微量元素、無機營養鹽類擴散型菌體培養用載體的製作方法

2023-06-10 22:21:41

專利名稱：微量元素、無機營養鹽類擴散型菌體培養用載體的製作方法
本申請的發明是關於微量元素無機營養鹽類擴散型菌體培養用的載體。進而本發明是關於在廢水處理裝置、食品製造工業、醫藥品製造工業中用於培養微量元素無機營養鹽類擴散型菌體的載體。
過去作為製造載體的方法，已知有將菌和酵素包含在高分子聚合物凝膠內的方法(包含法)，並應用於工業中。
然而，老的方法中，主要依靠的是對細菌繁殖有用的微量金屬元素和無機營養鹽類由外部培養液擴散移動到載體內部，所以這些物質的擴散速度決定了細菌的繁殖速度。代謝的物質產生向載體表面的擴散阻抗，所以有阻礙細菌繁殖的情況發生。氣體物質在代謝時使載體向上浮起並造成破壞。進而在包含法等老方法中存在的問題是由於所用高分子的毒性，使細菌的活性顯著減退，因此，即使菌密度很高，它的活性也未必與菌密度成比例。
為了解決這些問題，開發研製了將菌和載體以物理化學附著的表面結合型載體。
然而，這種方法中存在的問題是，由於菌繁殖時依賴於分泌的粘著性高分子狀物質和載體的物理化學附著，所以菌的繁殖速度取決於從外部液體浸入液的無機營養鹽和微量元素成分的構成。進而存在於載體表面的細菌，在生物反應器內流動時，產生細菌冒出分離，自然高密度聚集培養受到了限制。
因此，該申請的發明目的是提供一種在生物反應器或廢水處理裝置內能實現高活性和高密度菌體的新的微量元件無機營養鹽類擴散型菌體培養用載體。
本申請的發明，作為解決上述課題提供的一種微量無機營養鹽類擴散型菌體培養用的載體(權利要求1)，其特徵是將菌繁殖用的微量元素和無機營養鹽包含在多孔體內。
本發明提供了如下菌體培養用載體，即，將生物分解性樹脂和葡萄糖等有機碳源包含在上述載體中的菌體培養用載體(權利要求2)、將菌類包含在上述載體中的菌體培養用載體(權利要求3)、在上述各載體中，利用高分子聚合物被覆表面的菌體培養用載體(權利要求4)、上述各載體中，在其表面菌體聚集繁殖，再次用高分子聚合物被覆的菌體培養用載體(權利要求5)、用生物分解性樹脂被覆的菌體培養用載體(權利要求6)、在被覆高分子聚合物中含有磁性粉體的菌體培養用載體(權利要求7)等。
同樣，本發明提供的是，以上述多孔體是高分子聚合物，或高分子聚合物凝膠的菌體培養用載體(權利要求8)為首、多孔體是陶瓷品、或天然石材料的菌體培養用載體(權利要求9)、將上述高分子聚合物包含在高分子聚合物凝膠內的菌體培養用載體(權利要求10)。
進而，本發明提供的是，作為由多孔體形成的載體，由石絨形成的菌體培養用載體(權利要求11)和將其作為固定床甲烷發酵槽用的載體(權利要求12)。
本申請的發明，作為如上述結合型載體，以高濃度將細菌繁殖所需要的微量元素和無機營養鹽等有用物質包含在結合型載體內。據此，可防止因使用的高分子聚合物等多孔體的毒性引起細菌活性降低，通過調整構成載體的高分子聚合物等的厚度和空隙可防止繁殖受阻。進而，在載體表面上實施防止繁殖菌的物理分離的表面被覆等，細菌的種類和特性以及使用的反應器要與流動法相適應，才能防止細菌冒出分離。
本發明來自於這樣的發現，基於把O2、H2作為基質的甲烷菌的謀求高濃度培養的研究上的見解，即，由於細菌繁殖所需要的微量元素無機營養鹽的缺乏，細菌繁殖速度受到限制，所以通過供給控制繁殖的物質，可以使細菌的密度高密度化。
