一種將抗體導入細胞內的方法與流程
2023-10-21 10:48:22
本發明涉及抗體藥物技術領域，尤其涉及一種藉助於穿膜肽將抗體導入細胞內的方法。
背景技術：
在分子生物學中，胞內抗體(intrabody)指的是識別細胞內的蛋白並在細胞內發揮作用的抗體。由於缺乏有效的將抗體導入細胞內的手段，胞內抗體主要通過在靶細胞內表達抗體分子的手段實現，並應用基因重組技術對抗體分子進行適當修飾，使之有不同的亞細胞定位，如線粒體、高爾基體、溶酶體或細胞核，從而可以阻斷某些重要的過程，或者幹擾靶分子的加工分泌過程，從而發揮其生物學功能。早期通過抗體阻斷細胞內的蛋白之間的相互作用是通過顯微注射(microinjection)這種技術實現的，對成熟抗體在細胞內的穩定性及功能進行了研究。然而，這方面的研究報導很少，可能是這種技術需要複雜的操作過程。因此迫切需要開發更加廣泛應用的技術來實現將抗體分子導入活細胞內。
自然產生的抗體來源於b細胞，並且在細胞外發揮作用，目前臨床上使用的抗體藥物一般針對的是細胞表面的靶標，通過循環系統被運送至靶部位，而胞內抗體則是可以進入到靶細胞內部發揮其作用的抗體。自然產生的抗體是高度複雜的有序結構，抗體的結構對於維持抗體識別抗原及引起免疫效應起著重要的作用。雖然抗體分子可以在不同的細胞內表達，但是由於不同類型的細胞由於細胞質中的環境不同，最終導致產生出的抗體結構會有較大差別，甚至完全不能識別抗原。不僅如此，在臨床應用時，若通過使用抗體基因運送到靶細胞表達的方式產生胞內抗體會受到載體的限制。其它用於基因治療的將胞內抗體導入細胞的方法，包括病毒轉運系統和非病毒轉運系統，也面臨各種問題。病毒轉運系統包括腺病毒、慢病毒及腺相關病毒等，存在安全性(如引起癌基因的表達)及免疫排斥等問題。而利用非病毒轉運系統，例如裸露dna、各種dna的包裹技術，雖然安全性得到提高，但存在其它方面的問題，如靶向性差，轉染效率低和基因表達的瞬時性表達量低等問題。
細胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，cpps)是一段短的多肽，通常小於30個胺基酸，不僅本身具有穿越細胞膜的能力，還可以作為載體將生物大分子一同轉到細胞內。目前研究較多的是1988年green等首次發現的hiv-ⅰ的轉錄活化因子tat，後續的研究表明有轉導功能的結構存在於49～57位胺基酸，被稱為蛋白轉導域(proteintransductiondomain，ptd)，在此之後，很多具類似跨膜功能的多肽分子陸續被發現。
通過穿膜肽將親水的物質導入活細胞在基礎研究和治療學上都具有強大的應用潛力。而且，在實際中所轉導的貨物可以不受尺寸的限制，從而極大的提高可以轉運的貨物的範圍。穿膜肽在介導生物分子進入細胞有很多優勢，表現在：首先，細胞穿膜肽轉導的貨物不受分子量和其性質的顯著影響，應用範圍廣泛；其次，研究表明細胞穿膜肽毒性相對較小，具有良好的臨床應用潛力；再次，細胞穿膜肽可以穿越多種類型的組織細胞，無顯著的特異性，可以廣泛的應用於不同疾病的治療；最後，細胞穿膜肽穿膜能力強，可以通過黏膜進入組織細胞，不局限於靜脈注射，可以用於口服或鼻黏膜給藥。理論上，細胞穿膜肽可以攜帶的貨物種類非常多，包括：小分子蛋白，多肽，質粒，核酸，寡聚核苷酸，脂質體及納米顆粒物等。
在將胞內抗體導入細胞的技術中，至今尚未成功地採用穿膜肽將抗體導入細胞內，同時還能保持抗體的生物學功能。因此，研究穿膜肽介導的胞內抗體導入細胞技術具有重要意義和應用價值，也將為針對胞內靶標的治療性抗體研究提供了新的思路。
技術實現要素：
本發明提供一種將抗體導入細胞內的方法，使用穿膜肽能夠成功地將融合表達的抗體導入細胞內，並且保持抗體的生物學活性不受影響，該抗體能夠用於抗體藥物的製備中。
