通過膠帶剝離獲得的皮膚樣品中的皮膚蛋白質的直接分析的製作方法

2023-08-08 06:58:31

專利名稱：:通過膠帶剝離獲得的皮膚樣品中的皮膚蛋白質的直接分析的製作方法
技術領域：
：本發明涉及測定通過膠帶剝離獲得的皮膚量的方法。更具體的說，本發明涉及直接分析通過膠帶剝離獲得的皮膚樣品中蛋白質的方法，用於確定反映取下皮膚量的蛋白質量的測量值。另外，本發明的一個方面涉及一種直接分析膠帶剝離獲得的皮膚樣品中蛋白質的方法，以將獲得的蛋白質測量值與相應的皮膚膽固醇測量值進行組合，來鑑定有動脈粥樣硬化危險的個體、以及有發生動脈粥樣硬化和與高膽固醇水平有關或由於其引起的類似疾病之危險的個體。如所述，本發明的一個方面涉及一種直接分析通過膠帶剝離獲得的皮膚樣品中蛋白質的方法，以將獲得的蛋白質測量值和相應的皮膚膽固醇測量值進行組合，來鑑定有動脈粥樣硬化危險的個體、以及有發生動脈粥樣硬化和與高膽固醇水平有關或由於其引起的類似疾病之危險的個體。許多研究已顯示，動脈粥樣硬化及其併發症，如心臟病發作和休克，在幾乎世界上所有的國家都是發病和死亡的主要原因。成本合算的預防動脈粥樣硬化就需要確定一個人是否有患動脈粥樣硬化的風險，從而採取治療措施並改變其生活方式。確定哪些人屬於高風險人群雖然是期望的目標，但要選擇確定一個人是否有患病風險的最佳方法卻是困難的。一種確定一個人是否有患動脈粥樣硬化風險的被廣泛使用的方法是測定靜脈血漿中的總膽固醇水平(ConsensusConferenceonLoweringBloodCholesteroltoPreventHeartDisease,JAMA，1985，253，第2080頁)。如果患者的膽固醇水平超過240mg/dL，那麼這個患者就被認為有高風險，最近有人提議將此閾值降低到更低的水平。然而，單純憑總膽固醇指標無法精確地預測患者的患病風險。更好的預測方法是分析血漿脂蛋白；尤其有利的是測定低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)月旦固醇水平(TotalandHighDensityLipoproteinCholesterolintheSerumandRiskofMortality,BritishMedicalJournal,1985，290，第1239-1243頁)。利用上述方法雖然有其優點，但是這種方法需要在禁食一段時間後採集血液樣本。而且，採血令人不舒服，有感染的風險，分析血漿脂蛋白和膽固醇水平複雜而昂貴。另外，研究表明，血漿分析並不能完整反映膽固醇在動脈壁和其他組織內的累積過程。在許多情況下，血漿膽固醇水平和完整的脂質檢測(lipidprofile)都與動脈粥樣硬化的嚴重程度無關。膽固醇水平的升高既發生在組織內，也發生在血漿中，研究表明組織膽固醇在動脈粥樣硬化的發展中起主導作用。現已證實，組織(包括皮膚)以與動脈壁相同的方式累積膽固醇，研究表明動脈壁和皮膚內的膽固醇含量呈密切相關關係。例如，從凍幹的皮膚樣本中提取膽固醇，利用傳統的化學和生物化學技術測定(NikitinY.P.，GordienkoI.A.，DolgovA.V.，FilimonovaT.A."Cholesterolcontentintheskinanditscorrelationwithlipidquotientintheseruminnormalsandinpatientswithischemiccardiacdisease",Cardiology,1987，II，第10期，第48-51頁)。這種方法雖然有用，但是很複雜，用於大規模的人群篩選時是很痛苦的。美國專利No.4,458,686描述了一種在皮膚之下或其表面上直接定量測定血液中各種化合物的方法。該方法的根據是利用電化學方法，如通過極譜分析法，測定氧濃度的變化。如果使用的是不會透過皮膚擴散的非揮發性物質，就需要在皮膚下植入酶以影響皮膚表面氧的變化。該專利還公開了使用膽固醇氧化酶通過該方法定量測定膽固醇含量的可能性。由於該方法需要複雜的設備和操作過程，因而需要高技能的人員來完成測定，從而限制了該方法用於篩選大量的人群。皮膚膽固醇含量的測定可用於確定動脈粥樣硬化的嚴重程度，通過標準的實驗室分析方法分析皮膚活檢樣品就可以完成。但是，在採集皮膚樣品時是很痛苦的，並且採樣點有感染的風險。另外，該方法還有一個缺點，那就是較厚的皮膚標本包括幾層皮膚，有最外面的角質層、表皮和真皮。由於真皮層是高度血管化的，因此皮膚活檢樣品含有血管和血管成分。還可能含有汗腺和皮脂腺及其所包含的分泌物。另外，真皮下就是皮下脂肪，皮下脂肪也可能汙染標本。因此，皮膚活檢標本成分複雜，在分析皮膚的膽固醇含量時會得到不真實的數據。美國專利No.5,489,510描述了一種視覺判斷皮膚膽固醇含量的非侵入性方法，該方法使用了一種含有特異性膽固醇結合組分的試劑和一種含有指示劑組分的試劑，後者可根據是否存在與皮膚膽固醇結合的組分來顯示可見的顏色變化。