利比茨希(リ-ビツヒ)的最低原則，即，任何一種菌，作為該菌所需要的物質，欠缺一種時，細菌繁殖都會停止，符合於這種見解。根據這種見解，作為在生物反應器和廢水處理裝置內，進行活動的各種菌繁殖，供給必要物質的方法，是將這些物質以高濃度包含在載體內部，通過擴散，由載體內部擴散移動到表面，向表面生存的細菌供應這些物質。試驗已確認，通過向其引入菌，使其連續繁殖，可維持細菌的高密度狀態。
在包含了微量元素和無機營養鹽類的本發明載體中，利用由高分子聚合物形成的凝膠作為多孔體使用，雖然在該凝膠中固定了微量元素和無機營養鹽類，但對於多孔體的構成，可使用多孔性高分子聚合物的各種物質、高分子聚合物的凝膠，或微粒聚合物的集合體等，進而還可以是多孔性陶瓷品和輕石等天然石材料。
關於高分子聚合物或其凝膠，例如，作為吸水性聚合物等，以代表例示出，已知有丙烯酸系、甲基丙烯酸系、乙烯醇系、乙烯酯系、聚醚系、聚酯系、聚烯烴系等各種聚合物或共聚聚合物等。
關於菌體及其物質，對於具有上述多孔體的本發明載體，例如，在其表面、內部細孔內間隙內，如通過共價鍵、物理吸附、或離子鍵，進行鍵固定，菌體可包含在載體中、可聚集在載體表面上，也可以兩種情況共存。
關於被覆表面的高分子聚合物，起到控制包含在多孔體內的微量元素、無機營養鹽類、進而生物分解性樹脂和葡萄糖等有機碳源等的擴散達到所要目的的作用。生物分解性樹脂，通過它的緩慢分解可向菌體供給有機碳源。
作為模式如圖示說明，首先，該發明的基本構成如

圖1所示(權利要求1)。在高分子聚合物的凝膠等多孔體內，包含載帶了微量金屬元素和無機營養鹽的菌體培養用載體(A)。圖2表示還包含有有機碳源、生物分解性樹指等的載體(A)(權利要求2)。圖3是包含了菌體的狀態，例如在生物分解性塑料和有機碳源中植入了菌體狀態的載體(A)示例(權利要求3)。
圖4是在上述任何一個載體中，在其表面有控制擴散用被覆(1層以上)，由高分子聚合物構成的該發明載體(B)示例(權利要求4)。
圖5是關於以上載體(A)、(B)，表面聚集菌體，再在其上設置被覆高分子聚合物時的載體(c)示例(權利要求5)。圖6是關於載體(A)、(B)、(C)中任何一個被覆了生物分解性樹脂的載體示例(權利要求6)。
同樣，圖7是有關圖5示例的放大模式示例。
在由高分子聚合物被覆的本發明載體中，聚合物中分散含有鐵氧體等磁性粉體，通過來自外部的磁場可控制載體的移動。圖8是另一模式示例。
附加圖9～11是將本發明載體用於反應器時的示例。另外，圖9和圖10中所示的「再反應物」的詞是指廢水處理中的分解物(degraded product)。
根據本發明載體的應用，例如可期待菌體濃度為20～40g-dry·cell/l。使用老方法為1～5g-dry·cell/l。
將廢水處理等分解系統內基質量定為S，其分解以下式表示(dSdt)=-X/Yx/s]]>其中，μ表示菌的比繁殖速度、X表示菌密度，Yx/s表示菌收率(根據菌取一定值)。
根據本發明，μ接近於μmax時，由於運轉可能，菌密度X比過去要高8～20倍，懸浮培養裝置的分解速度，指數函數比過去增加了50～200倍，和利用老載體的生物反應器比較可增加數倍。
在多孔體中，提高了菌密度，以高濃度提高微量元素和無機營養鹽類才能發揮作用，所以還要考慮這種多孔體存在於菌體繁殖培養液中的有效性。其中，陶瓷或天然石材作載體非常有效，特別是石絨在固定床甲烷發酵中極為有效。
