一種快速檢測大豆脂氧酶缺失的方法
2023-06-04 10:47:36 3
專利名稱：一種快速檢測大豆脂氧酶缺失的方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質的檢測方法，特別是涉及一種通過改進的SDS-PAGE法檢測大豆脂氧酶(lipoxygenase)缺失的方法。
背景技術：
大豆是世界各國人民日常生活中最重要的植物油和優質蛋白質的攝取源之一，也是眾多食品(如植物奶油、香腸)、工業製品(如潤滑油、油墨)的主要原料或添加劑。但是由於大豆種子中脂肪氧化酶(lipoxygenase，縮寫Lox，簡稱脂氧酶，它有三個同工酶， Lox-1,Lox-2,Lox-3)的存在。它催化種子中的亞油酸等具有順，順_1，4_戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸，生成過氧化氫的衍生物，最終被分解成易揮發的醛、醇、酮等小分子物質， 這些小分子物質是導致大豆種子破碎遇氧產生腥臭味的根源。由於大豆腥臭味的存在，影響了大豆製品的開發利用價值，以大豆為原料的加工企業為了去除大豆種子中的腥臭味， 不得不通過加熱去腥和包埋等辦法來去除它，但即便如此也未能完全去除腥臭味，增加了加熱去腥成本，而且由於加熱，還容易造成大豆蛋白質成分的變性，降低了大豆的營養價值。研究表明，大豆種質資源庫中，存在Lox-1，-2，-3中單一缺失或雙缺失的大豆資源，通過人工雜交技術，可以從根本上去除大豆腥臭味。問題是如何從眾多的雜交後代中篩選鑑別出Lox中的3個同工酶的某一個或兩個缺失的後代。目前常用的方法主要有3種聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測法(SDS-PAGE)，等電點電泳法(IEF-PAGE)和β-胡蘿蔔素褪色法。其中，與本發明最相近的技術是SDS-PAGE法。在判斷Lox是完全缺失與否的情況下，三者都可以準確判定，其中SDS-PAGE法是最簡便易行的方法，而當要判定Lox-1，-2，-3中某個缺失與否時，IEF-PAGE法最準確，但檢測步驟也最複雜不易掌握，費時間，檢測成本也最高。胡蘿蔔素褪色法雖與SDS-PAGE法相比較更為準確但也存在著檢測成本高等弊端，現有SDS-PAGE法雖然檢測方法簡便易行，但在粗蛋白提取方面採用的方法是常規提取大豆全蛋白所通用的方法，即切取大豆種子種臍反側的子葉的粉末5-10mg，放入1. 5ml離心管，加入蛋白提取緩衝液(Tris-HCl，pH7. 2)，振蕩器震蕩 10秒左右，靜置15-30min，即可利用SDS-PAGE上樣跑膠，所用的分離膠也是分析大分子量蛋白通用的7. 5%的濃度的膠，對分子量大且三個分子量都很接近的蛋白質種類來說不適合，在判斷Lox中某一個或兩個缺失與否時，幾乎無法準確判斷，存在著誤判高的缺點。
發明內容
針對上述情況，本發明所要解決的技術問題是提供一種快速簡便，能夠用肉眼就能簡單準確地區分鑑別Lox-I和Lox-2單一缺失或兩個缺失與否的新方法。本發明提供的方法是對原有SDS-PAGE方法的改進，主要針對現有技術的粗蛋白提取方法和制膠技術進行了改進，改進後的方法，可用於Lox-I和Lox-2缺失的鑑定，且操作簡單、快速，鑑定結果直觀準確。具體的本發明所要解決的技術問題是通過以下方法實現的
本發明的組成本發明由大豆Lox脂氧酶蛋白的提取、聚丙烯醯胺凝膠的製備、 SDS-PAGE電泳，膠的染色及脫色五部分構成，其中Lox脂氧酶的提取、聚丙烯醯胺凝膠的製備是本發明的核心所在，SDS-PAGE電泳膠的染色和脫色為常規共有技術。本發明提供的一種快速檢測大豆脂氧酶缺失的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)大豆Lox脂氧酶蛋白的提取切取種子細粉6 8mg，放入1. 