該方法克服了以前方法的許多缺點，滿足了簡單的群體篩選以鑑定個體是否具有動脈粥樣硬化風險的目標。該方法可在手掌皮膚上直接測定，雖然簡單而快捷，但是需要所有接受檢測的人都要到進行檢測的醫生辦公室或診所去檢測。這也會限制進行大規模篩選。現在已經有方法可以測定皮膚的溶劑直接提取物中角質層的脂質(包括膽固醇)摩爾比例，(NorlenL.等，J.Invest.Dermatology72-77，112，1999)。高效液相色譜(HPLC)和氣液色譜與質譜聯用可用於分離和分析脂質。這種分析方法很複雜，而且更重要的是，使用有腐蝕性且刺激的有機溶劑系統提取人皮膚對於常規的測定方法來說是不切實際的。利用膠帶剝離方法來確定皮膚角質層的脂質組成見A.Weerheim和M.Ponec(Arch.Dermatol.Res.，191-199，293，2001)的描述。在該研究中，在用膠帶粘貼皮膚再剝離後用溶劑從角質層提取脂質，其中包括膽固醇。所得到的脂質提取物通過高效薄層色譜分離。該方法是很費力的。需要三種連續的溶劑系統來完成脂質的分離，需要用染色和焦化方法使組分顯色，還需要通過密度測定來確定脂質的相對含量。該方法不是一種適於大樣本的膽固醇含量的簡單快速測定方法。提供用於測定皮膚上膽固醇的簡單高通量分析的裝置是一種用於皮膚採樣的粘膠帶裝置，它和其使用的新方法公開於申請人共同待批的美國專利申請(公開號US-2005-0272112-Al)，其內容在此完整引入以供參考。該申請公開的方法可用於從許多個體獲得許多皮膚樣品，從而能確定各個體的皮膚膽固醇水平並確定其動脈粥樣硬化和相關心血管疾病的風險。該專利申請的膠帶剝離裝置和方法提供了一種簡單和成本合算的風險評估分析法，它能用於大規模篩選。用粘膠帶通過膠帶剝離獲得的皮膚樣品中總膽固醇量與膠帶樣本的大小有關。因此，為了比較個體之間的皮膚膽固醇水平，必須分析和比較相同大小的樣本。這是通過使用一種膠帶剝離裝置實現的，該裝置能夠實現在皮膚上貼上粘膠帶以獲得樣品時，獲得具有固定面積的膠帶片。一些獲得的膠帶可用於皮膚膽固醇分析。例如，通過將粘膠帶重複貼在皮膚上，使其沾滿皮膚，得到來自不同個體的具有穩定大小的皮膚樣本。然後從裝置上切下具有固定大小的小"檢測片(dipstick)"或"圓片(disk)"，得到用於分析的具有穩定面積的皮膚樣本。然而，在個體之間使用沾滿皮膚的固定面積的膠帶比較皮膚膽固醇水平並不一定能確保比較的皮膚量是相似的。當從不同個體取樣時，在各膠帶上留下的皮膚總量可能是不同的。通過將皮膚膽固醇量與標準化的皮膚量聯繫起來，可更好地比較來自不同個體的皮膚膽固醇水平。例如，用膠帶剝離裝置分析測定皮膚膽固醇的一個用途是為了申請人壽保險的個人。測試保險申請人的風險係數(例如年齡、抽菸狀態、血壓等)是常規做法，能根據測試結果確定保險費用。由於皮膚膽固醇是患有或發生動脈粥樣硬化或相似疾病的風險係數，其值可影響保險費，樣本可以經過處理，以支持結果。因此，需要確保獲得足夠分析皮膚膽固醇的皮膚樣本，從而分辨出故意少取樣，以產生較低皮膚膽固醇水平的"欺騙者"。因此，對於該用途，需要測量得到的用於皮膚膽固醇分析的皮膚量，以確保獲得了足夠的樣本，並能比較個體之間的皮膚膽固醇水平，以評估風險狀態。
發明內容本發明提供了一種測定通過膠帶剝離獲得的皮膚量的方法。在本發明的一個方面，本發明提供了一種直接測定通過膠帶剝離獲得的皮膚中蛋白質的方法，以將獲得的蛋白質測量值與相應的皮膚膽固醇測量值進行組合，來鑑定有動脈粥樣硬化危險的個體以及有發生動脈粥樣硬化和與高膽固醇水平有關或由於其引起的類似疾病之危險的個體。另外，本發明還能夠比較性測量膠帶剝離獲得的皮膚量，該量不僅僅依賴於獲得樣品的面積。此外，在本發明的一個方面，本發明的方法能根據獲得的皮膚的相對量比較皮膚膽固醇的相對水平。還理想的是，測定通過膠帶剝離獲得的皮膚樣本量的方法應當是簡單而成本節約的，適合高通量處理，但和其它方法相容，根據本發明的一個方面，這些方法例如但不限於通過膠帶剝離獲得的皮膚樣本中皮膚膽固醇的分析。特別是，本發明包括測定膠帶剝離獲得的皮膚量的方法，包括a)提供包括背襯件的膠帶，其中該膠帶至少有一面塗有醫用膠粘劑；b)將膠帶放置到皮膚的指定區域，使膠帶粘貼到該指定皮膚區域；C)從皮膚的指定區域剝離下膠帶，得到代表皮膚外角質層的樣品，該樣本粘附到膠帶上，從而帶有暴露的皮膚組分；d)將蛋白染料加到樣本的預選表面區域上，使蛋白染料與其保持接觸一段時間，足以導致所述染料與存在於暴露的皮膚組分中的蛋白質結合；和e)測定暴露的皮膚組分中染色的蛋白質，以確定指示獲得的皮膚量的蛋白質量的測量值。蛋白染料可選自陰離子和酸性染料。本發明的一個實施例中，蛋白染料是PonceauS染色劑。本發明的另一個實施例中，蛋白染料是考馬斯藍。