實施例1附圖12是作為本發明的載體，將重量平均分子量約2000、皂化(クンイ)度98％的，以約16(重量)％溶解於水中，用飽和硼酸交聯得到的PVA(聚乙烯醇)聚合物凝膠中，載持作為微量元素和無機營養鹽的金屬鹽類，進行甲烷菌培養時的配方濃度的關係。下表1是微量金屬元素的各示例。表2是基礎無機鹽類的各示例，表3是維生素溶液組成的各示例。表1組份濃度(μg/l)MgCl·6H2O 410MnCl·4H2O 50FeCl2·4H2O 50NiCl2·6H2O 12ZnSO4·7H2O 10CoCl2·6H2O 10CaCl2·2H2O 10Na2SeO38Na2MoO4·2H2O 2.4CuSO4·5H2O 1AlK(SO4)21H3BO31.8NaWO4·2H2O 1表2組份 濃度(mg/l)KH2PO43400K2HPO43400NH4Cl 2130Na2CO32540Resazurin 2表3組份 濃度(μg/l)Biolin20Folic acid20Pyridoxine hydrochloride 100Thiamine hydrehloride 50Riboflavin50Nicotinic acid50Calcium DL-pantothenate 50p-Aminobenzoic acid 50Lipoicacid50根據老的配方濃度，可知濃度增大150倍時，甲烷生成速度約增大3.7倍。據此，可確認本發明的優良作用效果。
圖13是在NH4+(氨)濃度非常高的廢水處理中使用和上述相同的載體，在利用氫生產菌(Enterobactor aerogenes)產生氫試驗中，使用本發明載體的氫生產菌的固定化培養和沒有使用載體的氫生產菌的懸濁培養進行比較的結果。氫生產菌很容易受氨態氮氣阻礙繁殖的影響。為觀察這種現象調節PH容許範圍進行比較的結果。使用載體的氫生產菌的PH容許範圍和懸浮培養的範圍比較，非常寬。最適宜的PH同為5.2～5.3，但此時，前者的氫生產速度是後者的約2倍，可以確認這是本發明的效果。
實施例2在總容積31、液容積2.5l的玻璃制圓筒型發酵槽內，懸掛加工成圓柱型(120mm直徑×70mm高)的石絨(日東紡績制)，體積佔據0.8l(液容積的32％)。為了使固定床甲烷發酵槽的性能和完全混合甲烷發酵槽比較，並用在相同容量的發酵槽內，不設置石絨的完全混合甲烷發酵槽。
在固定床材料中使用水耕栽培用石絨。它的物理性狀示於表4。在預備試驗中，從合成廢水取出的石絨的水，直到不再從石絨浸出的計量結果，作為自由水，佔83％(V/V)的比率。
表4石絨的物理特性和構成
將含有表5所示的微量金屬鹽和維生素類無機鹼溶解於蒸餾水中，在滅菌器內進行滅菌(121℃、16分鐘)。根據發酵槽的醋酸負荷。向其中滴加醋酸。將此用作甲烷發酵的合成廢水。
表5基質的組成
在由其它用途的消化槽採取的消化汙泥中，以一天一次的排和充方式，半連續加入醋酸濃度5g/l的合成廢水，從將水理學的滯留時間(HRT)設定為30小時開始縮短到16小時，於35℃下在液容積2.5l的發酵槽內進行約6個月的汙泥培養。在得到培養甲烷菌穩定生成甲烷後，進行位相差和螢光顯微鏡(Olympus，BS50)的觀察。確認Methanosarcina和Methanothrix屬是優佔菌，將此作為種菌用於甲烷發酵槽的啟動運轉。
同樣，將上述固定床甲烷發酵槽和完全混合甲烷發酵槽設置成35℃水槽。以相同的初期接種量、槽酸負荷和水理學的平均滯留時間的操作，同時運轉2基的甲烷發酵槽。
1)啟動運轉首先，將發酵槽氣相部分的空氣置換成無O2的N2氣，用1N鹽酸將發酵槽中的PH調節為中性，將合成廢水、無槽酸基質轉化成2250ml，在厭氣下接種。之後，從第3天開始連續加入含槽酸的合成廢水。逐漸增加連續加入合成廢水的速度，用2周時間達到目的槽酸負荷和HRT。
2)連續操作試驗發酵槽中甲烷生成速度達到正常狀態後，在HRT2倍以上期間中，研究發酵槽運轉時甲烷發酵槽中的特徵顏色。實驗條件示於表6中。作為判斷在正常狀態下發酵槽適用的指標、可用作為發酵槽中菌體密度的揮發性懸浮誘發物的密度(MLVSS)、醋酸濃度及氣體的生成速度。表6固定床和完全混合甲烷發酵槽的操作條件
