酪酸菌活菌製劑及其製備方法
2023-07-12 10:18:46 2
專利名稱：酪酸菌活菌製劑及其製備方法
技術領域：
本發明屬於微生物製劑技術領域，涉及一種酪酸菌活菌製劑及其製備方法。
背景技術：
酪酸菌即丁酸梭菌(Clostridium butyrium)是歸屬於梭菌屬的革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，存在於土壤、動物和人體的腸道中。其主要代謝產物為丁酸、乙酸，其中丁酸為動物體腸道上皮組織細胞新陳代謝不可缺少的能源，對腸道疾患所致腸上皮組織的修復具有十分重要的作用；酪酸菌是人和動物體內正常菌群之一，它能夠促進機體腸道內有益菌群(雙歧桿菌、乳酸菌等)的增殖和發育，抑制腸道內腐敗菌和有害菌的生長繁殖，糾正腸道內菌群紊亂，減少和降低腸毒素的產生；與雙歧桿菌、乳酸菌等腸道有益菌不同的是，由於酪酸菌具有芽孢，因而對外界環境有較強的抵抗力，把它加熱至90℃10分鐘、100℃5分鐘不會失活，在PH 1.0-5.0的環境中仍能存活，在PH 4.0-9.8的環境中能適合其發育生長，其固體活菌製劑在室溫、乾燥情況下保存具有良好的穩定性，保存2年以上，未見活菌顯著減少。
正是由於酪酸菌具有其獨特的生物特點，早在四十年代，日本就已經把它開發成治療胃腸道疾病的藥品。近半個世紀來，日本產的酪酸菌活菌製劑——米雅系列產品在日本、韓國、中國等亞洲國家和地區廣泛應用於消化系統、小兒、外科、腫瘤、婦產科等種種原因引起的腸道菌群失調、急慢性腹瀉、腸易激症候群、抗生素相關性腸炎、便秘或腹瀉便秘交替症等疾病的治療，療效確切，另外，酪酸菌製劑亦可作為腸炎、各種肝病、化放療造成人體免疫力下降、菌群失調的良好輔助治療藥物。
在本世紀以前，我國沒有自己生產的酪酸菌活菌製劑產品，中國各大醫院臨床上一直是應用的日本產品。近兩年來，國內先後有兩家企業取得了酪酸菌活菌製劑產品的新藥證書，並實現了該產品的產業化，但還存在著生產規模偏小，冷凍乾燥菌粉活菌含量還不夠高，芽孢形成率偏低，生產成本高，產品存放穩定性差等問題。但是，目前尚未發現獸用酪酸菌活菌製劑的生產和應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種高芽孢形成率、高活菌含量的酪酸菌活菌製劑。
本發明的另一目的是提供一種酪酸菌活菌製劑的製備方法為實現上述目的，本發明採取了如下技術方案本發明酪酸菌活菌製劑，由酪酸菌在酪酸菌種子培養基中經三級種子擴大培養和在酪酸菌發酵培養基中發酵，再經菌體收集、乾燥制粉、菌粉檢驗、配料、成品檢驗、包裝工序製得；所說酪酸菌種子培養基由下述原料及重量配比組成蛋白腖0.5％～2.0％、酵母膏0.3％～1.8％、磷酸氫二鉀0.02％～0.5％、磷酸二氫鉀0.02％～0.5％、硫酸鎂0.02％～0.2％、葡萄糖0.8％～2.0％、水94.5％～96.8％，培養基的PH 5.0～8.5；
所說酪酸菌發酵培養基由下述原料及重量配比組成蛋白腖0.5％～2.0％、酵母膏0.3％～1.8％、磷酸氫二鉀0.02％～0.5％、磷酸二氫鉀0.02％～0.5％、硫酸鎂0.02％～0.2％、澱粉0.2％～2.0％、碳酸鈣0.1％～1.0％、水93.8％～97.0％，培養基的PH 5.0～8.5。
本發明酪酸菌活菌製劑的製備方法依次由下述工藝步驟組成1、一級種子培養取酪酸菌生產種子凍幹管菌種，接種於酪酸菌種子培養基中，在30～38℃厭氧培養14～18h；2、二級種子培養一級種子以5～10％的接種量接種於酪酸菌種子培養基中，在30～38℃厭氧培養14～18h；3、三級種子培養二級種子以5～10％的接種量接種於酪酸菌種子培養基，在30～38℃厭氧培養13～18h，各級種子培養完畢均應檢查其生長狀態及純度；4、發酵三級種子以5～10％的接種量接種於酪酸菌發酵培養基，控制罐壓0.04MPa～0.06MPa，在30～38℃厭氧發酵培養16～24h，直至芽孢形成率＞80％，發酵完畢應檢查其有無汙染，如有汙染應予以廢棄；5、菌體收集經檢驗合格的發酵菌液，採用高速管式離心機收集菌體，轉速≥16000r/min，獲得溼菌泥；6、乾燥制粉溼菌泥稱重，按1∶2～10的重量比，加入重量比為20％的無菌脫脂奶液，混合均勻，進行真空冷凍乾燥，先在-40℃預凍2～3h，然後抽真空，真空度為2～20Pa，乾燥過程中溫度逐漸升至28℃，整個乾燥過程為20～28h。