結直腸癌檢測標記物及其檢測方法、試劑盒和生物晶片的製作方法

2023-05-30 12:33:46 1

專利名稱：結直腸癌檢測標記物及其檢測方法、試劑盒和生物晶片的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及人血清/血漿中微小核糖核酸分子的分離、定性和定量分析，同時也涉及結直腸癌的各種臨床指徵。具體來說，本發明是一種檢測結直腸癌 病人血清/血漿中微小核糖核酸的方法，通過結直腸癌病人血清/血漿中微小核糖核酸的 變化，在體外診斷結直腸癌，判斷結直腸癌發病過程，預測結直腸癌併發症的發生和結直腸 癌復發的機率、以及結直腸癌的預後，並分析藥效和療效。
背景技術：
結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，發生率僅次於胃癌和食道癌。在我國常見惡 性腫瘤死亡中，結直腸癌患者在男性佔第五位，女性佔第六位。近二十年來結直腸癌的發病 率在逐漸增加，同時，其發病年齡趨向老齡化。在西方發達國家，結直腸癌是僅次於肺癌的 第二位惡性腫瘤。不同國家的發病率相差60倍。好發部位為直腸及直腸與乙狀結腸交界 處，佔60%。發病多在60 70歲，50歲以下不到20%。結直腸癌的診斷主要依據直腸指檢、直腸鏡或乙狀結腸鏡檢查以及鋇劑灌腸、纖 維結腸鏡檢查結果。結直腸癌早期症狀不典型，甚至無症狀，經常會被誤診，誤診率高達 30%。因此，尋找結直腸癌標記物並對其進行準確檢測已經成為結直腸癌的早期診斷和治 療的極其緊迫和重要的前提條件。儘管越來越多的疾病標記物已經被發現並應用於臨床疾病的普查、診斷和療效的 監控，但是它們的臨床應用效果還存在著明顯不足。例如，腫瘤標記物、乳酸脫氫酶、癌胚抗 原等已被廣泛應用於臨床，但是這些疾病標記物還遠遠不能滿足對癌症早期診斷的需要， 其主要原因有兩個方面(1)上述疾病標記物的靈敏度和特異性相對較低，它們的檢測結 果還不能作為疾病確診的指標；(2)疾病的早期診斷率應與治療的效果呈現正相關，而上 述任何一種疾病標記物還難以滿足疾病早期診斷的這種要求。以癌症為例，由於存在著腫 瘤分化類別特異性過強、腫瘤整體敏感性較低、送檢標本難以反覆採取、標本保存要求條件 高等缺陷，同時價格昂貴，因此在現有條件下難以廣泛推廣應用現有的腫瘤標記物。而一些 傳統醫學手段，如組織細胞檢測存在著其固有的缺陷，取材位置不當、組織細胞標本材料不 足或人為經驗不足等都將導致誤診。其它技術例如影像學雖然已被廣泛應用於疾病的檢查 和診斷，但其在疾病程度的定性上仍存在著很大的局限性。因此目前非常有必要尋找能夠 彌補現有標記物的上述缺陷的新型、靈敏並且應用方便的疾病檢測標記物。微小核糖核酸，英文名為microRNA，是一類長約19至23個核苷酸的非編碼單鏈 小核糖核酸分子。它們在進化上高度保守，並與動物的許多正常生理活動，如生物個體發 育、組織分化、細胞調亡以及能量代謝等密切相關，同時也與許多疾病的發生及發展存在著 緊密的聯繫。最近的研究發現慢性淋巴細胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的幾種微小核 糖核酸的表達水平均有不同程度的下調(Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM et al. Detection of elevated levels of tumor-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B—cell lymphoma. Br J Haematol 2008;141:672-675)；分析比較人月市癌、乳腺癌組織中的微小核糖核酸表達時，發現有若干組織特異性微小核糖核酸的表達水 平相對於正常組織發生了變化(Garofalo M, Quintavalle C, Di Leva G et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene 2008)。也有研究證明微小核糖核酸影響了心肌肥厚、心衰、動脈粥樣硬化等心血管疾病的 發生和發展，並且與II型糖尿病等代謝性疾病有密切關聯(Tryndyak VPiRoss SA，Belmd FA, Pogribny IP. Down-regulation of the microRNAs miR_34a，miR-127，and miR_200b in rat liver during hepatocarcinogenesis induced by a methyl-deficient diet. Mol Carcinog. 2008 Oct 21)。這些實驗結果提示微小核糖核酸表達及特異性變化與疾病發生 和發展之間存在著必然聯繫。由於微小核糖核酸在基因轉錄後的表達調控中起著超乎想像的重要作用，因此它 與疾病存在以下的關聯性首先，微小核糖核酸的變化可能是病因，這是因為疾病的抑制 因子以及促進因子都可能是微小核糖核酸的靶位點，當微小核糖核酸本身先發生了紊亂表 達，比如本來抑制疾病促進因子的微小核糖核酸表達量降低了，或者抑制疾病抑制因子的 微小核糖核酸表達量升高了，其最終結果都會導致下遊一系列基因表達的變化以及某些通 路的整體紊亂，進而誘發疾病發生；其次，微小核糖核酸的變化也可能是疾病的結果，這是 因為當疾病(如癌症)發生時，會導致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的劇 烈擴增，若微小核糖核酸正好位於這一變化區段內，那麼其表達量將發生極其顯著的變化。 因此，理論上微小核糖核酸分子完全可以作為一類新的疾病標記物，它的特異性變化必然 與疾病產生發展相關聯。同時微小核糖核酸還可以作為潛在的藥物作用靶點，通過抑制疾 病過程中上調的微小核糖核酸或過表達下調的微小核糖核酸，將有可能極大地緩解疾病的 發生和發展。國內目前已有以微小核糖核酸作為疾病標記物的相關研究，如中國專利申請 CN100999765A和CN101298630A，它們均選取佔惡性腫瘤發病率第4位的結腸癌作為研究對 象，經研究發現，在結腸良性息肉發展成惡性腫瘤期間，一些微小核糖核酸分子都存在著特 異性變化，並據此通過測定微小核糖核酸的特異性變化已經建立起一種更敏感、更精確的 早期確診結腸癌的方法。然而由於組織標本的取材不容易使這種方法在臨床上的廣泛應用 受到了限制。