另外，可測定暴露的皮膚組分中染色蛋白質的強度，以測定蛋白質量的測量值。在一個實施例中，可用分光光度法測定染色的蛋白質，以測定蛋白質量的測量值。在另一個實施例中，將蛋白質量的測量值與預定的閾值水平比較。如果測得的蛋白質量低於預定的閾值，可棄去樣本。另外，在本發明的另一個方面，背襯件可由聚酯製成。在本發明的另一個方面，醫用膠粘劑可以是例如，但不限於，壓敏膠粘劑；丙烯酸基膠粘劑；合成橡膠彈性體膠粘劑；聚矽氧烷(silicone)基膠粘劑；或包含由苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的彈性體。此外，本發明還包括了用於實施上述方法的試劑盒。該試劑盒包含-膠帶；禾卩-蛋白質染料的來源。蛋白染料可選自陰離子和酸性染料。本發明的一個實施例中，蛋白染料是PonceauS染色劑。本發明的另一個實施例中，蛋白染料是考馬斯藍。另外，在本發明的另一個方面，背襯件可由聚酯製成。在本發明的另一個方面，醫用膠粘劑可以是例如，但不限於，壓敏膠粘劑；丙烯酸基膠粘劑；合成橡膠彈性體膠粘劑；聚矽氧垸基膠粘劑；或包含由苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的彈性體。另外，在本發明的另一個方面，膠粘劑由一個可閉合的裝置攜帶，所述可閉合的裝置包括一個攜帶膠粘劑的採樣件和一個能與釆樣件嚙合並使膠粘劑保持在裝置內的閉合件。當閉合件與採樣件嚙合時，膠粘劑被密封在裝置內。至少閉合件或採樣件可帶有邊框(peripheralrim)，閉合件或採樣件中的另一個可帶有容納邊框的邊槽(peripheralgroove),從而可將膠粘劑密封在裝置內。此外，閉合件可通過絞鏈16連接採樣件。另外，至少一部分採樣件能從可閉合裝置上切下，以形成檢測片(dipstick)，檢測片的第一端上沒有膠粘劑，而第二端上有膠粘劑。在本發明的另一個方面，至少一部分採樣件能從可閉合裝置上切下，以形成圓片，圓片的一面上有膠粘劑。通過使用從可閉合裝置切下的在一端具有膠粘劑的檢測片或圓片，可確定預定或固定的膠粘劑面積。因此，在從皮膚採樣後，檢測片或圓片具有與確定或預定面積的膠粘劑結合的皮膚樣本。另外，在本發明的另一個方面，可閉合採樣裝置的採樣件可具有，例如但不限於，預先切割或預先刻痕的檢測片或圓盤，以預先確定膠粘劑的固定面積。此外，本發明的一個方面提供了一種比較來自許多個體的皮膚膽固醇相對水平的方法，包括a)用膠帶剝離獲得代表皮膚外角質層的樣品，分析粘附在膠粘劑上的暴露的皮膚組分，以獲得個體的皮膚膽固醇水平，從而測定來自各個個體的皮膚膽固醇；b)將蛋白染料加到樣本的暴露皮膚組分的預定表面區域上，該區域與測定皮膚膽固醇的區域分開，使蛋白染料與其保持接觸一段時間，足以導致所述染料與存在於暴露的皮膚組分中的蛋白質結合；c)測定暴露的皮膚組分中染色的蛋白質，以確定指示獲得的皮膚量的蛋白質量的測量值；和d)用蛋白質量的測量值對皮膚膽固醇測量值進行標準化。標準化可包括皮膚膽固醇測量值除以蛋白質測量值。蛋白染料可選自陰離子和酸性染料。本發明的一個實施例中，蛋白染料是PonceauS染色劑。本發明的另一個實施例中，蛋白染料是考馬斯藍。另外，可測定暴露的皮膚組分中染色蛋白質的強度，以測定蛋白質量的測量值。在一個實施例中，可用分光光度法測定染色的蛋白質，以測定蛋白質量的測量值。在另一個實施例中，將蛋白質量的測量值與預定的閾值水平比較。如果蛋白質量低於預定的閾值，可棄去樣本。另外，在本發明的另一個方面，背襯件可由聚酯製成。在本發明的另一個方面，醫用膠粘劑可以是例如，但不限於，壓敏膠粘劑；丙烯酸基膠粘劑；合成橡膠彈性體膠粘劑；聚矽氧垸基膠粘劑；或包含由苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的彈性體。申請人:教授的這些和其它特徵如本文所述。本領域技術人員應理解下文所述的附圖僅是為了說明。附圖並不以任何方式限制申請人教授內容的範圍。圖l是具有選定反射率值的特定樣本的概率圖，來自xl、x3和xl0次剝離的樣本；圖2是具有570nm光密度(OD)值的特定樣本的概率圖，來自xl、x3和x10次剝離的樣本；圖3是實施例所使用的釆樣裝置的俯視圖；圖4是圖3所述採樣裝置的局部圖，顯示的是其採樣件的細節；圖5是從本發明的釆樣裝置上切下的檢測片的透視圖；圖6是可用於實施例的另一種採樣裝置的透視圖；；和圖7是從圖6所述的另一種實施方式的本發明採樣裝置上切下的圓盤的透視具體實施方式提供用於測定皮膚上膽固醇的簡單高通量分析的裝置是一種用於皮膚採樣的粘膠帶裝置，如申請人的共同待批的美國專利申請(公開號US-2005-0272112-A1)所公開，其內容在此完整引入以供參考。