一種低粘附活性的益生菌及其製備方法

2023-04-25 21:25:06

一種低粘附活性的益生菌及其製備方法
【專利摘要】本發明提供了一種低粘附活性的益生菌，為MIMP基因缺失的乳酸桿菌，用含有拼接在一起的中間去掉MIMP基因序列同時保證閱讀框不發生變化的MIMP基因上下遊序列的重組載體轉染乳酸桿菌，得到所述益生菌。本發明提供的益生菌中MIMP基因缺失，具有低粘附活性，有效驗證了乳酸桿菌表面蛋白的活性片段MIMP對腸上皮細胞有粘附功能，對保護腸道黏膜的完整性具有重要意義。
【專利說明】一種低粘附活性的益生菌及其製備方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物基因工程領域，具體涉及一種MMP基因缺失的低粘附活性的益生菌。

【背景技術】
[0002]目前益生菌的臨床應用廣泛。益生菌在腸道內的粘附和定植能抑制致病菌的損傷，對於保護腸道黏膜的完整性具有重要意義。研究表明，益生菌包括乳酸桿菌對腸道炎症性相關疾病，如炎症性腸病、腸易激症候群、抗生素相關性腹瀉、新生兒壞死性小腸結腸炎、和膽道感染等，具均具有重要的防治作用。
[0003]乳酸桿菌是益生菌中及其重要的一種，可以與靶細胞黏附，競爭抑制致病性大腸桿菌(EPEC)、出血性大腸桿菌(EHEC)和侵襲性大腸桿菌(EIEC)等致病菌對人體腸道屏障功能的損害；激發繼發於黏附的細胞內信號轉導途徑，降低腸上皮細胞(IEC)的通透性；調節人體腸道黏膜免疫功能，促進樹突狀細胞(DC)分化成熟，以及誘導腸道T細胞分化成熟等。益生菌在腸道內的黏附和定植能抑制致病菌的損傷，對於保護腸道黏膜的完整性具有重要意義。
[0004]近幾年來研究表明，乳酸桿菌表面蛋白(Surface layer protein, SLP)在其發揮益生作用時起著核心作用。我們的前期研究表明，158 αΜΡ501-580)對於腸屏障功能保護具有重要的作用(專利:一種具有腸上皮細胞保護功能的蛋白序列及其應用；專利號:201210281968.7)，且具有分子小，效價高等優點。此外，乳酸桿菌表面蛋白的活性片段MMP(ΙΜΡ455-755)具有腸屏障保護作用，並進行了相應的休內和體外實驗驗證。為了進一步驗證乳酸桿菌表面蛋白的活性片段(Micro integral membrane protein, MIMP)對腸的腸屏障保護作用，我們需要進一步建立了一種MMP基因缺失的乳酸桿菌。


【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種MIMP基因缺失的乳酸桿菌。
[0006]本發明提供了一種低粘附活性的益生菌，所述益生菌為MMP基因缺失的乳酸桿菌。
[0007]優選地，用含有拼接在一起的中間去掉MMP基因序列同時保證閱讀框不發生變化的MMP基因上下遊序列的重組載體轉染乳酸桿菌，得到所述益生菌。
[0008]優選地，所述MMP基因上下遊序列包含至少30個鹼基對的MMP基因上遊序列和至少30個鹼基對的MMP基因下遊序列。
[0009]優選地，所述乳酸桿菌選自保加利亞乳桿菌、乾酪乳酸菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌、短乳桿菌。
[0010] 本發明還提供了一種製備上述益生菌的方法，用含有拼接在一起的中間去掉MMP基因序列同時保證閱讀框不發生變化的MMP基因上下遊序列的重組載體轉染乳酸桿菌，從而得到MIMP基因缺失的乳酸桿菌。
[0011]優選地，所述方法包括以下步驟:
[0012]步驟1，通過PCR方式獲得拼接在一起的中間去掉MMP基因序列同時保證閱讀框不發生變化的MMP基因上下遊序列，該MMP基因上下遊序列中的MMP基因上遊序列和MIMP基因下遊序列分別加載有酶切位點；
[0013]步驟2，通過雙酶切將步驟I獲得的拼接在一起的中間去掉MIMP基因序列同時保證閱讀框不發生變化的MMP基因上下遊序列插入到表達質粒中，獲得乳酸桿菌MMP基因敲除載體；
[0014]步驟3，用步驟2獲得的乳酸桿菌MIMP基因敲除載體轉染感受態的乳酸桿菌，從而得到MIMP基因缺失的乳酸桿菌。
[0015]優選地，所述MMP基因上下遊序列中的MMP基因上遊序列和MMP基因下遊序列分別加載有Bgl II酶切位點和Xho I酶切位點。
[0016]優選地，所述表達質粒為含有Bgl II酶切位點和Xho I酶切位點的質粒。
[0017]優選地,所述表達質粒為pET32質粒。
[0018]優選地，所述MMP基因上下遊序列包含至少30個鹼基對的MMP基因上遊序列和至少30個鹼基對的MMP基因下遊序列。
[0019]本發明還提供了一種權利要求1所述益生菌在驗證乳酸桿菌表面蛋白的活性片段MIMP功能中的應用。
[0020]本發明還提供了一種乳酸桿菌MMP基因敲除載體，包含pET32質粒序列和拼接在一起的中間去掉MMP基因序列同時保證閱讀框不發生變化的MMP基因上下遊序列。
[0021]本發明提供的益生菌中MMP基因缺失，具有低粘附活性，有效驗證了乳酸桿菌表面蛋白的活性片段MMP對腸上皮細胞有粘附功能，對保護腸道黏膜的完整性具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為粘附活性檢測結果；
[0023]圖2 為 Westernblot 檢測結果；
[0024]圖3為LPKM對NCM460細胞的粘附率檢測結果；
[0025]圖4為EPEC粘附率檢測結果。

【具體實施方式】
[0026]下面參照附圖，結合具體的實施例對本發明作進一步地說明，以更好地理解本發明。
[0027]1、乳酸桿菌MMP基因敲除載體的建立
[0028]通過pET32載體(包含Dell_BglII和Del2_XhoI兩個酶切位點)建立乳酸桿菌MIMP基因敲除載體(LiuZ, ShenT, MoyerMP, QinH.1dentificat1nofthe LactobaciIIusSLPdomainthatbindsgastricmucin.FrontB1sci2012; 17:2128-43),具體如下:
[0029]採用交疊PCR方式獲得拼接在一起的MMP基因上下遊序列(包含30個鹼基對的MIMP基因上遊序列和30個鹼基對的MMP基因下遊序列，且MMP基因上下遊序列中的MMP基因上遊序列和MMP基因下遊序列分別加載有Bgl II酶切位點和Xho I酶切位點)。程序:37°C，34h，酶切完後65°C滅活1min ;加5 μ 13M醋酸鈉和冷卻的無水乙醇120μ 1，_20°C放置15min ;然後12000rpm離心10min，取上清，再用70%乙醇洗2次，室溫晾乾，加30 μ I去離子水溶解。
[0030]拼接在一起的MMP基因上下遊序列和ΡΕΤ32載體經瓊脂糖凝膠電泳定量後，以10:1的比例進行連接，通過雙酶切將拼接在一起的MMP基因上下遊序列插入到ρΕΤ32載體中。程序:16°C過夜；連接產物65°C滅火lOmin。
[0031]2, MIMP基因缺失的植物乳酸桿菌(MMP-knockoutLP, LPKM)的建立
[0032]取10 μ I的連接產物轉染感受態的植物乳酸桿菌(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號:CGMCCN0.1258)，冰上孵育30min，42°C熱激lmin，加無抗的LB培養基400μ l，200rpm，37°C孵育lh。然後取100 μ I塗覆在氨苄青黴素(Ampici 11 in, Amp)抗性的平板上，37°C培養16h，篩選得到MIMP基因缺失的植物乳酸桿菌(LPKM)。
[0033]我們對LPKM進行了 MMP表達水平的驗證以及粘附率的驗證。通過PCR擴增驗證了 LPKM基因組中缺失了 183-bp的一段序列，如圖1所示，其中LP為正常表達MMP的植物乳酸桿菌；通過Westernblot驗證了 LPKM表達MMP缺失，如圖2所示；粘附率檢測結果表明LPKM對NCM460細胞的粘附率明顯下降，如圖3所示；而LPKM對於降低EPEC粘附率的效果也較差，如圖4所示(*，P〈0.05，vs.對照組，#，P〈0.05，vs.*)，圖3和圖4檢測結果顯示本發明提供的益生菌具有低粘附活性，說明了乳酸桿菌表面蛋白的活性片段MMP對腸上皮細胞有粘附功能，從而競爭抑制致病菌的粘附，降低致病菌對人體腸道屏障功能的損害。
[0034]以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為範例，本發明並不限制於以上描述的具體實施例。對於本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的範疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和範圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的範圍內。
【權利要求】
1.一種低粘附活性的益生菌，其特徵在於，所述益生菌為MMP基因缺失的乳酸桿菌。
2.根據權利要求1所述的益生菌，其特徵在於，用含有拼接在一起的中間去掉MMP基因序列同時保證閱讀框不發生變化的MMP基因上下遊序列的重組載體轉染乳酸桿菌，得到所述益生菌。
3.根據權利要求2所述的益生菌，其特徵在於，所述MMP基因上下遊序列包含至少30個鹼基對的MMP基因上遊序列和至少30個鹼基對的MMP基因下遊序列。
4.根據權利要求1所述的益生菌，其特徵在於，所述乳酸桿菌選自保加利亞乳桿菌、乾酪乳酸菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌、短乳桿菌。
5.一種製備權利要求1-4中任意一項所述益生菌的方法，其特徵在於，用含有拼接在一起的中間去掉MMP基因序列同時保證閱讀框不發生變化的MMP基因上下遊序列的重組載體轉染乳酸桿菌，從而得到MIMP基因缺失的乳酸桿菌。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟1，通過PCR方式獲得拼接在一起的中間去掉MMP基因序列同時保證閱讀框不發生變化的MMP基因上下遊序列，該MMP基因上下遊序列中的MMP基因上遊序列和MMP基因下遊序列分別加載有酶切位點； 步驟2，通過雙酶切將步驟I獲得的拼接在一起的中間去掉MMP基因序列同時保證閱讀框不發生變化的MMP基因上下遊序列插入到表達質粒中，獲得乳酸桿菌MMP基因敲除載體； 步驟3，用步驟2獲得的乳酸桿菌MIMP基因敲除載體轉染感受態的乳酸桿菌，從而得到MIMP基因缺失的乳酸桿菌。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述MMP基因上下遊序列中的MMP基因上遊序列和MMP基因下遊序列分別加載有Bgl II酶切位點和Xho I酶切位點。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述表達質粒為PET32質粒。
9.一種權利要求1所述益生菌在驗證乳酸桿菌表面蛋白的活性片段MMP功能中的應用。
10. 一種乳酸桿菌MIMP基因敲除載體，其特徵在於，包含PET32質粒序列和拼接在一起的中間去掉MMP基因序列同時保證閱讀框不發生變化的MMP基因上下遊序列。
【文檔編號】C12R1/23GK104178436SQ201310188035
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月20日 優先權日:2013年5月20日
【發明者】劉志華, 秦環龍, 汪建平 申請人:劉志華