發明內容
為克服此缺陷，本申請人將研究目光投向較易獲得，甚至常規體檢中就可以收集 到的血液。由於血液會循環至全身所有組織，並向細胞輸送營養並清除廢物，因此血液能 夠反映出整個機體的生理病理狀況，其檢測結果對人體健康具有指導意義。已知血清/血 漿中存在著多種蛋白，如總蛋白、白蛋白、球蛋白等，多種脂質，如HDL膽固醇、三甘油脂等， 多種糖質，色素，電解質和無機鹽，多種酶，如澱粉酶、鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、膽素脂酶、 醛縮酶等，同時還匯集了來自全身組織器官的多種信號分子，如細胞因子，激素等。目前，對 疾病的診斷僅僅局限於血清/血漿中的上述生化指標，尚無血清/血漿微小核糖核酸的報 道。人們傳統觀念中認為血清/血漿中沒有核糖核酸分子，即使有也會很快被核糖核酸酶 降解為小分子片段而檢測不到。但是，由於微小核糖核酸分子是由19至23個核苷酸單元 組成，具有結構上的特殊性和相對穩定性，它們極有可能存在於血清/血漿中。本申請發明人之一張辰宇教授的前期研究已經證實，血清/血漿中穩定地存在微小核糖核酸，且每一 禾中雙胃·胃個生白勺(Chen et al :Characterization of microRNAs in serum a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 2008 Oct ；18(10) 997)。為尋找結直腸癌檢測標記物並對其進行準確檢測，申請人基於已有的研究成果， 進行了以下幾個方面的研究(1)研究結直腸癌發病過程中血清/血漿微小核糖核酸的特異性變化；(2)通過用於檢測血清/血漿微小核糖核酸的生物晶片和測序技術測定結直腸癌 血清/血漿微小核糖核酸的變化；(3)將篩選到的在結直腸癌及正常生理狀態下表達差異程度大的一類血清/血漿 微小核糖核酸分子應用於血清/血漿微小核糖核酸檢測技術，製備應用於結直腸癌診斷等 領域的生物晶片和診斷試劑盒。通過上述對血清/血漿微小核糖核酸與結直腸癌的相關性的研究，申請人提出了 以血清/血漿中穩定存在的特定微小核糖核酸作為結直腸癌檢測標記物，建立一種體外檢 測血清/血漿中穩定存在的特定微小核糖核酸的方法，通過檢測特定微小核糖核酸的特異 性變化來進行結直腸癌的早期診斷，疾病鑑定和病程監控，復發及預後、併發症發生的預 測，同時可以進一步進行藥效判定、用藥指南、個體化治療、中藥有效成份篩選、種群分類等 研究。本發明的目的首先是提供一種結直腸癌檢測標記物，所述標記物包括以下在人體 血清/血漿中穩定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體(Mature microRNA)中的任意一種 或一種以上(例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、、4、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85或86種)，優選任意兩種或兩種以上let-7b> let_7c、 miR—122、 miR-125a-5p> miR-125b> miR-128a> miR-128b> miR-133a> miR—134、miR-139-3p> miR-139-5p> miR-145> miR-146a> miR—150、miR-152> miR-193a-5p> miR-197> miR-199a-3p> miR-199a-5p> miR-199b-3p> miR-22> miR-221> miR-222> miR-223> miR-23a> miR-23b> miR-24> miR-25> miR-27a> miR-27b> miR-28-3p> miR-29a> miR-30d> miR-320> miR-323-3p> miR-330-3p> miR-339-3p> miR-339-5p> miR-342-3p> miR-342-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-432> miR-433> miR-486-3p> miR-495> miR-543> miR-574-3p> miR-584> miR-598> miR-744> miR-766> miR-92a> miR-92b> miR-99a> miR-99b、 let-7f、let-7g、miR-100、miR_106a、miR_106b、miR-142_3p、miR-144、miR_148a、miR-15a、 miR-16> miR-17> miR-182> miR-183> miR-18a> miR-194> miR_19b、miR-20a> miR_20b、 miR-29b、miR-340、miR-362-5p、miR-374a、miR-424、miR-451、miR-454、miR-7 和 miR-96。