5mL的離心管，加入提取緩衝液，用震蕩器攪拌均勻，超聲波萃取6 8min，室溫下放置20 30min，再度攪拌後，5000r · mirT1離心5min,取上清液10 μ L-12 μ L用於SDS-PAGE電泳解析；(2)聚丙烯醯胺凝膠的製備成膠溶液的配製A液配製成由4. Og/L SDS, 3M Tris-HCl組成的混合溶液，pH值調至8. 8 ；B液配製成0. 48M HCl溶液，用Tris調整PH至7. O ；C液配製成由300g/L的丙烯醯胺，8g/L的雙丙烯醯胺組成的混合溶液；P液配製成15g/L的過硫酸銨溶液；E液配製成0. 04g/L的核黃素溶液；分離膠的配製配製質量體積百分比為6. 75%的聚丙烯醯胺凝膠液，以規格為 16cmX 14cm的玻璃板製取Imm厚的膠2枚(需分離膠溶液36mL)為例，由以下體積的溶液配製而成A液9. 0mL，C液8. lmL，P液UmL，蒸餾水17. lmL，N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)0. 024 μ L ；濃縮膠配製以配製上述規格的膠為例，兩塊板需濃縮膠溶液12mL，由以下體積的溶液配製而成=B液3. 2mL, C液2. OmL, E液2. 6mL, P液0. 4mL,蒸餾水3. 8mL, N，N，N'， N'-四甲基乙二胺(TEMED)O. 012μ L ；(3) SDS-PAGE 電泳電泳緩衝液的配製配製成甘氨酸14. 4g/L，Tris 3. Og/L, SDS 1. 25g/L的混合溶液，備用；(4)膠的染色及脫色；其中，大豆Lox脂氧酶蛋白的提取過程為取種子1粒，在其胚軸的相反側，切取種子細粉；其中所用提取緩衝液為0. 05mol · L^Tris-HCl, pH 7. 2，內含體積份數為2%的巰基乙醇，溴酚藍指示劑適量，加入量為lmL。本發明對所述溴酚藍指示劑的添加不做限制，應當理解的是，對於溴酚藍指示劑適量添加應屬本領域技術人員的常識範圍內。本發明所提供的方法相較於現有技術具有以下優點1、在Lox脂氧酶蛋白提取方面，新改進的技術與傳統技術的區別，在原來均質振蕩後，全蛋白靜置抽提之前，進行了 Smin左右的超聲波處理，然後，在室溫下靜置抽提20 30min，再度攪拌，並於5000r IirT1離心5min，取上清液10μ L_12y L用於SDS-PAGE電泳解析。通過超聲波處理，可以增加蛋白質的溶解度，從而不容易產生沉澱，而傳統技術電泳時由於蛋白容易沉積在膠體中難以移動，導致Lox-1，Lox-2及Lox-3同工酶的分離和鑑別困難。2、在聚丙烯醯胺凝膠的製備方面將聚丙烯醯胺凝膠的濃度從原來的7. 5%降到6.75%，使凝膠的網格空隙加大，便於Lox同工酶在分離膠上移動。傳統技術所使用的膠為
7.5%聚丙烯醯胺凝膠，同工酶Lox-I與Lox-2譜帶幾乎處於同一水平位置(圖1)，圖1參考自羽鹿牧太(夕· ^ 夕一報告、2002、第40號、PP 79-86)，當利用此方法進行Lox同工酶缺失資源篩選及雜交後代缺失性狀的鑑別時，容易引起同工酶缺失性狀的誤判。圖2為本發明的6. 75%的新聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜，通過此圖可以辨明樣品是否為缺失體，如圖2所示，同工酶Lox-I與 Lox-2譜帶的位置，較圖1有明顯的差異，在對同工酶缺失資源的篩選及雜交後代的同工酶缺失性狀鑑別時，不易引起誤判，具有較高的應用價值。
圖1為常規SDS-PAGE電泳法檢測脂氧酶缺失圖譜；圖2為本發明的大豆脂氧酶(lipoxygenase)缺失快速檢測電泳圖譜。
具體實施例方式以下通過實施例進一步闡明本發明的有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，決不限制本發明的範圍。實施例1實驗材料母本早CS8000(Lox_3nul1) (cv.，China)，父本 FJ307(Lox-l，-2，-3triple-null) (cv. Japan)，11 個來自 CS8000 (早)XFJ307 (J) F2 群體
