑制(IFNy)抑制了對NPMl和GAPDH乙醯化。本公開的結果顯示IFNY處理能夠增加GAPDH的細胞核易位。雖然GAPDH的相似的細胞核定位也在其它案例中被報導 37』58，但是GAPDH在KB細胞中誘導的細胞核易位的分子機制仍然不明。過度表達的NPMl和 GAPDH(細胞核)增強p300的自動乙醯化，它反過來誘導組蛋白高度乙醯化。高度乙醯化的組蛋白和NPMl有助於負責口腔癌發展的基因的表達(圖7)。NPMl和GAPDH誘導的p300 的自動乙醯化也能夠被用於形成更多的動態轉錄起始前複雜形成體59，這引起更有效的轉錄。NPMl的組蛋白分子伴侶活性也可以用於轉錄激活，如早前所報導6°。癌細胞具有較高的能量需求和增加的核糖體生物合成。NPMl增加的水平也能夠有助於口腔癌中核糖體的生物發生。總之，本公開的數據顯示p300的乙醯轉移酶活性可以是造成口腔癌的因子之一。 因此，HAT活性能夠作為新一代療法的靶標15』29。此處，顯示確實來自薑黃素的p300/CBP HAT 抑制劑，CTK7A，一種水溶性、小分子化合物，能夠有效抑制裸鼠中口腔腫瘤的生長。本公開的結果顯示由細胞中HAT抑制劑(CTK7A)引起的多倍體抑制具有誘導像生長停滯的衰老的抗腫瘤活性。衰老的誘導已知有助於化學療法、電離輻射的治療，且也顯示有助於HDAC抑制劑的抗腫瘤效果61。目前的觀察確立了高度乙醯化和口腔癌表現之間的因果關係。最重要地，它闡明了高度乙醯化的機制，並且確定一種新的候選蛋白NPMl作為主乙醯轉移酶p300的調節劑。隨著最近一些新的HAT抑制劑的發現，逐漸意識到這些分子作為治療靶標是非常有用的15』29。在口腔癌中，p300乙醯轉移酶活性能夠是此類分子的重要靶標之一，正如通過應用 CTK7A而證實的。然而，源自OSCC的完整的後生語言(印igenetic language，後生學)仍然不清楚。HATs和HMTases (組蛋白甲基轉移酶，特別是精氨酸ffl^ase)的小分子調節劑對於進一步闡明這個後生改變及在設計療法中是有用的。
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權利要求
1.一種通過4-(3，5-二 (3-甲氧基-5-氧化苯乙烯)-4，5-二氫-IH-吡唑-1-基)苯甲酸鈉(CTK7A)抑制組蛋白乙醯轉移酶(HAT)的方法，所述方法包括用CTK7A孵育HAT的步驟。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述HAT選自包括p300/CBP(CREB結合蛋白)和 PCAF(P300/CBP相關因子)或其組合的組。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述CTK7A的HAT抑制濃度範圍從約25μ M至約 200 μ Μ,優選約40 μ M至約80 μ Μ。
4.一種用於識別口腔鱗狀細胞癌中組蛋白高度乙醯化的方法，所述方法包括步驟a.從KB細胞中分離組蛋白並用抗-乙醯化H3抗體對所述組蛋白進行免疫組織化學分析，以及b.進行免疫印跡來識別口腔鱗狀細胞癌中組蛋白的高度乙醯化。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述抗-乙醯化H3抗體選自包括抗-H3AcK14抗體和抗_H3AcK9抗體的組。
6.一種治療癌症的方法，所述方法包括將治療上可接受量的CTK7A，可選地連同藥學上可接受的賦形劑一起給予需要其的對象的步驟。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述CTK7A抑制HAT的乙醯轉移酶活性，且因此抑制組蛋白高度乙醯化。
8.根據權利要求6所述的方法，其中所述給予的途徑是腹膜內。
9.根據權利要求6所述的方法，其中所述CTK7A使癌症的腫瘤大小減小約50%。
10.根據權利要求6所述的方法，其中所述CTK7A在癌細胞中誘導多倍體從而誘導像生長停滯這樣的衰老。
11.根據權利要求6所述的方法，其中所述癌症是口腔鱗狀細胞癌。
12.根據權利要求6所述的方法，其中將所述CTK7A進一步連同後生藥物靶標分子或藥學上可接受的化學治療劑或其組合一起給予。
13.一種使用核磷蛋白(NPMl)用於識別p300自動乙醯化的誘導的方法，所述方法包括步驟a.在NPMl存在下，在HAT測試緩衝液中孵育全長放射性-標記的p300，隨後加入[3H] 乙醯CoA，以及b.通過螢光顯影和放射自顯影識別p300自動乙醯化。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述通過NPMl誘導p300自動乙醯化是由IFNy 依賴的NO合成激發的。
15.一種通過4-(3，5-二 (3-甲氧基-5-氧化苯乙烯)-4，5-二氫-IH-吡唑-1-基) 苯甲酸鈉(CTK7A)抑制p300自動乙醯化的方法，所述方法包括以下步驟a.將全長放射性-標記的p300與預定濃度的CTK7A，可選地連同HDAC抑制劑的混合物一起反應並孵育，以及b.進行濾膜結合分析且通過螢光顯影和放射自顯影識別P300自動乙醯化的抑制。
16.一種識別導致組蛋白高度乙醯化的由一氧化氮(NO)誘導的NPMl和GAPDH過度表達的方法，所述方法包括以下步驟a.用S-亞硝基-穀胱甘肽(GSNO)處理KB細胞約M小時，隨後裂解細胞以獲得細胞裂解物，b.用抗-乙醯賴氨酸抗體免疫沉澱所述細胞裂解物並且使用抗-NPMl和抗-GAPDH抗體通過免疫印跡來分析所述免疫沉澱物，以及c.使用抗-乙醯化的H3K14抗體同時對來自被處理細胞的組蛋白進行免疫印跡，用於識別導致組蛋白高度乙醯化的NO誘導的NPMl和GAPDH過度表達。
17.根據權利要求16所述的方法，其中NO合成由IFNy控制，且其中NO誘導的NPMl 過度表達誘導P300自動乙醯化，並因此激發組蛋白高度乙醯化。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述GSNO是用於誘導NPMl和GAPDH過度表達的一氧化氮的活性供體。
全文摘要
本公開涉及通過薑黃素衍生物，特別是CTK7A用於抑制組蛋白乙醯轉移酶的方法。本公開也涉及p300自動乙醯化的誘導的識別及其由CTK7A的抑制。本公開也涉及NPM1與GAPDH過度表達的誘導和組蛋白相應的高度乙醯化及其方法。
文檔編號G01N33/53GK102575236SQ201080045291
公開日2012年7月11日 申請日期2010年9月6日 優先權日2009年9月7日
發明者塔帕斯·庫馬爾·孔杜, 戈皮納特·科達加納·斯裡尼瓦薩查爾, 穆罕默德·阿里夫, 肯佩高拉·芒特蘭古 申請人:賈瓦哈拉爾尼赫魯高級科學研究中心