在本發明的一個方面，該申請公開的方法可用於從許多個體獲得許多皮膚樣品，從而能確定各個體的皮膚膽固醇水平並確定其動脈粥樣硬化和相關心血管疾病的風險。該專利申請公開的膠帶剝離裝置和方法提供了一種簡單和成本合算的風險評估分析法，它能用於大規模篩選。例如，使用含有由聚酯形成的背襯件的膠帶。膠帶的至少一個面上塗有醫用膠粘劑。本文所用的術語"醫用膠粘劑"是指用於皮膚時過敏性較低且安全的膠粘齊廿。這種膠粘劑優選壓敏膠粘劑，例如，包含由苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的彈性體的膠粘劑。正如大家所清楚的，現在有多種類和類型的膠粘劑。總之，適用於本發明的膠粘劑是上面所定義的、在用於皮膚採樣時一般不會發生過敏反應的醫用膠粘劑。發明人試驗了幾種類型的膠粘劑來採集皮膚樣品；其中的大多數是丙烯酸基壓敏膠粘劑，但是也試驗了幾種合成橡膠類型的彈性體膠粘劑和聚矽氧烷基膠粘劑。發明人還發現，由苯乙烯和丁二烯或苯乙烯和異戊二烯的嵌段聚合物製成的合成橡膠膠粘劑可用於很好地實現本發明。合成橡膠膠粘劑的一個例子是基於苯乙烯和丁二烯嵌段聚合物的合成KratonTM型膠粘劑(不含膠乳)。這種膠粘劑具有良好的皮膚樣品穩定性，有利於樣品的運輸以便於隨後的分析。可用於本發明方法中的另一類優選粘膠帶是雙塗層的壓敏醫用級膠帶。這種醫用級膠帶的例子有3M(產品編號為弁9877)和AdhesiveResearch,Inc.(產品編號為弁8570)所出售的膠帶。發明人所試驗的其他類型的一些膠帶顯示在附表中。一個不變的要求是使用過敏性較低的醫用級膠帶。表Itableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13應當理解的是，表l所列的粘膠帶並不是窮盡性的，僅僅描述了現有的適用於本發明的幾種不同粘膠帶，以及本發明所屬領域技術人員所熟知的其他粘膠帶。雙塗層的壓敏膠帶通常都帶有易於去掉的保護襯裡。襯裡可保護膠帶在襯裡被去掉前不會粘貼，並且可防止膠粘劑受到汙染。襯裡可放置在雙塗層膠帶的每一面，或者膠帶只有一個襯裡，並且膠帶纏繞在其自身上，這樣就可以保護兩個表面。可以使用具有不同撕離特性的襯裡，這樣在第一面膠粘劑暴露時第二面膠粘劑還可以得到保護。具有不同襯裡的雙塗層膠帶特別適用於皮膚採樣。去掉第一襯裡後將膠帶粘貼到採樣裝置的背襯上，同時膠帶的皮膚採樣面還被第二襯裡覆蓋。這個第二襯裡可保護皮膚採樣的膠粘劑區域在其被使用前不會粘貼和被汙染。當需要進行皮膚採樣時將第二襯裡去掉。膠帶可以用到任何部位的皮膚上，但是最合適的部位是手掌的表明，因為手掌沒有皮脂腺，後者的分泌物含有膽固醇，可影響本發明某些方面，尤其是涉及測定膽固醇的那些方面的檢測結果。另外，手掌的皮膚易於採樣。能夠獲得均一量的皮膚樣品用於分析是我們所期望的。使用粘膠帶採樣通常並且常規地只在皮膚上粘貼一次膠帶。在皮膚上多次粘貼膠帶可以得到更多的角質層材料。在皮膚上多粘貼一次膠帶就能使膠帶多粘附一些皮膚樣品。繼續這個過程直到膠帶上沾滿皮膚樣品，然後膠帶就變成沒有粘性的了。使膠帶沾滿皮膚樣品所需要的粘貼次數因所使用的膠粘劑類型不同而不同，但是對於最常用的粘膠帶來說，膠帶沾滿皮膚樣品所需的粘貼次數都少於10次，其中包括而不限於3到7次。在每次將膠帶從皮膚上剝離下來並重新粘貼時最好將膠帶粘貼到新的皮膚區域，這樣可以使膠帶更好更快地沾滿皮膚樣品。因此，為了達到均一而良好的採樣目的，最好用膠帶粘貼皮膚10次，每次都粘貼到新的區域。對於本發明的要測定皮膚膽固醇的方面，膠粘劑上的皮膚樣品內所存在的膽固醇的總量與所得到的皮膚樣品的大小有關。另外，需要得到大小一致的皮膚樣品，從而可以比較不同個體之間皮膚膽固醇的相對水平。因此，可從裝置上切下檢測片，以呈現膠粘劑的固定區域(例如但不限於長方形或圓形區域)，該區域上結合有通過膠帶剝離獲得的暴露的皮膚組分。這些檢測片能夠基於要分析的固定單位面積的皮膚來實現不同個體之間皮膚膽固醇水平的比較。作為從具有大面積膠帶或膠粘劑的裝置切割檢測片的替代手段，檢測片可以是，例如但不限於，預先切割或預先刻痕的，從而能與裝置方便的分離。如上所述，這種預先切割或預先刻痕的檢測片可在其一端確定固定或預定面積的膠帶或膠粘劑。採樣後，可從裝置上方便的取下這種預先切割或預先刻痕的檢測片，它含有具有固定或預定面積的用於分析的皮膚樣本區域D通過下列步驟可以從不同個體上(或者從同一個體上重複採樣)得到大小一致的皮膚樣品。首先，如上所述，通過將膠粘劑重複粘貼到皮膚上獲得皮膚樣品，這樣膠粘劑就會沾滿皮膚樣品並且變得沒有粘性。膠粘劑在皮膚上粘貼約3到7次後就會沾滿皮膚樣品，一般來說要重複粘貼IO次以確保膠粘劑沾滿皮膚樣品。其次，為了獲得用於檢測的恆定面積的皮膚樣品，從皮膚採樣裝置上取下一個固定大小的面積(如下文實施例描述的)，將其浸到標準體積的檢測試劑和指示劑中，如下文所描述的。