根據本發明的第一方面，本發明提供一種將抗體導入細胞內的方法，通過將穿膜肽與抗體融合表達，上述抗體能夠穿透細胞膜進入細胞內與靶分子結合，上述抗體保持對抗原的特異性結合功能。
進一步地，上述抗體包括完整抗體以及抗體片段。
進一步地，上述穿膜肽與上述抗體的重鏈c端連接。
進一步地，上述穿膜肽與上述抗體直接連接或通過連接序列介導連接。
進一步地，上述穿膜肽的序列選自seqidno：5-17中任意一種。
進一步地，上述穿膜肽是來源於hiv-ⅰ的轉錄活化因子tat(48-60)，上述抗體是針對hbx蛋白的單克隆抗體，並且上述穿膜肽與上述抗體的重鏈連接後形成的胺基酸序列是seqidno：1，上述抗體的輕鏈的胺基酸序列是seqidno：2。
根據本發明的第二方面，本發明提供一種第一方面的方法中得到的穿膜肽與抗體融合表達產物在製備抗體藥物中的用途。
進一步地，上述抗體藥物是用於治療和/或預防腫瘤的抗腫瘤藥物。
根據本發明的第三方面，本發明提供一種將抗體藥物偶聯物導入細胞內的方法，通過將穿膜肽與抗體融合表達，上述抗體能夠穿透細胞膜進入細胞內與靶分子結合，上述抗體保持對抗原的特異性結合功能，並且上述抗體上偶聯有藥物分子。
進一步地，上述偶聯的藥物是細胞毒性藥物或放射性核素。
進一步地，上述偶聯的藥物是抗腫瘤藥物。
進一步地，上述穿膜肽是來源於hiv-ⅰ的轉錄活化因子tat(48-60)，上述抗體是針對hbx蛋白的單克隆抗體，並且上述穿膜肽與所述抗體的重鏈連接後形成的胺基酸序列是seqidno：1，上述抗體的輕鏈的胺基酸序列是seqidno：2。
進一步地，上述偶聯的藥物分子是甲基澳瑞他汀e(monomethylauristatine，mmae)。
根據本發明的第四方面，本發明提供一種第三方面的方法中得到的穿膜肽與抗體融合表達並且偶聯有藥物分子的產物在製備抗體藥物中的用途。
進一步地，上述抗體藥物是用於治療和/或預防腫瘤的抗腫瘤藥物。
本發明的將抗體導入細胞內的方法，通過將穿膜肽與抗體融合表達，能夠成功地將抗體導入細胞內，並且保持抗體的生物學活性不受影響，該抗體能夠用於抗體藥物的製備中。
附圖說明
圖1為本發明一個實施例中在6d12抗體不同末端融合表達tat後對hbx的反應動力學曲線；其中，對照表示未融合表達tat的6d12抗體，c:h-tat表示融合於重鏈c端，c:l-tat表示融合於輕鏈c端，n:h-tat表示融合於重鏈n端，n:l-tat表示融合於輕鏈n端；
圖2為本發明一個實施例中將tat融合表達於抗體fc末端的模式圖；
圖3為本發明一個實施例中重組表達的tat-6d12進入細胞的實驗結果圖，採用免疫螢光用共聚焦顯微鏡；
圖4為本發明一個實施例中幾種胞吞抑制劑可以阻斷tat-6d12可以進入細胞的實驗結果圖，採用免疫螢光用共聚焦顯微鏡；
圖5為本發明一個實施例中細胞內tat-6d12對hbx的反應活性的實驗結果圖；
圖6為本發明一個實施例中tat-6d12與hbx在細胞內的共定位的實驗結果圖，採用雷射共聚焦顯微鏡；
圖7為本發明一個實施例中進入細胞內的tat-6d12可以降解其靶標hbx的實驗結果圖；
圖8為本發明一個實施例中tat-6d12與trim21在細胞內共定位的實驗結果圖，採用雷射共聚焦顯微鏡；
圖9為本發明一個實施例中突變後的tat-6d12不能降解細胞內hbx的實驗結果圖；
圖10為本發明一個實施例中穿膜肽與adc融合表達tat-3g11-mmae治療組與對照組3g11-mmae相比的實驗結果圖，治療組顯著減小腫瘤的體積，提高其抗腫瘤療效。
具體實施方式
下面通過具體實施方式結合附圖對本發明作進一步詳細說明。
本發明首次成功地將穿膜肽與抗體融合表達在一起，形成能夠穿透細胞膜並在細胞內發揮抗體活性作用的融合抗體。本發明通過具體實驗證實了穿膜肽能夠將與其融合的抗體導入細胞。基於各種穿膜肽的一般共性和各種抗體的一般共性，能夠知道本發明的穿膜肽與抗體形成融合抗體並具有穿膜功能和抗體活性作用的技術方案，廣泛地適用於各種穿膜肽和抗體。