發酵結果如下。
1、醋酸的去除率和稀釋率圖14中示出了醋酸負荷為2.5(g/l·天)時的醋酸去除率和稀釋率之間的關係。固定床甲烷發酵槽以稀釋率為1(l/天)運轉實驗中大致100％的醋酸被去除，對此，完全混合甲烷發酵槽接近於發酵停止狀態。當稀釋率為2(l/天)時，固定床甲烷發酵槽的醋酸去除率在85％以上。我們認為其原因是由於固定床甲烷發酵槽在石絨上固定了大量的菌體，微生物滯留時間(MRT)要比水理學的平衡滯留時間(HRT)更長。即，可以認為使用石絨能效果顯著地防止菌體被衝洗。
2、醋酸去除率和醋酸負荷圖15示出了稀釋率為0.2(l/天)時醋酸去除率和醋酸負荷之間的關係。固定床甲烷發酵槽的醋酸去除部分很少，達到醋酸負荷為5(g/l·天)。即使醋酸負荷增加到7(g/l·天)，得到的醋酸去除率為88％。完全混合型甲烷發酵槽中的醋酸去除率受醋酸負荷的影響很大。當醋酸負荷從0.54增大到2.6(g/l·天)時，固定床甲烷發酵槽的醋酸去除率保持100％。而另一方面，完全混合甲烷發酵槽的醋酸去除率減少到95％。醋酸負荷從2.5到7(g/l·天)時，固定床甲烷發酵槽的醋酸去除率從98％減少到88％，而完全混合甲烷發酵槽的醋酸去除率從95％急據降到52％。這是因為在固定床上充分保持了捕捉的菌體密度，當促進醋酸分解時，如圖16所示，對於醋酸負荷的變化，固定床甲烷發酵槽的PH變化要小於完全混合甲烷發酵槽的PH變化。在預備試驗中，加入了石絨的發酵液PH和總鹼度分別增加0.2和50(CaCO2mg/l)，可以認為石絨對發酵槽的醋酸負荷引起的PH變化起到了緩衝作用。
3、甲烷生成速度和稀釋率圖17中示出了醋酸負荷為5(g/l·天)時，發酵槽的甲烷生成速度和稀釋率之間的關係。稀釋率從0.05增大到2(l/天)時，固定床甲烷發酵槽的甲烷生成速度降低很微小。對此。完全混合甲烷發酵槽，以低於0.3(l/天)的稀釋率，甲烷生成速度，比固定床甲烷發酵槽稍快。當稀釋率超過0.2(l/天)時，會急速減少。正如圖18中明確的，菌體密度達到最高時的稀釋率，完全混合甲烷發酵槽為0.2(l/天)、固定床甲烷發酵槽為1(l/天)，當比較各自的甲烷生成速度時，以石絨作載體的固定床甲烷發酵槽比完全混合甲烷發酵槽分別高1.2倍和8.5倍。可以認為這就證明了，如前所述，石絨捕捉了甲烷菌，防止了「被衝洗掉」。
4.菌體密度和稀釋率圖18示出了醋酸負荷為5(g/l.天)時菌體密度和稀釋率之間的關係。稀釋率從0.06增加到1(1/天)時，固定床內部石絨空隙間液體的菌體密度增加到13.2(g/l)。當稀釋率增加到2(l/天)時，固定床內部石絨空隙間液體的菌體密度降低到12.2(g/l)，而從固定床甲烷發酵槽排出的脫離液菌體密度幾乎不變，為0.8(g/l)。完全混合甲烷發酵槽的菌體密度，當稀釋率從0.06增加到0.2(l/天)時，從3.1增加到3.3(g/l)，但，稀釋率超過0.2時，會急劇減少，稀釋率為1(l/天)時，菌體密度為0.2(g/l)，稀釋率為2(l/天)時，菌體密度為0.0(g/l)。這可以認為，在固定床甲烷發酵槽中，由於捕捉了大量的甲烷菌，而防止了菌體的洗脫，在完全混合甲烷發酵槽中，甲烷菌體的洗脫現象，在稀釋率為0.2(l/天)以上時會發生。
另外，稀釋率為1(l/天)時，固定床甲烷發酵槽的有效容積的平均甲烷菌體密度為0.32×13.50+(1-0.32)×1＝5.00(g/l)。這可以認為，稀釋率為0.2(l/day)時，是完全混合甲烷發酵槽的菌體濃度3.3(g/l)的1.5倍的密度，石絨具有優良的保持甲烷菌體的能力。