皮膚外角質層(stratumcomeum)主要由被含有膽固醇的脂質混合物包圍的富含蛋白質的角化細胞(comeocyte)組成。從結構上說，它常常被描述為"磚和灰漿"模型，其中角化細胞代表磚，周圍的脂質代表灰漿(P.M.Elias，JInvestDermatol.1983，80，44S-9S)。角質層中蛋白質量在不同個體之間是相對穩定的；因此，膠帶剝離獲得的皮膚樣本中的蛋白質可提供對獲得的皮膚量的間接測量。在本發明的一個方面，通過測定蛋白質和因而獲得的皮膚樣本量，可確定獲得了足夠的皮膚樣本以用於皮膚膽固醇分析。另外，測出的皮膚膽固醇水平可與蛋白質值比較，以獲得每單位蛋白水平的膽固醇值，和由此獲得每單位皮膚量的膽固醇。測定膠帶剝離獲得的皮膚樣本中蛋白質的分析方法可使用，例如但不限於，考馬斯藍作為通用蛋白染料(例如，作為BioRadTM購得的蛋白染料)。已顯示，考馬斯藍可用於定量估計固定在載體材料上的蛋白質(S.FazekasdeSt.Groth等，BiochemicaEtBiophysicaActa,1863,71,377-391)。考馬斯藍染料加到膠粘劑上的皮膚區域，在適當染色一段時間後，洗去過量染料。然後通過測量膠粘劑上染上藍色的樣本的色度測定被染色的皮膚蛋白的強度，該強度與蛋白質的量成正比。測定被染色的皮膚樣本的相對強度(例如色度)使得通過膠帶剝離從個體獲得的皮膚樣本的相對量可進行比較。採用下列測量法來確定膠帶剝離次數如何與獲得的皮膚量關聯，該皮膚量用Bio-Rad蛋白質染色測定。根據本發明的一個方面，這些測量法是用於確定獲得的皮膚量不足是否會影響皮膚膽固醇測試。因此，進行分析，測定不同次數的膠帶剝離獲得的蛋白。具體說，志願者的手掌經過膠帶剝離一次(l)、三次(3)和十次(10)，通過在用Bio-Rad蛋白質染色試劑染色後，讀取色度和610nm處的反射率獲得蛋白質水平。這些蛋白質水平為獲得皮膚的程度和膠帶剝離的效率提供了一種量度。在該試驗中，Bio-Rad蛋白測定是在從四十五(45)個志願者中收集的樣本上進行的。每個志願者提供用一(l)、三(3)和十(10)次剝離獲得的皮膚樣本。在三個不同樣本組(標為xl、x3和xl0)中，發現色度和610nm處的反射率之間良好相關。在線性最小平方回歸分析中，xl、x3和x10樣本的R2值分別為0.961、0.978和0.959。xl剝離樣本(11=45)的平均色度值為11.07，sdl.83,CV16.3%;x3剝離樣本(11=44)的平均色度值為15.46，sd2.32，CV17.3%;x10剝離樣本(n-44)的平均色度值為23.50，sd1.06，CV4.6%。xl剝離樣本(n-45)的平均反射率為55.69，sd2.95，CV5.6%;x3剝離樣本(n-44)的平均反射率為48.07，sd3.08，CV6.4%;xl0剝離樣本(r^44)的平均反射率為36.19，sd1.48，CV4.1%。每組之間有顯著的差異。對每組中具有某反射率(610nm)值的特定樣本機率進行分析，結果示於圖1。該分析表明，93.2%的x10剝離樣本具有<45的反射率值，36.4%的x3剝離樣本具有<45的反射率值，而僅4.4%的xl剝離樣本具有<45的反射率值。此外，77.3%的x10剝離樣本具有<40的反射率值，11.4%的x3剝離樣本具有<40的反射率值，而僅2.2%的xl剝離樣本具有<40的反射率值。發現使用<45的截止值(cut-offvalue)作為充分剝離的可接受條件(acceptancecriterion)會排斥6.8%的10次剝離獲得的樣本。使用0.1的OD570nm值，60%的x3剝離樣本具有>0.1的OD570nm值，而僅18%的xl剝離樣本具有>0.1的OD570nm值。因此，選擇>0.1的OD的截止值作為充分剝離的可接受條件會排斥2%的10次剝離獲得的樣本，40%的3次剝離獲得的樣本和82%的僅1次剝離獲得的樣本。還可用蛋白水平來標準化(normalize)皮膚膽固醇水平，該水平會隨著不同皮膚樣本而改變。例如，提供小皮膚樣本，但具有高皮膚膽固醇水平的個人可能會給出與具有低皮膚膽固醇水平但提供大皮膚樣本的個人的值相似。通過標準化到恆定蛋白質水平，可以將這兩個個體區分為具有高和低膽固醇水平。標準化可涉及將膽固醇水平除以蛋白質水平的樣本操作；這有效的給出了每單位蛋白質的膽固醇水平。實施例下列實施例會有助於進一步了解申請人公開內容的各方面，這不應被視為以任何方式限制本公開內容的範圍。採用圖3所示的採樣裝置。採樣裝置一般用參考數字10表示，它是由塑料(聚丙烯)製成的，包括通過整合絞鏈16連接到閉合件14的採樣件12。閉合件14帶有邊框18和四個釘20，分別鎖定到採樣件12的邊槽22和四個孔24內。摺疊絞鏈16使邊框18和邊槽22嚙合、釘20與孔24嚙合，從而保證裝置10的兩個部分閉合密封，防止灰塵和內表面被汙染。