合適的穿膜肽按照其來源特徵包括但不限於：來源於天然蛋白中的穿膜肽，如tat、pvec和penetratin等；模式(model)穿膜肽，它們是模擬穿膜肽的結構通過人工合成的兩親性α螺旋結構，如map和(arg)7等；完全人工設計合成的穿膜肽，如transportan和mpg等，它們通常是嵌合多肽、兩性分子。可用於本發明中的一些典型的穿膜肽及其來源和功能性肽序列如表1所示。
表1細胞穿膜肽的種類
可用於本發明的合適的抗體指完整抗體以及抗體片段如fab片段，單鏈抗體(single-chainfv,scfv)，雙特異性單克隆抗體(bispecificmonoclonalantibodies,bsab)，二硫鍵穩定抗體(disulfied-stablizedfv,dsfv)，單域抗體(singledomainantibody,sdab)。抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，優選單克隆抗體，本發明中的抗體是重組表達的抗體，優選重組表達的抗體作為單克隆抗體。重組表達的抗體能夠通過重組表達的方式與穿膜肽融合在一起直接形成融合抗體。
本發明發現，在穿膜肽與抗體融合表達時，穿膜肽與抗體的重鏈c端連接比與抗體的其它部位(例如重鏈n端、輕鏈c端和輕鏈n端等)連接能夠更好地保持抗體活性作用不受影響。因此，優選穿膜肽與抗體的重鏈c端連接。
穿膜肽與抗體之間的連接可以是直接連接，也可以是通過連接序列(linker)介導連接。典型但非限定性的連接序列比如(gggs)4。在不影響抗體活性作用的前提下，優選穿膜肽與抗體之間直接連接。在某些情況下，穿膜肽與抗體之間直接連接會影響抗體活性作用，而通過連接序列連接能夠消除這種影響，在這樣的情況下，穿膜肽與抗體之間最好通過連接序列。具體地，可以根據具體的抗體特性和採用的穿膜肽的類型和特性選擇連接方式。
在本發明的一個實施例中，穿膜肽是來源於hiv-ⅰ的轉錄活化因子tat(48-60)，抗體是針對hbx蛋白的單克隆抗體，其是通過重組表達獲得的抗體。tat(48-60)與針對hbx蛋白的單克隆抗體通過重組表達方式形成融合抗體，二者直接連接在一起，並且優選地將tat(48-60)連接在針對hbx蛋白的單克隆抗體的重鏈c端。在該優選實施例中，穿膜肽與抗體的重鏈c端連接後形成的胺基酸序列是seqidno：1(參見序列表)，抗體的輕鏈的胺基酸序列是seqidno：2(參見序列表)。
本發明的融合抗體可以直接作為抗體藥物使用，也可以用於藥物的製備中。這種抗體藥物帶有穿膜肽，因此能夠穿透細胞膜進入細胞內，抗體能夠靶向細胞內的靶標，提高治療的靶向性和療效。這種抗體藥物優選是用於治療和/或預防腫瘤的抗腫瘤藥物。由於腫瘤治療中存在靶向性不足和對正常組織造成負面性殺傷問題，而本發明的融合抗體能夠穿透細胞膜進入腫瘤細胞內，克服了抗體藥物難以進入細胞內的難題，從而對於細胞內靶標分子引起的腫瘤具有明顯的療效。
在進一步研究中，本發明的融合抗體可以與目前的抗體藥物偶聯物(antibodydrugconjugate,adc)結合在一起，形成帶有穿膜肽的抗體藥物偶聯物，該抗體藥物偶聯物包括融合抗體和偶聯的藥物，其中融合抗體包括融合在一起的穿膜肽和抗體，並且融合抗體能夠穿透細胞膜進入細胞內與靶分子結合。一方面，抗體能夠發揮對靶標分子的特異性結合作用，進而清除靶標分子或清除其影響；另一方面，偶聯的藥物也能靶向性地發揮其治療作用，提高靶向性和療效。偶聯的藥物可以是細胞毒性藥物或放射性核素等，其可以是用於治療和/或預防腫瘤的抗腫瘤藥物。