的樣品。大豆Lox脂氧酶蛋白的提取分別各取種子1粒，在其胚軸的相反側，用裁紙刀片切取種子細粉6mg，放入1. 5mL的離心管，加入ImL提取緩衝液(0. 05mol · L^Tris-HCl, pH 7. 2，內含2%的巰基乙醇，溴酚藍指示劑適量)，用震蕩器攪拌均勻，超聲波萃取6min，室溫下放置20min，再度攪拌後，5000r · mirT1離心5min，取上清液10 μ L用於SDS-PAGE電泳解析。聚丙烯醯胺凝膠的製備成膠溶液的配製A 液=SDS 2. Og, Tris 181. 2g，用 Imol · Γ1 HCl 將 pH 值調至 8. 8，最後加蒸餾水定容至500mL ；C 液Acrylamide 30g，力口 Bisacrylamide 0. 8g，力口蒸溜/K定容至 lOOmL。P液過硫酸銨1. 5g，加蒸餾水至IOOmL ；B液Imol · Γ1 HCl 240mL加蒸餾水200mL充分混勻後，用iTris調整PH至7. 0， 最後加蒸餾水定容至500mL ；E液核黃素％ig，加蒸餾水IOOmL混勻；電泳緩衝液的配製甘氨酸Glycine 14. 4g, Tris 3. Og, SDS 1.25g，加蒸餾水 IOOOmL混勻備用；染色液的配製考馬絲亮藍G-250 1. 5g，加440mL乙醇(分析醇)，60mL乙酸，蒸餾水調至IOOOmL混勻備用；脫色液的配製量筒量取200mL甲醇，50mL乙酸，加蒸餾水至IOOOmL混勻備用；
玻璃板的組裝準備膠厚為Imm的普通SDS-PAGE用玻璃板(玻璃板規格為 16cmX14cm)，用70%乙醇將玻璃板的內表面擦拭乾淨涼幹，放置防漏膠用密封矽膠條(或矽膠管)，1塊板用4個大號長尾鋏，左右兩側各2個，固定在玻璃板上(以不漏膠為準)，垂直放置於水平實驗臺上；分離膠的配製配製6. 75%的聚丙烯醯胺凝膠液按A液9. OmL, C液8. ImL, P液 1. 8mL,蒸餾水17. ImL的先後順序加入到IOOmL的三角燒瓶中，充分混合均勻後，加入TEMED MyL，再度混勻後，平均倒入到兩套玻璃板的縫隙中，膠面的上部輕輕滴入蒸餾水適量，防止膠面乾燥，室溫放置20 30min膠液凝固後，倒掉上部蒸餾水，將其倒立於桌面，除去殘餘水分備用；濃縮膠配製按下列順序逐次加入B液3. 2mL, C液2. OmL, E液2. 6mL, P液0. 4mL, 蒸餾水3. SmL充分混勻後，再加入TEMED 12 μ L混勻，平均倒入到分離膠的上層，插入梳子， 室溫放置20 30min。凝縮膠凝固後撤下固定鋏，用蒸餾水輕輕衝洗掉凝固不完全的殘膠， 用保鮮膜包好，4°C倒置冷藏備用。SDS-PAGE電泳將配好的電泳緩衝液適量，倒入垂直電泳槽內(以沒過膠體底面為準)，安裝玻璃板於垂直電泳槽上，注意膠的底面不要進入氣泡；上槽倒入電泳緩衝液， 使液面沒過玻璃板缺口。用微量注射器或多道微量移液器抽取試樣10yL，慢慢注入進各泳道。電泳條件電壓100V，電泳時間Ih左右，待溴酚藍指示劑通過濃縮膠後，將電壓升至 150V,電泳時間4h左右，溴酚藍指示劑即將通過膠體底端的時候，停止電泳，取下膠體，放入染色液，輕搖染色lh，取出放入脫色液，輕搖脫色4h以上，在普通螢光玻璃燈箱上，確認 Lox同工酶的缺失狀態，隨後可將膠體乾燥後，掃描保存。結果鑑定如圖2所示，其中，左右兩側的泳道分別為母本早:CS8000(Lox-3null) (cv.，China),父本 FJ307(Lox_l，-2，-3triple-null)(cv. Japan),1-11 分別為 CS8000(早)父？307 ((^^2群體的部分樣品的電泳圖譜。通過此圖可以辨明樣品No. 1,5, 6，8 為 Lox-2，-3 缺失體，No. 2，4，7 為 Lox-I，-3 缺失體，No. 3，9，11 為 Lox_3 缺失體，No. 10 為Lox-I，-2，-3完全缺失體。如圖2所示，同工酶Lox-I與Lox_2譜帶的位置，較圖1有明顯的差異，在對同工酶缺失資源的篩選及雜交後代的同工酶缺失性狀鑑別時，不易引起誤判，具有較高的應用價值。實施例2大豆Lox脂氧酶蛋白的提取分別各取種子1粒，在其胚軸的相反側，用裁紙刀片切取種子細粉8mg，放入1. 