閉合件14的外表面(圖3和4中未顯示)有平坦區用於粘貼標記和條形碼，以便於樣品識別。採樣件12和閉合件14分別帶有用於打開裝置10的手柄(fmgertab)26和28。雙塗層壓敏醫用膠帶30帶有牛皮紙製成的保護性剝離襯裡32，是3M的產品，產品編號為#9877，膠帶30被粘貼到採樣件12的中央區域。剝離襯裡32比粘膠帶30寬，這樣在襯裡32的一邊就形成一個不與膠帶粘貼的條帶32，，襯裡的這個條帶32'懸垂在裝置的邊上形成易於將襯裡剝離的手柄(tab)。在使用前，捏住懸垂的手柄32'將襯裡32撕下，暴露出膠帶30上的膠粘劑，進行皮膚採樣。清洗供採樣的手掌皮膚區域並使其乾燥。將有暴露的膠粘劑的膠帶30粘貼到手掌上。在採樣件12的背面粘貼區域施加壓力將膠帶30按壓到皮膚上，使其與角質層粘貼在一起。然後將裝置10撕下，再粘貼到手掌的另一個區域，再次按壓到皮膚上。以這種方式重複撕下裝置然後粘貼到皮膚上，總共進行10次。在完成皮膚粘貼過程以後從裝置10上切下約5mm寬的小檢測片40(見圖5)。如圖4所示，沿邊槽22將採樣件12鄰近手柄26的一端切下。沿採樣件12上模壓的指導線36(如圖4所示)切割三次得到5mm的檢測片，切割從邊上開始直到剛剛越過中心線。沿著件12上模壓的指導線38跨過件12的中央進行第三次切割就可以從採樣件12上切下5mm寬的檢測片。檢測片40包括無膠帶的第一端42和帶有膠帶的第二端44，後者有皮膚樣品粘附其上。與從具有大面積膠帶或膠粘劑的裝置10上切下檢測片40的模式不同，檢測片40可具有預先切割或預先刻痕的指導線36和38，從而能使檢測片40與裝置10方便的分離。不論是切割、預先切開、或預先刻痕的檢測片都可在第二端部分44確定固定或預定面積的膠帶或膠粘劑。從而在採樣後，從裝置10上取下檢測片40，它含有固定或確定面積的要分析的皮膚樣本區域。與檢測片40不同，圖6顯示了能用於取下圓片50(如圖7所示)的切割工具60。圓片50在其一個面52上帶有粘附到採樣裝置10的粘膠帶30上的皮膚樣品。如圖所示，當裝置10處於如圖所示的摺疊狀態(閉合)時，可用切割工具60從裝置10上切下圓片。將閉合的裝置放置到堅硬的表面上(圖中未顯示)，裝置10的採樣件12的外表面62朝上。將切割工具60插到圓形凹陷64上，64位於裝置10的採樣件12的外表面62上，然後壓下切割工具60，切過塑料層和膠帶30/皮膚樣品。但是不要將切割工具60壓得太厲害，以免切過裝置10閉合件14的塑料層。與從裝置IO切下圓片50不同，可預先切割或預先對圓片50進行刻痕(例如但不限於在圓形凹陷邊界上)，使得圓片50能夠和裝置10輕易分開。然而和檢測片一樣，不論圓片是切割、預切割、或預先刻痕，它都確定具有固定或確定面積的膠帶或膠粘劑的面52。因此，在採樣後，可從裝置10取下圓片50，它含有固定或確定的皮膚樣本區域用於分析。用圖5的檢測片40繼續實施例，將要分析的檢測片放置到96孔微孔板的孔中(未顯示)，每孔約含150uLPonceauS染色試劑的溶液(例如，SigmaAldrichCanadaLtd.提供的產品P7170)。在室溫下使檢測片在溶液中浸泡約15分鐘，然後將其取出放置到微孔板的新孔中，每孔約含200yL水洗滌溶液。振蕩微孔板以提高洗滌效果，約1分鐘後將檢測片取出放置到微孔板的新孔中，每孔約含200uL新鮮的水洗滌溶液，再振蕩約l分鐘。振蕩洗滌第3次，第3次洗滌後，通過溫和的用吸水紙(至於清潔平面上)吸水除去檢測片底部殘留的任何洗液液滴。然後將檢測片置於含有約O.IN氫氧化鈉溶液的孔中，從檢測片上洗脫結合的染色試劑。在微孔中振蕩檢測片約5分鐘，取出檢測片，通過測定溶液在550-570nm處的吸光度測定洗脫的染料量。為了使許多樣品可以被一起處理，需要將檢測片40切成與標準96孔(8X12)微孔板的孔相匹配的統一形狀。現有的設備可用於將試劑加入到微孔板的孔中，並且可以洗滌這些孔，有一個要求是要避免各分析步驟之間有試劑殘留。利用現有的分光光度計在試驗的最後一步可以直接閱讀孔內的有色溶液。這是通過使用定製的固定物實現的，這些固定物將多達96個檢測片保持在正確朝向和位置，從而使其適合標準96孔微量滴定板。固定物使得多達96個一組的檢測片能夠在分析的每一步中作為一組一起被取出置於新的孔中。然後用如上所述對於單個檢測片分析相同的試劑和方法處理一組檢測片。除了上面的蛋白質測定，在本發明的一個方面，可從裝置上切下另外的檢測片，用於檢測皮膚膽固醇量。為了測定皮膚膽固醇量，將每個檢測片放置到96孔微孔板的孔中(未顯示)，每孔約含IOOiiLA-C-B試劑的溶液。該試劑是毛地黃皂苷(A)通過馬來酸酐-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物(C)連接到辣根過氧化物酶(B)上的綴合物(conjugate)，濃度約為1ug/mL。