在本發明的一個實施例中，所形成的帶有穿膜肽的抗體藥物偶聯物，包括來源於hiv-ⅰ的轉錄活化因子tat(48-60)作為穿膜肽，針對hbx蛋白的單克隆抗體作為抗體，甲基澳瑞他汀e(monomethylauristatine，mmae)作為偶聯的藥物分子。其中，穿膜肽和抗體通過重組表達方式以直接連接的形式形成融合抗體，而偶聯的藥物與融合抗體通過化學偶聯的方式偶聯在一起，優選在活化後通過edc(1-ethyl-3-(3a-dimethylaminopropyl)-carbodiimidehydrochloride)偶聯在一起。
本發明的融合抗體包括融合在一起的穿膜肽和抗體，能夠成功地導入細胞內，並且保持抗體的生物學活性不受影響，該融合抗體能夠用於抗體藥物的製備中。
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，應當理解的是，實施例僅是示例性的，並不構成對本發明保護範圍的限制。
實施例1：穿膜肽tat(48-60)與抗hbx蛋白的抗體形成融合抗體tat-6d12
本實施例採用融合表達的方法，分別將tat(48-60)(具體的胺基酸序列是：grkkrrqrrrppq)添加到已經構建好的重組表達6d12抗體的重鏈c端(c:h-tat)、輕鏈c端(c:l-tat)、重鏈n端(n:h-tat)或輕鏈n端(n:l-tat)四種方式。
首先評價改造後的抗體對hbx的反應活性是否發生變化。用不同濃度重組hbx蛋白包板，以間接化學發光免疫檢測精細評估各融合抗體的反應動力學曲線，圖1所示的結果顯示，將tat(48-60)加在重鏈或者輕鏈的n端都導致抗體對hbx蛋白反應性的完全消失，而加在輕鏈的c端，雖然保留了與hbx蛋白的反應性，但與未改造的抗體相比反應活性下降了近兩個數量級，只有將tat(48-60)融合表達於抗體的重鏈c端(c:h-tat)，即抗體的fc端，不影響6d12對hbx的反應活性。將tat融合表達於抗體的fc端的模式圖如圖2所示。
實施例2：融合表達的tat-6d12抗體的穿膜效果
將在6d12fc末端融合tat(48-60)構建的重組質粒轉染cho細胞進行表達，並用proteina親和層析純化分泌到培養基上清的抗體，進而開展生物學功能分析。將重組表達的tat-6d12和未改造的6d12分別添加到huh7的細胞培養基中，終濃度為0.3mg/ml，孵育12h，然後做免疫螢光用共聚焦顯微鏡分析tat-6d12能否進入細胞內。結果如圖3所示，重組表達的tat-6d12可以顯著地進入huh7細胞內(註：螢光原來為綠色，轉化後為灰白色)，進入效率接近100％，非常高效，並且呈彌散狀分布，提示抗體在細胞質中分布。進而在不同種屬及組織來源的細胞系如，人肝癌細胞系hepg2、鼠肝癌細胞系hepa1-6、人胚腎細胞系hek-293、人肺癌細胞系a549等研究發現，tat-6d12都可以有效的穿越細胞膜進入到細胞內(結果未示出)。提示重組表達的tat-6d12可以非特異性的高效進入細胞內。
實施例3：融合表達的抗體tat-6d12的穿膜機制研究
tat介導的穿膜機制目前還沒有徹底研究清楚，最新的研究結果表明，胞吞作用(endocytosis)在其內化過程中佔有重要地位，普遍認為tat接到的大分子轉運依賴於胞吞作用。因此，採用幾種常用的胞吞抑制劑進行研究，研究能否阻斷tat-6d12進入細胞內部。這幾種常用的胞吞抑制劑的作用機制如表2所示。首先將這些抑制劑分別加入到huh7細胞培養基中，然後將終濃度為0.3mg/mltat-6d12添加到細胞培養基中，孵育12h，然後做免疫螢光用共聚焦顯微鏡分析tat-6d12進入細胞的過程是否被阻斷。