上述血清/血漿可以來源於人體活體、組織、器官和/或屍體。本發明的另一個目的是提供檢測上述結直腸癌標記物的方法，通過該方法可以進 一步評價人體乳腺癌的狀態。上述檢測方法選自反轉錄聚合酶鏈式反應方法(RT-PCR)、實時螢光定量聚合酶鏈式反應方法(Real-time PCR)、Northern印跡雜交方法(Northern blotting)、核糖核酸酶保護分析方法(RNase protection assay)、Solexa 測序技術(Solexa sequencing technology)或生物晶片方法。上述RT-PCR方法為優選方法，包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過Trizol試劑提取)，通過RNA逆轉 錄反應得到cDNA樣品；或者收集受試者的血清/血漿樣本，以血清/血漿作為緩衝液進行 逆轉錄反應來製備cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設計引物進行PCR反應；3)進行PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳；4) EB染色後在紫外燈下觀察結果；上述Real-time PCR方法為另一優選方法，包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過Trizol試劑提取)，通過RNA逆轉錄 反應得到cDNA樣品；或者以受試者的血清/血漿作為緩衝液進行逆轉錄反應來製備cDNA 樣品；2)用微小核糖核酸設計引物；3)加入螢光探針進行PCR反應；4)檢測並比較血清/血漿樣本相對於正常血清/血漿中微小核糖核酸的量的變 化。上述Northern blotting方法包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過Trizol試劑提取)；2)進行變性PAGE電泳和膜轉移實驗；3)製備同位素標記微小核糖核酸探針；4)進行膜雜交反應；5)同位素信號檢測，如磷屏掃描檢測結果。上述RNase protection assay方法包括如下步驟1)進行反義RNA探針的合成，同位素標記與純化；2)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過Trizol試劑提取)；3)將提取後的RNA溶解在雜交緩衝液中並加入反義RNA探針進行雜交反應；4)加入RNase消化液進行反應；5)進行電泳與放射自顯影；6)分析結果。上述 Solexa sequencing technology 方法包括如下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過Trizol試劑提取)；2)進行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子；34)將adaptor prime酶聯在小RNA分子的3』與5』端；4)進行RT-PCR反應後進行測序；5)數據分析與處理。上述生物晶片方法包括如下步驟1)將人體血液/血漿中全部一千多種微小核糖核酸成熟體庫點陣並製備生物晶片；2)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過Trizol試劑提取)；3)通過柱分離來分離微小核糖核酸；4)利用T4 RNA連接酶進行微小核糖核酸螢光標記；5)與生物晶片進行雜交反應；6)數據檢測與分析。上述方法中所使用的血清/血漿來源於受試者活體、組織、器官和/或屍體。本發明通過上述方法可以分析在結直腸癌發生中血清/血漿微小核糖核酸的變 化趨勢及變化量，以及它們與結直腸癌的相關性。因此，以上檢測人體血清/血漿中穩定存 在且可檢測的86種微小核糖核酸的方法可以進一步評價人體結直腸癌的狀態，進而可以 為人們提供一種預測、診斷、鑑別和/或評價結直腸癌的方法，該方法主要通過檢測受試者 血清/血漿中86種特定微小核糖核酸即所謂的結直腸癌檢測標記物來實現.本發明的又一目的是提供上述結直腸癌檢測標記物在製備、預測、診斷、鑑別和/ 或評價結直腸癌的試劑或工具中的應用，包括製備相應的試劑盒和生物晶片。本發明還提供了一種用於檢測結直腸癌檢測標記物的微小核糖核酸探針組合，也 即預測、診斷和/或評價結直腸癌的微小核糖核酸探針組合，所述探針組合包括以下核苷 酸序列所示的探針中的任意一種或一種以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、、4、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85 或 86 種)，優選任意兩種 或兩種以上let-7b> let_7c、 miR—122、 