5mL的離心管，加入ImL提取緩衝液(0. 05mol · L^Tris-HCl, pH 7. 2，內含2%的巰基乙醇，溴酚藍指示劑適量)，用震蕩器攪拌均勻，超聲波萃取Smin，室溫下放置30min，再度攪拌後，5000r · mirT1離心5min，取上清液12 μ L用於SDS-PAGE電泳解析。聚丙烯醯胺凝膠的製備，SDS-PAGE電泳，染色及脫色過程按照實施例1的方法進行。以上所述僅為本發明的優選實施例，對本發明而言僅是說明性的，而非限制性的； 本領域普通技術人員理解，在本發明權利要求所限定的精神和範圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發明的保護範圍內。
權利要求
1. 一種快速檢測大豆脂氧酶缺失的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)大豆Lox脂氧酶蛋白的提取切取種子細粉6 8mg，放入1.5mL的離心管中，加入提取緩衝液，用震蕩器攪拌均勻，超聲波萃取6 8min，室溫下放置20 30min，再度攪拌後，5000r · mirT1離心5min,取上清液10 μ L-12 μ L用於SDS-PAGE電泳解析；(2)聚丙烯醯胺凝膠的製備成膠溶液的配製A液配製成由4. Og/L SDS, 3M Tris-HCl組成的混合溶液，pH值調至8. 8 ；B液配製成0. 48M HCl溶液，用Tris調整PH至7. 0 ；C液配製成由300g/L的丙烯醯胺，8g/L的雙丙烯醯胺組成的混合溶液；P液配製成15g/L的過硫酸銨溶液；E液配製成0. 04g/L的核黃素溶液；分離膠的配製配製質量體積百分比為6. 75%的聚丙烯醯胺凝膠液，以規格為 16cmX 14cm的玻璃板製取Imm厚的膠2枚為例，需分離膠溶液36mL，由以下體積的溶液組成A 液 9. 0mL、C 液 8. lmL、P 液 1. 8mL、蒸餾水 17. lmL、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺 24yL;濃縮膠配製以配製上述規格的膠為例，兩塊板需濃縮膠溶液12mL，由以下體積的溶液組成=B 液 3. 2mL, C 液 2. OmL, E 液 2. 6mL，P 液 0. 4mL，蒸餾水 3. 8mL、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺12yL ；(3)SDS-PAGE 電泳電泳緩衝液的配製配製成甘氨酸14. 4g/L，Tris 3. Og/L, SDS 1. 25g/L的混合溶液，(4)膠的染色及脫色。
2.如權利要求1所述的一種快速檢測大豆脂氧酶缺失的方法，其特徵在於取種子1粒， 在其胚軸的相反側，切取種子細粉。
3.如權利要求1所述的一種快速檢測大豆脂氧酶缺失的方法，其特徵在於所述提取緩衝液為0. 05mol · L-1Tris-HCl, pH 7. 2，內含體積分數為2%的巰基乙醇，溴酚藍指示劑適量，加入量為lmL。
全文摘要
本發明是一種快速檢測大豆脂氧酶缺失的方法，其是對現有SDS-PAGE技術的改進，本發明的方法由大豆Lox脂氧酶蛋白的提取、聚丙烯醯胺凝膠的製備、SDS-PAGE電泳，膠的染色及脫色五部分構成，其中Lox脂氧酶的提取、聚丙烯醯胺凝膠的製備是本發明的核心所在，SDS-PAGE電泳膠的染色和脫色為常規共有技術。本發明的方法克服了原有技術不能直觀區分Lox-1，-2，-3中，單一缺失或雙缺失的缺陷，提供了一種可用於Lox-1和Lox-2缺失的鑑定，且操作簡單、快速，鑑定結果直觀準確的方法。
文檔編號G01N27/447GK102269731SQ20111015881
公開日2011年12月7日 申請日期2011年6月14日 優先權日2011年6月14日
發明者於佳, 馮曉, 劉偉, 劉燕, 姜妍, 李宏偉, 李遠明, 楊冬, 王曉雲, 王浩, 王紹東, 龔振平 申請人:黑龍江省大豆技術開發研究中心