結果如圖4所示，非律平(filipin)、細胞鬆弛素d(cytochalasind，cytod)、氯喹(chloroquine，chlo)這三種抑制劑能夠顯著阻斷tat-6d12進入細胞內，甲基-β-環糊精(methyl-β-cyclodextrin，mβcd)對tat-6d12的內化過程也有一定程度的抑制作用。綜上所述，tat-6d12穿越細胞膜進入到細胞內部是一個依賴胞吞的過程，並且，網格蛋白介導的內吞(cme,clathrin-mediatedendocytosis)、網格蛋白獨立的內吞(cie,clathrin-independentendocytosis)、巨胞飲(macropinocytosis)以及脂筏(lipidraft)四種模式都可能參與了tat介導的抗體入胞過程。
表2幾種常用胞吞抑制劑及作用模式
(ccvs，clathrin-coatedvesicles,網格蛋白包被的囊泡)
實施例4：進入細胞內的tat-6d12仍具有對hbx的反應活性
為了研究內化到細胞中的tat-6d12是否還具有對hbx的反應活性，將終濃度0.3mg/ml的tat-6d12分別孵育huh7細胞0.5h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，然後用pbs洗滌5遍，並用非變性裂解液ddm裂解細胞，並將細胞裂解液添加到hbx包被的elisa板，檢測其對hbx的親和力。圖5所示的結果顯示，進入細胞內的tat-6d12對hbx仍具有良好的反應活性(註：螢光原來為綠色，轉化後為灰白色)，提示tat-6d12在細胞內仍能夠保持其活性。
實施例5：進入細胞內的tat-6d12可以識別其靶標hbx
為了研究內化到細胞中的tat-6d12是否能夠識別細胞內的hbx蛋白，通過免疫螢光的方法，研究二者在細胞內是否共定位。如圖6所示，綠色螢光代表hbx蛋白(註：右上圖，螢光原來是綠色，轉化後成灰白色)，紅色螢光代表tat-6d12(註：左下圖，螢光原來是紅色，轉化後成灰白色)，通過雷射共聚焦顯微鏡拍攝，然後將圖片合併在一起，結果顯示綠色螢光與紅色螢光重疊在一起(註：右下圖，螢光原來是綠色和紅色，轉化後成灰白色)，表明細胞內的tat-6d12與hbx蛋白形成複合物，進入細胞內的tat-6d12可以識別其靶標hbx。
實施例6：進入細胞內的tat-6d12可以降解其靶標hbx
通過蛋白印跡(westernblot)檢測進去到細胞內的tat-6d12是否降解其靶標hbx，內參蛋白為微管蛋白(tublin)，用於表示所使用蛋白總量一致。圖7所示的結果顯示，tat-6d12處理組中的hbx量顯著少於6d12處理組及對照抗體處理組，表明進入細胞內的tat-6d12可以降解其靶標hbx。
實施例7：進入細胞內的tat-6d12與trim21相互作用
最新的研究表明，當腺病毒感染細胞後，吸附在腺病毒表面上的抗體也隨之被一起帶入細胞內，並可以與細胞質中的抗體fc受體——trim21結合，激發起細胞內免疫反應以消滅病毒。作為一種存在於細胞內部的fc受體，trim21與igg的結合力比目前已知的所有fc受體都要強。trim21識別吸附在病毒表面的抗體分子，然後通過其e3泛素化配體的功能催化k48和kk63泛素化鏈的形成。催化形成的k48能夠通過aaaatpasevcp和蛋白酶體(proteasome)降解系統，將病毒顆粒在幾小時內快速消滅。同時，trim21催化形成的k63鏈能夠激活下遊的固有免疫信號通路，例如nfκb、ap-1和irf3/5/7，這導致細胞因子和趨化因子等抗病毒分子的大量表達，上調nkg2d配體和mhcⅱ類分子，使細胞處於抗病毒狀態。猜測通過基因改造過的在細胞內發揮作用的tat-6d12抗體，其作用機制很可能是通過類似的途徑，因此，對這一猜測進行驗證。trim21是目前唯一被報導的細胞質中的抗體fc受體，通過改造過的可以進入細胞內的抗體很可能是通過這個fc受體發揮作用。為了研究trim21與進入細胞內的tat-6d12之間是否存在相互作用，通過免疫螢光的檢測方法，用共聚焦顯微鏡觀察他們在細胞內是否共定位。圖8所示的結果表明，代表tat-6d12的綠色信號(註：左上圖，螢光信號原來為綠色，轉化後為灰白色)與代表trim21的紅色信號(註：右上圖，螢光信號原來為紅色，轉化後為灰白色)重疊在一起，顯示tat-6d12和trim21之間存在相互作用，形成複合物。