miR-125a-5p> miR-125b> miR-128a> miR-128b> miR-133a> miR—134、miR-139-3p> miR-139-5p> miR-145> miR-146a> miR—150、miR-152> miR-193a-5p> miR-197> miR-199a-3p> miR-199a-5p> miR-199b-3p> miR-22> miR-221> miR-222> miR-223> miR-23a> miR-23b> miR-24> miR-25> miR-27a> miR-27b> miR-28-3p> miR-29a> miR-30d> miR-320> miR-323-3p> miR-330-3p> miR-339-3p> miR-339-5p> miR-342-3p> miR-342-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-432> miR-433> miR-486-3p> miR-495> miR-543> miR-574-3p> miR-584> miR-598> miR-744> miR-766> miR-92a> miR-92b> miR-99a> miR-99b> let-7f、let-7g、miR-100、miR-106a、miR-106b、miR-142-3p、miR-144、miR-148a、miR-15a、 miR-16> miR-17> miR-182> miR-183> miR-18a> miR-194> miR_19b、miR-20a> miR_20b、 miR-29b、miR-340、miR-362_5p、miR_374a、miR-424、miR-451、miR-454、miR-7 和 miR-96。
權利要求
一種結直腸癌檢測標記物，其特徵在於所述標記物包括以下在人體血清/血漿中穩定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體中的任意一種或一種以上let 7b、let 7c、miR 122、miR 125a 5p、miR 125b、miR 128a、miR 128b、miR 133a、miR 134、miR 139 3p、miR 139 5p、miR 145、miR 146a、miR 150、miR 152、miR 193a 5p、miR 197、miR 199a 3p、miR 199a 5p、miR 199b 3p、miR 22、miR 221、miR 222、miR 223、miR 23a、miR 23b、miR 24、miR 25、miR 27a、miR 27b、miR 28 3p、miR 29a、miR 30d、miR 320、miR 323 3p、miR 330 3p、miR 339 3p、miR 339 5p、miR 342 3p、miR 342 5p、miR 361 5p、miR 382、miR 423 3p、miR 423 5p、miR 361 5p、miR 382、miR 423 3p、miR 423 5p、miR 432、miR 433、miR 486 3p、miR 495、miR 543、miR 574 3p、miR 584、miR 598、miR 744、miR 766、miR 92a、miR 92b、miR 99a、miR 99b、let 7f、let 7g、miR 100、miR 106a、miR 106b、miR 142 3p、miR 144、miR 148a、miR 15a、miR 16、miR 17、miR 182、miR 183、miR 18a、miR 194、miR 19b、miR 20a、miR 20b、miR 29b、miR 340、miR 362 5p、miR 374a、miR 424、miR 451、miR 454、miR 7和miR 96。
2.根據權利要求1所述的結直腸癌檢測標記物，其特徵在於所述標記物包括以下在人 體血清/血漿中穩定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體中的任意兩種或兩種以上let-7b、let-7c、miR-122、miR-125a_5p、miR_125b、miR_128a、miR_128b、miR_133a、 miR-134> miR-139-3p> miR-139-5p> miR-145> miR-146a> miR—150、miR-152> miR-193a-5p> miR-197> miR-199a-3p> miR-199a-5p> miR-199b-3p> miR-22> miR-22U miR-222> miR-223> miR-23a> miR-23b> miR-24> miR-25> miR-27a> miR-27b> miR-28-3p> miR-29a> miR_30d、 miR-320> miR-323-3p> miR-330-3p> miR-339-3p> miR-339-5p> miR-342-3p> miR-342-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p、miR-432、miR-433、miR-486_3p、miR-495、miR-543、miR-574_3p、miR-584、 miR-598> miR-744> miR-766> miR-92a> miR-92b> miR-99a> miR-99b> let—7f、 let—7g、 miR-100>miR-106a>miR-106b>miR-142-3p>miR-144>miR-148a>miR-15a>miR-16>miR-17> miR-182> miR-183> miR-18a> miR—194、miR—19b、miR-20a> miR—20b、miR-29b> miR—340、 miR-362-5p、miR_374a、miR-424、miR-451、miR-454、miR-7 和 miR-96。
3.根據權利要求1至2中所述的結直腸癌檢測標記物，其特徵在於所述血清/血漿來 源於人體活體、組織、器官和/或屍體。