5、菌體密度和醋酸負荷圖19示出了稀釋率為0.2(l/天)時固定床內部液體中的菌體密度、固定床甲烷發酵槽脫離液的菌體密度和完全混合甲烷混合槽的菌體密度與醋酸負荷之間的關係。作為醋酸負荷增加到5(g/l天)，之後，醋酸負荷達到7(g/l.天)時，固定床內部液中的菌體密度和完全混合甲烷發酵槽的菌體密度，雙方的菌體密度都有減少。這時固定床內部液體中的菌體密度比完全混合甲烷發酵槽的菌體密度約高8倍。
在醋酸負荷為7(g/l、天)、稀釋率為2(l/天)的苛刻條件下，進行測定固定床甲烷發酵實驗結束後立即測定的附著在石絨表面上的菌體密度、滯留在石絨內部液體中的菌體密度、固定床甲烷發酵槽脫離液的菌體密度，結果示於圖20。附著在石絨表面上的菌體密度是從固定床洗出的菌體，即固定床中液體所含的菌體，以式(1)的方法計算出。
附著在石絨上的菌體密度(g/l)＝(洗出的菌體一固定床中的液體體積×固定床內部中的液體菌體密度)/固定床體積固定床內部中液體的菌體密度，分別是石絨上附著的菌體密度、固定床甲烷發酵槽脫離液菌體密度的4倍、12倍。作為載體的石絨到實驗結束時變成了黑色，但沒觀察到變形和損壞等，可以認為是既廉價，耐久性又好的固定床材料。
從以上結果可知，在將石絨作載體的發酵槽內，通過維持大量的菌體，將石絨作載體的固定床內，很容易物理補足甲烷菌，對於甲烷菌要考慮對生物生息穩定的環境，對於較高的稀釋率和醋酸負荷，可維持很高的菌體密度。該方法啟發我們利用醋酸同化甲烷菌實現高速甲烷發酵的可行性非常高。
正如以上詳細說明，根據本申請的發明，由於能在生物反應器和廢水處理裝置內實現高活性和高密度的菌體，所以能提高流動床和固定床培養裝置等各種生物反應器的能力。通過將這種載體應用於生態系統等環保中，可用來恢復惡化了的環境和提高恢復環境的速度。
圖1是本發明載體(A)的示例圖。
圖2是在載體(A)中載帶生物分解性樹脂/有機碳源的示例圖。
圖3是在載體(A)上生物分解性樹脂和有機碳源中栽植細菌的示例圖。
圖4是具有控制擴散用被覆的載體(B)示意圖。
圖5是在表面菌體上具有被覆的載體(C)示意圖。
圖6是在載體(A)、(B)、(C)任何一個上被覆了生物分解性樹脂的示例圖。
圖7是對圖5的放大模擬示意圖。
圖8是具有磁性體被覆的示例圖。
圖9是流動床生物反應器示例圖。
圖10是固定床生物反應器示例圖。
圖11是間斷氣硝化、脫氮裝置示例圖。
圖12是作為實施例的甲烷生成結果示例圖。
圖13是(A)、(B)分別對氫發生速度的PH影響示例圖。
圖14是表示使用石絨載體的甲烷發酵中醋酸去除率和稀釋率之間關係圖。
圖15是表示稀釋率為0.2(l/day)時，醋酸去除率和醋酸負荷之間關係圖。
圖16是表示醋酸負荷和PH之間關係圖。
圖17是表示醋酸負荷為5(g/l.day)時，甲烷生成速度和稀釋率之間關係圖。
圖18是表示菌體密度和稀釋率之間關係圖。
圖19是表示菌體密度和醋酸負荷之間關係圖。
圖20是表示固定床甲烷發酵槽的菌體分布圖。
權利要求
1.由石絨形成的菌體培養用載體。
2.權利要求1的菌體培養用載體用於固定床甲烷發酵槽。
全文摘要
本發明提供在生物反應器和廢水處理等中實現高活性和高密度菌體的培養載體，該載體是由石絨形成的。該載體可以用於固定床甲烷發酵槽。
文檔編號C12N11/14GK1431303SQ0214993
公開日2003年7月23日 申請日期2002年11月8日 優先權日1997年5月29日
發明者前川孝昭 申請人:科學技術振興事業團