實施例8：突變後的tat-6d12抗體不能降解細胞內hbx蛋白
為了進一步確認抗體在細胞內發揮作用是依賴trim21分子的模式，首先構建了ch3缺失的tat-6d12克隆(tat-6d12-ch3-)，然後表達純化，結果顯示tat-6d12-ch3-與hbx的結合活性沒有發生顯著的改變，表明抗體的fc端ch3區域在介導細胞內免疫起著重要的作用。
為了進一步評價tat-6d12在細胞內發揮作用依賴於與trim21的相互作用，通過將其與抗體結合的熱點(hot-spots)做點突變，為h433a、n434a、h435a，更深入的研究trim21在抗體介導的細胞內免疫所起的作用。圖9所示的結果顯示，突變後的tat-6d12由於不能與trim21形成複合物，因此不能降解細胞內的hbx蛋白。
實施例9：穿膜肽提高adc的治療效果
近幾年發展起來的抗體藥物偶聯物(antibodydrugconjugate,adc)，即將細胞毒性藥物或放射性核素與抗體偶聯並帶入至靶細胞，從而實現對腫瘤細胞的高效特異的殺傷，是新一代抗體技術臨床應用的發展方向。雖然adc獲得了巨大的成功，引起了廣泛的關注，但是adc開發技術要求高，工藝複雜，其中adc被靶細胞吞噬的效率低是目前臨床應用的瓶頸問題，數據顯示僅有極少數的adc分子可以進入腫瘤細胞，吞噬的效率的提高對於抗腫瘤療效的提升至關重要。
本研究發現，將穿膜肽與抗體融合表達可以顯著的提高抗體的內化效率，該技術可應用於adc藥物的開發，提高內化效率及對腫瘤的殺傷能力。本研究的數據顯示，穿膜肽不具有靶向性，然而將針對hbs的抗體(3g11)與穿膜肽(tat)融合表達後，一方面可以將抗體導入細胞，另一方面提高了穿膜肽的靶向性，即tat-3g11在hbv陽性的肝癌細胞(hepa1-6-n10)進入效率更高。由於抗體進入細胞後沒有顯著的細胞毒性，為了提高對肝癌細胞的殺傷力，將前期研究過的小分子毒素mmae(monomethylauristaine)與tat-3g11偶聯在一起，即tat-3g11-mmae。其中，tat與3g11抗體的重鏈c端融合後形成的胺基酸序列是seqidno：3(參見序列表)，3g11抗體的輕鏈的胺基酸序列是seqidno：4(參見序列表)。
體外的細胞測定表明tat-3g11-mmae對hbv陽性的肝癌細胞(hepa1-6-n10)具有更顯著的細胞毒性，隨後的動物實驗(圖10)也證實了該偶聯物對由hepa1-6-n10所形成的腫瘤具有顯著的治療作用。以上實驗結果表明穿膜肽與adc融合表達可以提高其在靶細胞的內化效率，提高其抗腫瘤療效。對於adc藥物的開發策略具有重要的指導意義。
以上內容是結合具體的實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬於本發明的保護範圍。
sequencelisting
張軍方
一種將抗體導入細胞內的方法
16p22628
17
patentinversion3.3
1
456
prt
人工序列
1
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map
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