4.權利要求1至3任意一項所述的結直腸癌檢測標記物的檢測方法，其特徵在於選自 反轉錄聚合酶鏈式反應方法、實時螢光定量聚合酶鏈式反應方法、Northern印跡雜交方法、 核糖核酸酶保護分析方法、Solexa測序技術或生物晶片方法。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於所述反轉錄聚合酶鏈式反應方法包括 以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品；或者以受試 者的血清/血漿作為緩衝液進行逆轉錄反應來製備cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設計引物進行PCR反應；3)進行PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳；4)EB染色後在紫外燈下觀察結果。
6.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於所述實時螢光定量聚合酶鏈式反應方法包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉錄反應得到CDNA樣品；或者以受試 者的血清/血漿樣本作為緩衝液進行逆轉錄反應來製備cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設計引物；3)加入螢光探針進行PCR反應；4)檢測並比較血清/血漿樣本相對於正常血清/血漿中微小核糖核酸的量的變化。
7.一種預測、診斷和/或評價結直腸癌的方法，其特徵在於，所述方法包括檢測以下人 體血清/血漿中穩定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體中的任意一種或一種以上let-7b、let-7c、miR-122、miR-125a_5p、miR_125b、miR_128a、miR_128b、miR_133a、 miR-134> miR-139-3p> miR-139-5p> miR-145> miR-146a> miR—150、miR-152> miR-193a-5p> miR-197> miR-199a-3p> miR-199a-5p> miR-199b-3p> miR-22> miR-22U miR-222> miR-223> miR-23a> miR-23b> miR-24> miR-25> miR-27a> miR-27b> miR-28-3p> miR-29a> miR_30d、 miR-320> miR-323-3p> miR-330-3p> miR-339-3p> miR-339-5p> miR-342-3p> miR-342-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p、miR-432、miR-433、miR-486_3p、miR-495、miR-543、miR-574_3p、miR-584、 miR-598> miR-744> miR-766> miR-92a> miR-92b> miR-99a> miR-99b> let—7f、 let—7g、 miR-100>miR-106a>miR-106b>miR-142-3p>miR-144>miR-148a>miR-15a>miR-16>miR-17> miR-182> miR-183> miR-18a> miR—194、miR—19b、miR-20a> miR—20b、miR-29b> miR—340、 miR-362-5p、miR_374a、miR-424、miR-451、miR-454、miR-7 和 miR-96。
8.權利要求1或2所述的結直腸癌檢測標記物在製備預測、診斷、鑑別和/或評價結直 腸癌的試劑或工具中的用途。
9.一種用於檢測結直腸癌檢測標記物的微小核糖核酸探針組合，其特徵在於所述組合 包括以下探針序列中的任意一種或一種以上
10.一種用於檢測結直腸癌標記物的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包含檢測權利要 求1或2所述檢測標記物的工具。
11.根據權利要求10所述的試劑盒，其特徵在於所述工具包括權利要求9所述的探針組合。
12.根據權利要求10所述的試劑盒，其特徵在於所述工具還包括DNA聚合酶和/或脫 氧核糖核苷酸混合物。
13.一種用於檢測結直腸癌檢測標記物的生物晶片，其特徵在於所述生物晶片包含檢 測權利要求1或2所述的檢測標記物的元件。
14.根據權利要求13所述的生物晶片，其特徵在於所述生物晶片的元件包括權利要求 9所述的探針組合。
全文摘要
本發明涉及一種利用人體血清/血漿中穩定存在的86種特定微小核糖核酸作為結直腸癌的檢測標記物以及檢測該標記物的方法、相關試劑盒及生物晶片。能夠用於結直腸癌的診斷與鑑別診斷、疾病併發症的發生和復發的預測、療效評價，以及藥物活性成分的篩選、藥效評價等方面，具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測成本低、取材方便、樣本易存放等優點，該方法可廣泛用於結直腸癌普查等相關工作，改進單一的標記物所難以克服的個體差異所帶來的低特異性和低靈敏度，顯著提高結直腸癌的臨床檢出率，成為早期診斷結直腸癌的有效手段。
文檔編號C12Q1/68GK101988060SQ201010238448
公開日2011年3月23日 申請日期2010年7月28日 優先權日2009年7月30日
發明者張辰宇, 曾科, 李海進 申請人:江蘇命碼生物科技有限公司