在室溫下使檢測片在溶液中浸泡約15分鐘，然後將其取出放置到微孔板的新孔中，每孔約含200UL洗滌溶液。振蕩微孔板以有效洗滌，約l分鐘後將檢測片取出放置到微孔板的新孔中，每孔約含200uL新鮮的水洗滌溶液，再振蕩約1分鐘。振蕩洗滌第3次，然後將檢測片取出放置到約100yL底物溶液(EnhancedK-Blue試劑)中。室溫下在暗處使檢測片與底物溶液溫育約15分鐘。在此期間不斷搖動微孔板。檢測片溫育好以後取出。在含有底物溶液的孔中加入約100uL1N的硫酸以終止反應，在微孔板讀數分光光度計上讀取所得溶液在約450nm處的光密度值，該值代表了皮膚樣品中的膽固醇含量。通過測定來自上述採樣裝置的蛋白質水平和皮膚膽固醇量，能夠使得膽固醇測定能交叉參照不同蛋白質水平，以測定例如是否獲得了足夠的皮膚樣本，以提供可用的皮膚膽固醇測量值。另外，可用蛋白質水平標準化皮膚膽固醇水平，例如通過將個人的膽固醇水平除以蛋白質水平。雖然結合各實施方式描述了申請人的
發明內容，並不意味著申請人的
發明內容局限於這些實施方式。相反，本領域技術人員都能夠理解，申請人的
發明內容包括了各種替代形式、改變和等價方式。權利要求1.一種測定膠帶剝離獲得的皮膚量的方法，其特徵在於，該方法包括a)提供包括背襯件的膠帶，其中該膠帶至少有一面塗有醫用膠粘劑；b)將膠帶放置到皮膚的指定區域，使膠帶粘貼到該指定皮膚區域；c)從皮膚的指定區域剝離下膠帶，得到代表皮膚外角質層的樣本，該樣本粘附到膠帶上，從而帶有暴露的皮膚組分；d)將蛋白染料加到樣本的預選表面區域上，使蛋白染料與其保持接觸一段時間，足以導致所述染料與存在於暴露的皮膚組分中的蛋白質結合；和e)測定暴露的皮膚組分中染色的蛋白質，以確定指示獲得的皮膚量的蛋白質量的測量值。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述蛋白染料選自陰離子染料和酸性染料。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述蛋白染料是PonceauS染色劑。4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述蛋白染料是考馬斯藍。5.如權利要求l-4任一所述的方法，其特徵在於，測定暴露的皮膚組分中染色蛋白質的強度，以測定蛋白質量的測量值。6.如權利要求l-4任一所述的方法，其特徵在於，用分光光度法測定染色的蛋白質，以測定蛋白質量的測量值。7.如權利要求l-6任一所述的方法，其特徵在於，將蛋白質量的測量值與預定的閾值水平進行比較。8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，如果蛋白質量低於預定的閾值，棄去樣本。9.如權利要求l-8任一所述的方法，其特徵在於，所述背襯件由聚酯製成。10.如權利要求1-9任一所述的方法，其特徵在於，所述醫用膠粘劑是壓敏膠粘劑。11.如權利要求l-9任一所述的方法，其特徵在於，所述醫用膠粘劑是丙烯酸基膠粘劑。12.如權利要求l-9任一所述的方法，其特徵在於，所述醫用膠粘劑是合成橡膠彈性體膠粘劑。13.如權利要求1-9任一所述的方法，其特徵在於，所述醫用膠粘劑是聚矽氧烷基膠粘劑。14.如權利要求l-9任一所述的方法，其特徵在於，所述醫用膠粘劑包含由苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的彈性體。15.—種比較來自多個個體的皮膚膽固醇相對水平的方法，該方法包括a)用膠帶剝離獲得代表皮膚外角質層的樣本，分析粘附在膠粘劑上的暴露的皮膚組分，以獲得個體的皮膚膽固醇水平，從而測定來自各個個體的皮膚膽固醇；b)將蛋白染料加到樣本的暴露皮膚組分的預定表面區域上，該區域與測定皮膚膽固醇的區域分開，使蛋白染料與其保持接觸一段時間，足以導致所述染料與存在於暴露的皮膚組分中的蛋白質結合；c)測定暴露的皮膚組分中染色的蛋白質，以確定指示獲得的皮膚量的蛋白質量的測量值；和d)用蛋白質量的測量值對皮膚膽固醇測量值進行標準化。16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述標準化包括皮膚膽固醇測量值除以蛋白質測量值。17.如權利要求15或16所述的方法，其特徵在於，所述蛋白染料選自陰離子染料和酸性染料。18.如權利要求15或16所述的方法，其特徵在於，所述蛋白染料是PonceauS染色劑。19.如權利要求15或16所述的方法，其特徵在於，所述蛋白染料是考馬斯藍。20.如權利要求15-19任一所述的方法，其特徵在於，.測定暴露的皮膚組分中染色蛋白質的強度，以測定蛋白質量的測量值。21.如權利要求15-19任一所述的方法，其特徵在於，用分光光度法測定染色的蛋白質，以測定蛋白質量的測量值。