一種促胰島細胞增殖培養液及其製備方法

2023-08-10 08:20:06 1

一種促胰島細胞增殖培養液及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種促胰島細胞增殖培養液，它以常用細胞培養基為基礎培養基，添加本發明化合物1～8中任意一種或者多種化合物。本發明還公開了前述培養液的製備方法，以及化合物1～8在製備促胰島細胞增殖的培養液中的用途。本發明培養液可以有效促進胰島細胞增殖，實現了胰島細胞的體外快速培養，為糖尿病患者的胰島細胞移植提供了可靠的來源。
【專利說明】一種促胰島細胞增殖培養液及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物領域，特別涉及一種促胰島細胞增殖的培養液及其製備方法。
【背景技術】
[0002]糖尿病是一種由胰島素分泌不足導致的慢性代謝疾病，尤其是血糖水平的異常，晚期可導致腎臟、眼底、周圍神經系統和血管等組織器官的病變，並伴有失明、腎衰等嚴重症狀的罹患風險。據估計目前全球有超過1.5億人患有糖尿病，而預計在2025年糖尿病患者將達到3億。
[0003]目前糖尿病主要可分為兩種類型:一型糖尿病和二型糖尿病。前者主要是由胰島素的絕對不足引起的，而胰島素絕對量的不足則是由於人體中唯一可以分泌胰島素的細胞一胰島β細胞的嚴重不足。目前研究表明，胰島β細胞缺失的主要原因是T細胞對β細胞的自體免疫攻擊。二型糖尿病則的主要病因則是胰島素的靶器官(肝臟、肌肉等)對胰島不敏感，而更深層的病因較一型糖尿病更為複雜。二型糖尿病在初期只表現為胰島素的相對缺乏，並伴隨有應激性的胰島增殖和高胰島素表現，而在晚期由於長期高血糖導致的胰島β細胞的大量凋亡，胰島素水平也大量下降。因此，針對一型和二型糖尿病，胰腺或胰島移植都是最理想的治療方案之一。[0004]胰腺器官移植較胰島移植開展得早，相對而言能提供更長時間的正常胰島素供給，但是胰腺器官移植手術難度高，風險大，作為糖尿病的治療手段並不十分理想。目前，供體胰島的移植是治療糖尿病的最有效手段，胰島細胞按其染色和形態學特點，主要分為α細胞、β細胞、Y細胞及PP細胞，α細胞約佔胰島細胞的20%，分泌胰高血糖素(glucagon);β細胞佔胰島細胞的60%-70%，分泌胰島素(insulin) ； Y細胞佔胰島細胞的10%，分泌「生長抑素」;PP細胞數量很少，分泌胰多肽(pancreatic polyeptide),其中，胰島β細胞分泌胰島素，起調節血糖含量的作用。
[0005]目前，臨床獲得的胰島來源非常有限，需要在體外將供體來源的少量胰島充分擴展和增殖。然而，目前採用常用細胞培養基培養胰島細胞的方式，難以快速、有效的擴增得到大量胰島細胞。

【發明內容】

[0006]為了解決上述問題，本發明提供了一種促胰島細胞增殖的培養液以及8種化合物在製備促胰島細胞增殖的培養液中的用途。
[0007]本發明促胰島細胞增殖培養液，它以常用細胞培養基為基礎培養基，添加有如下任意一種或者多種化合物:
[0008]化合物1:1- (3- (3-氨基-6-甲醯氨基-2-苯基)吡啶_4_哌啶_4_羧酸；
[0009]化合物2:1- (3- (3-氨基-6-甲醯氨基_2_苯基)吡啶_4_哌啶_3_羧酸；
[0010]化合物3:6- ((2- ((4- (2，4- 二氯苯基)-5- (4-甲基-1H-咪唑 _2_ 基)嘧唳~2~基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈；[0011]化合物4:N-(5-甲基-1氫-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉_4_胺；
[0012]化合物5:3_氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶_3_基)_6_苯基吡嗪_2_甲醯胺；
[0013]化合物6:3-氨基4-(4-((二甲)甲基)吡啶-3-基)-6_苯基-2-甲醯胺基；
[0014]化合物7:1-(4-甲氧基苄基)-3_ (5-硝基噻唑_2_基)尿素；
[0015]化合物8:N-(3-異丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲醯胺)_1氫-吡唑_3_甲醯胺。
[0016]常用細胞培養基，是指包含供給細胞營養和促使細胞增殖的基礎物質的培養基，如，RPM1-1640培養基(B卩1640培養基)，最低必須培養基(Minimum Essential Medium,MEM)、DMEM-高糖培養基、DMEM-低糖培養基、DMEM/F12培養基、M-199培養基等等。
[0017]所述的培養液添加的化合物的終濃度不低於ΙΟηΜ。優選地，所述化合物的終濃度不低於ΙΟΟηΜ。進一步優選地，所述化合物的終濃度為IOOnM~100 μ M。
[0018]所述常用細胞培養基是1640培養基、最低必須培養基、DMEM-高糖培養基、DMEM-低糖培養基、DMEM/F12培養基或Μ-199培養基。
[0019]所述培養液中還添加有胰島素樣生長因子、上皮生長因子、青黴素、鏈黴素、巰基乙醇、葡萄糖或胎牛血清。優選地，所述培養液中含有胰島素樣生長因子和上皮生長因子，其中，胰島素樣生長因子的終濃度為10ng/ml，上皮生長因子的終濃度為10ng/ml。
[0020]所述胰島細胞為胰島β細胞。胰島β細胞又叫胰島B細胞。
[0021]本發明前述培養液的製備方法，步驟如下:按照前述配比取原料，混勻，即可。
[0022]如下化合物I~8中任意一種或者多種在製備促進胰島細胞增殖的培養液中的用途:
[0023]化合物1:1- (3- (3-氨基-6-甲醯氨基_2_苯基)吡啶_4_哌啶_4_羧酸；
[0024] 化合物2:1- (3- (3-氨基-6-甲醯氨基_2_苯基)吡啶_4_哌啶_3_羧酸；
[0025]化合物3:6_ ((2- ((4- (2，4_ 二氯苯基)_5_ (4-甲基-1H-咪唑 _2_ 基)嘧唳~2~基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈；
[0026]化合物4:N- (5-甲基-1氫-吡唑-3-基)_2_苯基喹唑啉_4_胺；
[0027]化合物5:3-氨基-N- (4- (4-氨基哌啶_1_基)吡啶_3_基)_6_苯基吡嗪_2_甲醯胺；
[0028]化合物6:3_氨基-N- (4- (( 二甲)甲基)吡啶_3_基)_6_苯基_2_甲醯胺基；
[0029]化合物7: 1-(4-甲氧基苄基)-3- (5-硝基噻唑_2_基)尿素；
[0030]化合物8:N-(3-異丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲醯胺)_1氫-吡唑_3_甲醯胺。
[0031]所述胰島細胞為胰島β細胞。
[0032]本發明化合物I~8可以有效促進胰島β細胞增殖，採用本發明培養液體外培養胰島細胞，可以快速培養得到大量胰島β細胞，用於體內移植治療糖尿病，臨床應用前景良好。
[0033]顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0034]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1胰島分離體系示意圖；
[0036]圖2DTZ染色圖片，紅棕色為胰島細胞；
[0037]圖3Annexin-V/PI染色評價原代培養的胰島的存活率，綠色的Annexin-V螢光(染存活細胞)和紅色的PI螢光(染死亡細胞)；
[0038]圖4免疫螢光染色結果(ΙΟηΜ)，胰島素C-肽綠色螢光染色提示陽性胰島beta細胞染色，DAPI的藍色染色提示細胞核染色。紅色、黃色、橙色和紫色螢光染色均提示為k1-67陽性染色(k1-67陽性染色本身為紅色螢光，紅色與胰島素C-肽的綠色螢光重合顯示為黃色和橙色，而紅色與DAPI的藍色螢光重合顯示為紫色)。A1,A2:DMS00.1%;BI, B2:K5010nM ；C1, C2:K5210nM ；
[0039]圖5免疫螢光染色結果(ΙΟΟηΜ)，胰島素C-肽綠色螢光染色提示陽性胰島beta細胞染色，DAPI的藍色染色提示細胞核染色。紅色、黃色、橙色和紫色螢光染色均提示為k1-67陽性染色(k1-67陽性染色本身為紅色螢光，紅色與胰島素C-肽的綠色螢光重合顯示為黃色和橙色，而紅色與DAPI的藍色螢光重合顯示為紫色)。Al, A2:DMSO0.1%;BI,B2:K50100nM ；C1,C2:K52100nM ；
[0040]圖6免疫螢光染色結果(100 μ M)，胰島素C-肽綠色螢光染色提示陽性胰島beta細胞染色，DAPI的藍色染色提示細胞核染色。紅色、黃色、橙色和紫色螢光染色均提示為k1-67陽性染色(k1-67陽性染色本身為紅色螢光，紅色與胰島素C-肽的綠色螢光重合顯示為黃色和橙色，而紅色與DAPI的藍色螢光重合顯示為紫色)。A1,A2:DMS00.1%;Β1,Β2:Κ50100μΜ ；Cl,C2:K52100yM ；
[0041 ] 圖7IOnM和IOOnM的K50和K52對原代培養的大鼠β _胰島細胞增殖的作用(用k1-67增殖指數表示胰島細胞增值率，即胰島beta-細胞增殖分數，k1-67增殖指數為K1-67陽性染色細胞數佔總的C-肽綠色螢光染色細胞的百分率)。數據表示為means土SEM，n=4/組，多樣本均數間的比較採用One-wayANOVA檢驗，組間的兩兩比較採用Studen_tNewman-Keuls 檢驗，*P〈0.05vs.DMSO (1/1000)處理的對照組；
[0042]圖8100 μ M的Κ50和Κ52對原代培養的大鼠β _胰島細胞增殖的作用(用k1-67增殖指數表示胰島細胞增值率，即胰島beta-細胞增殖分數，k1-67增殖指數為Ki_67陽性染色細胞數佔總的C-肽綠 色螢光染色細胞的百分率)。數據表示為means 土 SEM，n=3/組，多樣本均數間的比較採用One-way ANOVA檢驗,組間的兩兩比較採用Studen-t Newman-Keuls檢驗，*P〈0.05vs.DMSO (1/1000)處理的對照組；
[0043]圖910nM和IOOnM的K50和K52對大鼠胰島細胞瘤來源的INS-1細胞系增殖的作用，採用BrdU-ELISA法檢測INS-1細胞增殖活性，用酶標儀檢測490nm處的ELISA反應產物的吸光度值。數據表示為means土SEM, n=3/組,多樣本均數間的比較採用One-way ANOVA檢驗，組間的兩兩比較米用Studen-t Newman-Keuls檢驗，*Ρ〈0.05vs.DMSO (1/1000)處理的對照組；
[0044]圖10IOOnM的K51，K53，K54，K55，K56，K57對大鼠胰島細胞瘤來源的INS-1細胞系增殖的作用，採用BrdU-ELISA法檢測INS-1細胞增殖活性，用酶標儀檢測490nm處的ELISA反應產物的吸光度值，數據表示為「mean (SD) 」，n=3/組。【具體實施方式】
[0045]實施例1本發明促胰島細胞增殖培養液的製備
[0046]取RPM1-1640培養基，加入1_ (3- (3_氨基_6_甲醯氨基_2_苯基)吡啶_4_哌啶-4-羧酸至濃度為ΙΟΟηΜ，混勻，即可。
[0047]實施例2本發明促胰島細胞增殖培養液的製備
[0048]取RPM1-1640培養基，加入1_ (3- (3_氨基_6_甲醯氨基_2_苯基)吡啶_4_哌啶-3-羧酸至濃度為100 μ M，混勻，即可。
[0049]實施例3本發明促胰島細胞增殖培養液的製備
[0050]取最低必須培養基，加入6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈至濃度為100 μ M，混勻，即可。
[0051]實施例4本發明促胰島細胞增殖培養液的製備
[0052]取最低必須培養基中，加入N-(5-甲基-1氫-吡唑-3-基)-2_苯基喹唑啉-4-胺至濃度為IOnM,混，即可。
[0053]實施例5本發明促胰島細胞增殖培養液的製備
[0054]取M-199培養基，加入3-氨基-N- (4- (4-氨基哌啶_1_基)吡啶_3_基)_6_苯基吡嗪-2-甲醯胺至濃度為ΙΟηΜ，混勻，即可。
[0055]實施例6本發明促胰島細胞增殖培養液的製備
[0056]取DMEM-高糖培養基，加入3-氨基-N-(4_(( 二甲)甲基)吡啶_3_基)_6_苯基-2-甲醯胺基至濃度為ΙΟηΜ，混勻，即可。
[0057]實施例7本發明促胰島細胞增殖培養液的製備
[0058]取DMEM-低糖培養基，加入1-(4-甲氧基苄基)_3_ (5_硝基噻唑_2_基)尿素至濃度為ΙΟηΜ，混勻，即可。
[0059]實施例8本發明促胰島細胞增殖培養液的製備
[0060]取DMEM/F12培養基，加入N- (3_異丙氧基丙基)_4_ (4_甲基苯甲醯胺)_1氫-吡唑-3-甲醯胺至濃度為ΙΟΟηΜ，混勻，即可。
[0061]以下用實驗例的方式說明本發明的有益效果:
[0062]實驗材料:
[0063] SD雄性大鼠，300~500克，購於四川大學實驗動物中心；膠原酶XI，購於美國Sigma公司；Ficoll400購於天津市聚合科貿有限公司；雙硫腙(dithizone, DTZ)購於上海試劑三廠；INS-1細胞來源於華西醫院再生醫學研究所細胞庫；Brdu ELISA試劑盒，購於羅氏公司。其餘試劑為市售分析純產品。
[0064]所用化合物，均為市售品:
[0065]化合物1:k50
[0066]l-(3-(3-amino-6-phenylpyrazine-2-carboxamido)pyridin-4-yl)piperidine-4-carbox ylic acid
[0067]1- (3- (3-氨基-6-甲醯氨基-2-苯基)吡啶_4_哌啶_4_羧酸
[0068]化合物2:k52
[0069]l-(3-(3-amino-6-phenylpyrazine-2-carboxamido)pyridin-4-yl)piperidine-3-ca rboxylic acid
[0070]1- (3- (3-氨基-6-甲醯氨基-2-苯基)吡啶_4_哌啶_3_羧酸
[0071]化合物3:K51
[0072]6-((2-((4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-lH-1midazol-2-yl)pyrimidin-2-yl)ami no)ethyl)amino)nicotinonitrile ；
[0073]6-((2-((4-(2，4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶 _2_ 基)氨基)乙基)氣基)尼古丁臆；
[0074]化合物4:K53
[0075]N-(5-methyl-lH-pyrazol-3-yl)-2-phenylquinazolin-4_amine
[0076]N-(5-甲基-1氫-吡唑-3-基)-2_苯基喹唑啉_4_胺
[0077]化合物5:K54[0078]3-amino-N- (4_(4-aminopiperidin-1-yl)pyridin-3-yl)-6-phenylpyrazine-2-carb oxamide
[0079]3-氨基-N- (4- (4-氨基哌啶_1_基)吡啶_3_基)_6_苯基吡嗪_2_甲醯胺
[0080]化合物6:K55
[0081]3-amino-N-(4_((dimethylamino)methyl)pyridin-3-yl)-6-phenylpyrazine-2-car boxamide
[0082]3-氨基-N- (4- (( 二甲)甲基)吡啶-3-基)_6_苯基_2_甲醯胺基
[0083]化合物7:K56
[0084]1-(4-methoxybenzyl)_3_ (5-nitrothiazol-2-yl)urea
[0085]1-(4-甲氧基苄基)-3- (5-硝基噻唑-2-基)尿素
[0086]化合物8:K57
[0087]N-(3-1sopropoxypropyl)~4~(4-methylbenzamido)-lH-pyrazole-3-carboxamide
[0088]N-(3-異丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲醯胺)_1氫-吡唑_3_甲醯胺
[0089]實施例1本發明培養液誘導體外原代培養的大鼠胰島細胞
[0090]1、實驗方法
[0091]1.1胰島細胞的獲得
[0092]a)取2隻大鼠麻醉後，腹部常規消毒去毛，作腹正中切口及雙側肋緣下切口，顯露肝門，切除劍狀軟骨。用棉籤將大鼠小腸推至腹腔左側，暴露膽管遠端。
[0093]b)在膽總管匯入十二指腸的入口處結紮，縫合時避免接觸胰腺。於膽管近心端使用穿刺針原位插管，並結紮膽總管近心端。
[0094]c)動物處死，經膽總管緩慢注入0.5mg/mL膠原酶XI溶液10mL，使胰腺原位緩慢膨脹。沿腸壁分離胰腺，切取後立即置入37°C水浴靜止消化約15min ;取出劇烈振搖Imin分散胰腺，使呈細沙狀，立即加入10倍體積的4°C預冷Hank』 s液(含0.1%牛血清白蛋白)終止消化。
[0095]d)60目網篩過濾，用50mL注射器15G針頭從篩上噴過，衝洗網上組織。於4°C離心(以離心半徑15cm, 1000r/min離心lmin);棄上清；同法離心3min ;Hank』 s液重懸組織，80目網篩過濾，同法離心後收集沉澱。以上步驟均在超淨臺中進行。[0096]e)胰島的純化:首先配製Euro-Ficoll分離液，即Euro-collin保存液:含1 Smmol /T, KC1.1 Smmol /T, KH2P04、43mmol/L K2HP04、10mmol/LNaHC03、200mmol/L 葡萄糖，pH7.2 ;Euro_Ficoll液:將不同比例的Ficoll400溶解於Euro-collin中，得到不同比重(D)的分離液，如圖1 所示，(Fl:D=1.132，F2:D=1.108，F3:D=1.096，F4:D=1.069，F5:D=L 023)，4°C避光保存。在50mL離心管中加入12mL Fl鋪底，IOmL F2重懸沉澱組織並小心加至Fl上，注意防止氣泡混入影響細胞重懸效果。依次小心加入F4和F5各6mL。以離心半徑15cm，2000r/min於4°C緩慢升降離心20min，收集位於Fl和F2界面的胰島，Hank’s液離心洗滌3次，備用。
[0097]f)胰島特異性計數:將DTZ工作液50 μ L與純化後的胰島約100 μ L混合5min，顯微鏡下計數DTZ染為猩紅色的細胞團數量。
[0098]g)胰島活性鑑定:Annexin_V/PI溶液10 μ L與100 μ L胰島製備物混合IOmin,在螢光顯微鏡下分別用490nm和510nm激發光可分別見到綠色的Annexin-V螢光(存活細胞)和紅色的PI螢光(死亡細胞)。用CXD成像系統採集圖像。
[0099]1.2胰島細胞的體外擴增
[0100]原代培養的胰島均勻接種於6孔板中，在培養基中穩定24h，略為貼壁後，分別取K50和K52加入1640培養基(含IGF10ng/ml，EGF10ng/ml),使化合物的終濃度分別達ΙΟηΜ、IOOnM和100 μ M0以含0.1%DMS0的1640培養基作為對照組培養基。
[0101]藥物刺激72h後，收取細胞塗片進行普通步驟的免疫螢光染色。分別使用抗大鼠胰島素，抗大鼠k1-67抗體進行雙染，最後細胞核復染DAPI。在雷射共聚焦顯微鏡下成像，根據胰島素陽性(綠色)的細胞中，出現k1-67陽性(紅色)佔總β -細胞(綠色)的百分率測定細胞增殖率。
[0102]Κ?67是一種增殖細胞相關的核抗原，可以標記細胞增殖狀態其中，具有Ki67多肽的細胞為新增殖細胞，因此，通過檢測細胞是否表達Ki67多肽即可確定其是否為新增殖細胞。
[0103]2、實驗結果
[0104]如圖1~3所示，本發明分離得到了胰島細胞，純度在80%以上，成活率達90%以上。
[0105]如圖4~8所示:
[0106]與對照組(1640培養基中加DMS0)相比，在1640培養基中加入IOnM的K50或K52(圖4和圖7)後，細胞增殖速度加快，說明終濃度為IOnM的K50或K52可以促進大鼠胰島β細胞的增殖；
[0107]與對照組(1640培養基中加DMSO^g比，在1640培養基中加入IOOnM的Κ50或Κ52(圖5和圖7)後，細胞增殖速度明顯加快(Ρ〈0.05，η=4)，說明終濃度為IOOnM的Κ50和Κ52可以促進大鼠胰島β細胞的增殖；
[0108]與對照組(1640培養基中加DMS0)相比，在1640培養基中加入100 μ M的Κ50或Κ52 (圖6和圖8)後，細胞增殖速度明顯加快(Ρ〈0.05，η=3)，說明終濃度為100 μ M的Κ50或Κ52可以促進大鼠胰島β細胞的增殖；
[0109]如圖7和 圖8所示，隨著Κ50或Κ52濃度的增加，它們的促胰島細胞增殖作用增強。
[0110]實驗結果說明，本發明Κ50或者Κ52可以促進大鼠胰島β細胞增殖，濃度大於等於IOOnM時，效果明顯。
[0111]實施例2本發明培養液誘導INS-1細胞
[0112]1、實驗方法
[0113]取購買的胰島β細胞株INS-1，快速解凍後分裝入60mm培養皿中，加入含IOOmL/L胎牛血清RPMI1640完全培養基(含青黴素100kU/L、鏈黴素100mg/L、50 μ mol/L巰基乙醇、lOmmol/L葡萄糖)，單層培養和孵化於50mL/L CO2培養箱中、37°C、950mL/L溼度條件下培養。細胞融合率90%左右以消化液(含0.25%Trypsin、0.53mM EDTA)消化，接種於96孔板，細胞密度為7000個/孔，培養至融合率為70%~80%，使用無血清培養基飢餓24h。
[0114]然後換為分別含IOnM和IOOnM的K50和K52的RPMI1640培養基繼續培養22h，以含0.1%DMS0的1640培養基作為對照組培養基，加入Brdu繼續培養2h，然後按照BrdUELISA試劑盒說明書進行實驗，即細胞加核酸酶溶液於37°C孵育30min，以PBS衝洗細胞3次，用過氧化物酶標記BrdU抗體，37°C孵育30min。PBS衝洗細胞3次，以過氧化物酶底物室溫染色15min。用酶標儀檢測樣本在490nm處的吸光度值。
[0115]用同樣的方法對IOOnM的K51，K53，K54，K55，K56，K57進行試驗，觀察藥物對INS-1細胞增殖的影響。
[0116]2、實驗結果
[0117]如圖9所示，與對照組(1640培養基中加DMS0)相比，在1640培養基中加入IOnM的K50或K52後，INS-1胰島β細胞增殖速度加快，加入IOOnM的Κ50或Κ52時，細胞增殖速度明顯更快(Ρ〈0.05，η=3)；
[0118]如圖10所示，與對照組(1640培養基中加DMSO^比，在1640培養基中加入IOOnM的Κ51,Κ53, Κ54，Κ55，Κ56或Κ57後，INS-1胰島β細胞增殖速度明顯加快(Ρ〈0.05，η=3)。
[0119]實驗結果說明，本發明Κ50、Κ51、Κ52、Κ53，Κ54，Κ55，Κ56，Κ57均可以促進胰島β
細胞的增殖。
[0120] 綜上，本發明化合物I~8可以有效促進胰島細胞增殖，採用本發明培養液培養胰島細胞，細胞增殖速度快，可快速得到大量胰島細胞，為糖尿病患者的胰島移植打下了良好的基礎。
【權利要求】
1.一種促胰島細胞增殖培養液，其特徵在於:它以常用細胞培養基為基礎培養基，添加有如下任意一種或者多種化合物: 化合物1:1- (3- (3-氨基-6-甲醯氨基-2-苯基)吡啶-4-哌啶-4-羧酸； 化合物2:1- (3- (3-氨基-6-甲醯氨基-2-苯基)吡啶-4-哌啶-3-羧酸； 化合物3:6-((2-((4-(2，4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶_2_基)氣基)乙基)氣基)尼古丁臆； 化合物4:N- (5-甲基-1氫-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉-4-胺； 化合物5:3_氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶-3-基)-6-苯基吡嗪-2-甲醯胺； 化合物6:3_氨基-N- (4- (( 二甲)甲基)吡啶-3-基)-6-苯基-2-甲醯胺基； 化合物7: 1-(4-甲氧基苄基)-3- (5-硝基噻唑-2-基)尿素； 化合物8:N-(3-異丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲醯胺)-1氫-吡唑-3-甲醯胺。
2.根據權利要求1所述的培養液，其特徵在於:添加的化合物的終濃度不低於ΙΟηΜ。
3.根據權利要求2所述的培養液，其特徵在於:所述化合物的終濃度不低於ΙΟΟηΜ。
4.根據權利要求3所述的培養液，其特徵在於:所述化合物的終濃度為IOOnM~100 μ Μ。
5.根據權利要求1所述的培養液，其特徵在於:所述常用細胞培養基是1640培養基、最低必須培養基、DMEM-高糖培養基、DMEM-低糖培養基、DMEM/F12培養基或Μ-199培養基。
6.根據權利要求1所述的培養液，其特徵在於:所述培養液中還添加有胰島素樣生長因子、上皮生長因子、青黴素、鏈黴素、巰基乙醇、葡萄糖或胎牛血清。
7.根據權利要求6所述的培養液，其特徵在於:所述培養液中含有胰島素樣生長因子和上皮生長因子，其中，胰島素樣生長因子的終濃度為10ng/ml，上皮生長因子的終濃度為10ng/ml.
8.根據權利要求1所述的培養液，其特徵在於:所述胰島細胞為胰島β細胞。
9.權利要求1~8任意一項所述培養液的製備方法，其特徵在於:步驟如下:按照權利要求I~8任意一項所述配比取原料，混勻，即可。
10.如下化合物I~8中任意一種或者多種在製備促進胰島細胞增殖的培養液中的用途: 化合物1:1- (3- (3-氨基-6-甲醯氨基-2-苯基)吡啶-4-哌啶-4-羧酸； 化合物2:1- (3- (3-氨基-6-甲醯氨基-2-苯基)吡啶-4-哌啶-3-羧酸； 化合物3:6-((2-((4-(2，4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶_2_基)氣基)乙基)氣基)尼古丁臆； 化合物4:N- (5-甲基-1氫-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉-4-胺； 化合物5:3_氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶-3-基)-6-苯基吡嗪-2-甲醯胺； 化合物6:3_氨基-N- (4- (( 二甲)甲基)吡啶-3-基)-6-苯基-2-甲醯胺基； 化合物7: 1-(4-甲氧基苄基)-3- (5-硝基噻唑-2-基)尿素； 化合物8:N-(3-異丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲醯胺)-1氫-吡唑-3-甲醯胺； 優選地，所述胰島細胞為胰島β細胞。
【文檔編號】C12N5/071GK103911340SQ201310747077
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年12月30日 優先權日:2013年1月4日
【發明者】侯睿 申請人:廣州康睿生物醫藥科技有限公司