乾燥完畢後粉碎，過80目篩，製成菌粉；7、菌粉檢驗每克菌粉含酪酸菌活菌數不少於1.0×109個；8、配料將事先在120℃乾燥4～6h的玉米澱粉和步驟6製成的菌粉按重量配比9～50∶1的比例進行配料混合，即得本發明酪酸菌活菌製劑的成品；9、成品檢驗要求每克成品含酪酸菌活菌數不少於1.0×108個；10、包裝出廠包裝後經抽樣進行全檢，合格後方可出廠。
所述培養基的最適PH值為6.5～7.5，最適發酵溫度為36～37℃。
本發明製備的酪酸菌活菌製劑，芽孢率高、活菌含量高、價格低廉、人獸兩用，可用於各種原因引起的人體腸道菌群失調、急慢性腹瀉、腸易激綜合症、與抗生素相關性腸炎、便秘或腹瀉便秘交替症等疾病的治療，而且通過對豬、雞的毒理、藥理及藥效學研究和大規模的臨床試驗證明在飼料中添加3.0‰的酪酸菌活菌製劑，對豬、雞無不良影響，仔豬腹瀉發病率降低了36.9％，並有較好的預防和促生長作用；用酪酸菌活菌製劑治療仔豬、雛雞白痢病，均有較好的療效，平均治癒率分別為80.64％和95.91％，達到甚至超過了抗菌素的平均治癒率；在飼料中添加0.5‰～1.0‰的酪酸菌活菌製劑，可有效預防雞、豬的腸道疾病，並有效地促進它們的生長。
具體實施例方式
以500升發酵罐為例實施例1酪酸菌種子培養基由下述原料及重量配比組成蛋白腖0.5、酵母膏1.8、磷酸氫二鉀0.5、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鎂0.2、葡萄糖2.0、水、94.5(水按ml計，餘者按g計)，種子培養的PH5.0～6.0；酪酸菌發酵培養基由下述原料及重量配比組成蛋白腖0.5、酵母膏1.8、磷酸氫二鉀0.5、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鎂0.2、澱粉2.0、碳酸鈣1.0、水93.5(水按ml計，餘者按g計)，發酵培養基的PH5.0～6.0；酪酸菌冷凍管菌種由江蘇省微生物研究所有限責任公司提供按下述工藝步驟完成1、一級種子的培養在150ml三角瓶中裝有種子培養基100ml，121℃滅菌30min後，接入酪酸菌冷凍管菌種，於厭氧條件下培養，溫度30～31℃，培養14h。
2、二級種子培養在2000ml三角瓶中裝有種子培養基1000ml，121℃滅菌30min後接入長好的一級種子50ml，於厭氧條件下培養，溫度30～31℃，培養14h。
3、三級種子培養在50升罐中裝有培養基19升，121℃滅菌30min，接入長好的二級種子1升，於厭氧條件下培養，溫度30～31℃，培養13～15h。
4、500升發酵罐培養將發酵培養基裝量380升，121℃滅菌30min，接入長好的三級種子20升，控制罐壓0.04MPa～0.06MPa，發酵溫度30～31℃，培養時間16～24h。
5、菌體收集將培養好的發酵液用管式離心機收集菌體，轉速≥16000r/min，獲得溼菌泥。
6、乾燥制粉將溼菌泥與重量比為20％的無菌脫脂奶按1∶2的重量比混勻，裝入冷凍乾燥機中進行冷凍乾燥，先在-40℃預凍2～3h，然後抽真空，真空度為2～20Pa，乾燥過程中溫度逐漸升至28℃，整個乾燥過程為20～28h。乾燥完畢，將幹菌塊進行粉碎、過80目篩，製成菌粉。採用上述工藝可得冷凍乾燥菌粉2.8～3.0Kg，菌粉含酪酸菌活菌數≥1.0×109個/克。
7、成品製備根據菌粉的活菌數加入適量的輔料混勻製成成品，每克成品含酪酸菌活菌數不少於1.0×108個。輔料為事先120℃乾燥4～6h的玉米澱粉，將菌粉和輔料充分混合後包裝成不同規格的產品。
實施例2 根據實施例1，酪酸菌種子培養基由下述原料及重量配比組成蛋白腖1.25、酵母膏1.15、磷酸氫二鉀0.26、磷酸二氫鉀0.26、硫酸鎂0.11、葡萄糖1.4、水95.57(水按ml計，餘者按g計)，種子培養的PH6.5～7.5；酪酸菌發酵培養基由下述原料及重量配比組成蛋白腖1.25、酵母膏1.25、磷酸氫二鉀0.26、磷酸二氫鉀0.26、硫酸鎂0.11、澱粉1.4、碳酸鈣0.55、水93.5(水按ml計，餘者按g計)，發酵培養基的PH6.5～7.5；1、一級種子的培養將酪酸菌冷凍管分別接種至2個裝有110ml種子培養基的150ml三角瓶中，於厭氧條件下培養，溫度34-35℃，培養16h。
2、二級種子的培養在2個2000ml三角瓶中裝培養基1390ml，121℃滅菌30min後分別接入長好的一級種子110ml，於厭氧條件下培養，溫度34-35℃，培養16h。
3、三級種子的培養在50升罐中裝培養基27.8升，121℃滅菌30min後接入長好的二級種子2.25升，於厭氧條件下培養，溫度34-35℃，培養15～17h。
4、500升發酵罐培養將上述發酵培養基裝量370升，121℃滅菌30min，接入長好的30升三級種子，控制罐壓0.04MPa～0.06MPa，發酵溫度36～37℃，培養時間16～24h。
5、菌體收集方法同實施例1。
6、乾燥制粉將溼菌泥與20％的無菌脫脂奶按1∶6的比例混勻，裝入冷凍乾燥機中進行冷凍乾燥，真空度為2～20Pa，溫度為-40℃～28℃，整個乾燥過程為20～28h。乾燥完畢，將幹菌塊進行粉碎、過80目篩，製成菌粉。採用上述工藝可得冷凍乾燥菌粉3.0～3.2Kg，菌粉含酪酸菌活菌數≥1.0×109個/克。
7、成品製備方法同實施例1。
實施例3 根據實施例1，酪酸菌種子培養基由下述原料及重量配比組成蛋白腖2.0、酵母膏0.3、磷酸氫二鉀0.02、磷酸二氫鉀0.02、硫酸鎂0.02、葡萄糖0.4、水96.84(水按ml計，餘者按g計)，種子培養基的PH7.5～8.5；酪酸菌發酵培養基由下述原料及重量配比組成蛋白腖、2.0 酵母膏、0.3 磷酸氫二鉀、0.02 磷酸二氫鉀、0.02 硫酸鎂、0.02 澱粉、0.2 碳酸鈣、0.1 水、97.34(水按ml計，餘者按g計)，發酵培養基的PH7.5～8.5；1、一級種子的培養將酪酸菌冷凍管分別接種至2個裝有200ml種子培養基的250ml三角瓶中，於厭氧條件下培養，溫度37～38℃，培養16～18h。
2、二級種子的培養在2個2000ml三角瓶中分別裝培養基1800ml，121℃滅菌30min後分別接入長好的一級種子200ml，於厭氧條件下培養，溫度37-38℃，培養16～18h。
3、三級種子的培養在50升罐中裝培養基36升，121℃滅菌30min後接入長好的二級種子4升，於厭氧條件下培養，溫度37-38℃，培養16～18h。
4、500升發酵罐培養將上述發酵培養基裝量360升，121℃滅菌30min，接入長好的40升三級種子，控制罐壓0.04MPa～0.06MPa，溫度37～38℃，培養時間16～24h。
5、菌體收集方法同實施例1。
6、乾燥制粉將溼菌泥與20％的無菌脫脂奶按1∶10的比例混勻，裝入冷凍乾燥機中進行冷凍乾燥，真空度為2～20Pa，溫度為-40℃～28℃，整個乾燥過程為20～28h。乾燥完畢，將幹菌塊進行粉碎、過80目篩，製成菌粉。採用上述工藝可得冷凍乾燥菌粉3.0～3.2Kg，菌粉含酪酸菌活菌數≥1.0×109個/克。
7、成品製備方法同實施例1。
本發明與國內同類產品相比較，菌種與生產工藝都不相同。主要具有以下優點1、酪酸菌是江蘇省微生物研究所有限責任公司從土壤中自行分離獲得的，菌種穩定性好，產品在室溫保存2年以上，仍能有較高的活菌含量；2、種子培養基和發酵培養基成分都比較簡單，且都是日常易於採購、價格便宜，獲得每千克酪酸菌冷凍乾燥粉(含酪酸菌活菌數≥1.0×109個/克)原料成本為200元，而一般約需400～500元；3、酪酸菌冷凍乾燥粉劑活菌含量高，活菌數在1.0×109～1.0×1010個/克，芽孢含量高，芽孢數≥80％；4、酪酸菌活菌製劑不僅可以用來治療人體胃腸道疾病，而且對豬、雞的白痢病有較好的預防和治療作用，並能有效促進它們的生長。這在國內還是首次。
權利要求
1.一種酪酸菌活菌製劑，其特徵是由酪酸菌在酪酸菌種子培養基中經三級種子擴大培養和在酪酸菌發酵培養基中發酵，再經菌體收集、乾燥制粉、菌粉檢驗、配料、成品檢驗、包裝工序製得；所說酪酸菌種子培養基由下述原料及重量配比組成蛋白腖0.5％～2.0％、酵母膏0.3％～1.8％、磷酸氫二鉀0.02％～0.5％、磷酸二氫鉀0.02％～0.5％、硫酸鎂0.02％～0.2％、葡萄糖0.8％～2.0％、水94.5％～96.8％，培養基的PH 5.0～8.5；所說酪酸菌發酵培養基由下述原料及重量配比組成蛋白腖0.5％～2.0％、酵母膏0.3％～1.8％、磷酸氫二鉀0.02％～0.5％、磷酸二氫鉀0.02％～0.5％、硫酸鎂0.02％～0.2％、澱粉0.2％～2.0％、碳酸鈣0.1％～1.0％、水93.8％～97.0％，培養基的PH 5.0～8.5。
2.根據權利要求1所述的酪酸菌活菌製劑的製備方法其特徵依次由下述工藝步驟組成(1)、一級種子培養取酪酸菌生產種子凍幹管菌種，接種於酪酸菌種子培養基中，在30～38℃厭氧培養14～18h；(2)、二級種子培養一級種子以5～10％的接種量接種於酪酸菌種子培養基中，在30～38℃厭氧培養14～18h；(3)、三級種子培養二級種子以5～10％的接種量接種於酪酸菌種子培養基，在30～38℃厭氧培養13～18h，各級種子培養完畢均應檢查其生長狀態及純度；(4)、發酵三級種子以5～10％的接種量接種於酪酸菌發酵培養基，控制罐壓0.04MPa～0.06MPa，在30～38℃厭氧培養16～24h，直至芽孢形成率＞80％，發酵完畢應檢查其有無汙染，如有汙染應予以廢棄；(5)、菌體收集經檢驗合格的發酵菌液，採用高速管式離心機收集菌體，轉速≥16000r/min，獲得溼菌泥；(6)、乾燥制粉溼菌泥稱重，按1∶2～10的重量比，加入重量比為20％的無菌脫脂奶液，混合均勻，進行真空冷凍乾燥，先在-40℃預凍2～3h，然後抽真空，真空度為2～20Pa，乾燥過程中溫度逐漸升至28℃，整個乾燥過程為20～28h。乾燥完畢後粉碎，過80目篩，製成菌粉；(7)、菌粉檢驗每克菌粉含酪酸菌活菌數不少於1.0×109個；(8)、配料將事先在120℃乾燥4～6h的玉米澱粉和步驟(6)製成的菌粉按重量配比9～50∶1的比例進行配料混合，即得本發明獸用酪酸菌活菌製劑的成品；(9)、成品檢驗要求每克成品含酪酸菌活菌數不少於1.0×108個；(10)、包裝出廠包裝後經抽樣進行金檢，合格後出廠。
3.根據權利要求2所述的酪酸菌活菌製劑的製備方法，其特徵是所述培養基的最適PH值為6.5～7.5，最適發酵溫度為36～37℃。
全文摘要
本發明公開了一種酪酸菌活菌製劑及其製備方法，由酪酸菌在酪酸菌種子培養基中經三級種子擴大培養和在酪酸菌發酵培養基中發酵，再經菌體收集、乾燥制粉、菌粉檢驗、配料、成品檢驗、包裝工序製得；酪酸菌種子培養基由蛋白腖、酵母膏、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖和水組成；酪酸菌發酵培養基由蛋白腖、酵母膏、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、澱粉、碳酸鈣和水組成。本發明製備的酪酸菌活菌製劑，芽孢率高、活菌含量高，價格低廉，人獸兩用。不僅可以用來治療人體胃腸道疾病，而且對豬、雞的白痢病有較好的預防和治療作用，並能有效促進它們的生長。
文檔編號A61P1/00GK101032527SQ20061004443
公開日2007年9月12日 申請日期2006年3月9日 優先權日2006年3月9日
發明者唐寶英, 朱曉慧, 陸茂林, 劉佳, 任穎, 張陽軍 申請人:江蘇省微生物研究所有限責任公司