22.如權利要求15-21任一所述的方法，其特徵在於，將蛋白質量的測量值與預定的閾值水平比較。23.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，如果蛋白質量低於預定的閾值，棄去樣本。24.如權利要求15-23任一所述的方法，其特徵在於，所述背襯件由聚酯製成。25.如權利要求15-24任一所述的方法，其特徵在於，所述醫用膠粘劑是壓敏膠粘劑。26.如權利要求15-24任一所述的方法，其特徵在於，所述醫用膠粘劑是丙烯酸基膠粘劑。27.如權利要求15-24任一所述的方法，其特徵在於，所述醫用膠粘劑是合成橡膠彈性體膠粘劑。28.如權利要求15-24任一所述的方法，其特徵在於，所述醫用膠粘劑是聚矽氧烷基膠粘劑。29.如權利要求15-24任一所述的方法，其特徵在於，所述醫用膠粘劑包含由苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的彈性體。30.用於實施權利要求1所述的方法的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒包含-所述膠帶；和-所述蛋白質染料的來源。31.如權利要求30所述的試劑盒，其特徵在於，所述蛋白染料選自陰離子染料和酸性染料。32.如權利要求30所述的試劑盒，其特徵在於，所述蛋白染料是PonceauS染色劑。33.如權利要求30所述的試劑盒，其特徵在於，所述蛋白染料是考馬斯藍。34.如權利要求30-33任一所述的試劑盒，其特徵在於成。35.如權利要求30-34任一所述的試劑盒，其特徵在于敏膠粘劑。36.如權利要求30-34任一所述的試劑盒，其特徵在於烯酸基膠粘劑。37.如權利要求30-34任一所述的試劑盒，其特徵在於成橡膠彈性體膠粘劑。38.如權利要求30-34任一所述的試劑盒，其特徵在於矽氧烷基膠粘劑。39.如權利要求30-34任一所述的方法，其特徵在於，所述醫用膠粘劑包含由苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的彈性體。40.如權利要求30-39任一所述的試劑盒，其特徵在於，所述膠粘劑由一個可閉合的裝置攜帶，所述可閉合的裝置包括一個攜帶膠粘劑的採樣件和一個能與所述採樣件嚙合並使膠粘劑保持在所述裝置內的閉合件。41.如權利要求40所述的試劑盒，其特徵在於，當所述閉合件與所述採樣件齧，所述背襯件由聚酯制，所述醫用膠粘劑是壓，所述醫用膠粘劑是丙，所述醫用膠粘劑是合，所述醫用膠粘劑是聚合時，所述膠粘劑被密封在所述裝置內。42.如權利要求41所述的試劑盒，其特徵在於，至少所述閉合件或所述採樣件帶有邊框，所述閉合件或所述採樣件的另一個帶有容納所述邊框的邊槽，從而將所述膠粘劑密封在所述裝置內。43.如權利要求40-42任一所述的試劑盒，其特徵在於，所述閉合件可通過絞鏈連接到所述採樣件。44.如權利要求40-43任一所述的試劑盒，其特徵在於，至少一部分採樣件能從可閉合裝置上切下形成檢測片，所述檢測片的第一端上沒有膠粘劑，而第二端上有膠粘劑。45.如權利要求40-43任一所述的試劑盒，其特徵在於，所述可閉合裝置確定至少一個預先切割或預先刻痕的檢測片，所述至少一個檢測片的第一端上沒有膠粘劑，而第二端上有膠粘劑。46.如權利要求44或45所述的試劑盒，其特徵在於，所述檢測片的有膠粘劑的第二端確定固定或預定面積的膠粘劑。47.如權利要求40-43任一所述的試劑盒，其特徵在於，至少一部分釆樣件能從可閉合裝置上切下形成圓片，所述圓片在其一個面上有膠粘劑。48.如權利要求40-43任一所述的試劑盒，其特徵在於，所述可閉合裝置確定至少一個預先切割或預先刻痕的圓片，所述至少一個圓片在其一個面上有膠粘劑D49.如權利要求47或48所述的試劑盒，其特徵在於，所述圓片具有膠粘劑的面確定固定或預定面積的膠粘劑。專利摘要本發明提供了一種測定通過膠帶剝離獲得的皮膚量的方法。在本發明的一個方面，本發明提供了一種直接測定通過膠帶剝離獲得的皮膚中蛋白質的方法，以將獲得的蛋白質測量值與相應的皮膚膽固醇測量值進行組合，來鑑定有動脈粥樣硬化危險的個體以及有發生動脈粥樣硬化和與高膽固醇水平有關或由於其引起的類似疾病之危險的個體。另外，本發明還能夠比較性測量膠帶剝離獲得的皮膚量，該量不僅僅依賴於獲得樣品的面積。此外，在本發明的一個方面，本發明的方法能根據獲得的皮膚的相對量比較皮膚膽固醇的相對水平。文檔編號C12Q1/60GKCN101194022SQ200680017583公開日2008年6月4日申請日期2006年5月19日發明者P·豪斯伍德,R·扎瓦蒂斯基申請人:普雷姆德股份有限公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan