杜仲丸在製備治療骨質疏鬆藥物中的應用的製作方法

2023-09-16 18:12:05 3

專利名稱：杜仲丸在製備治療骨質疏鬆藥物中的應用的製作方法
杜仲丸在製備治療骨質疏鬆藥物中的應用技術領域
本發明屬於中藥領域，具體涉及杜仲丸在製備治療骨質疏鬆藥物中的應用。
背景技術：
杜仲丸，又名千金保孕丸一《古今醫統》卷八十五、杜續丸一《醫學入門》卷八。由鹽炙杜仲和鹽炙續斷(或者生品杜仲和生品續斷)按照I:I的比例關係組成。炮製方法如下 ①鹽炙杜仲取杜仲絲片，O. 5倍於藥材重量的2%的鹽水，拌勻，悶潤2h，置於鐵鍋中，文火加熱，鍋底溫度控制在200左右(紅外測溫儀，熱輻射係數O. 7)，20min藥材基本至幹，然後溫度提高至370，炒炙lOmin，出鍋，攤涼。②鹽炙續斷取續斷飲片生品，放入密封袋中，加入適量濃度為O. lg/ml的鹽溶液，在密封袋中充分搖勻，待密封袋內無明顯液滴時，取出， 置170°C (紅外測溫儀測定)熱鍋中翻炒15min，取出，晾涼，裝入密封袋中，標號，密封，即得續斷鹽炙品樣品。
作為常用的中藥，杜仲丸被用於婦女保孕，但其醫藥用途並沒有得到充分的發掘和應用。發明內容
本發明的目的在於公開杜仲丸在製備治療骨質疏鬆藥物中的應用。以滿足臨床應用的需要。
本發明的目的可以通過以下技術方案實現
杜仲丸在製備治療骨質疏鬆藥物中的應用，所述的杜仲丸為杜仲和續斷按照I :1 的重量比例關係混合提取的提取物。所述的杜仲為鹽炙杜仲或生品杜仲，所述的續斷為鹽炙續斷或生品續斷。
上述的應用，其在於所述的藥物包括治療有效量的杜仲丸和醫藥學上可接受的載體。
所述的藥物優選為丸劑、散劑、膠囊、片劑、顆粒劑、注射劑、複方製劑或其他口服劑型。
杜仲丸在製備治療骨質疏鬆藥物中的應用效果顯著，尤其是由性激素水平下降導致的骨質疏鬆。
本發明所述的杜仲丸優選為鹽炙杜仲和鹽炙續斷(或者生品杜仲和生品續斷)按照1:1的重量比例關係混合提取的醇提取物。服用劑量可根據服用方式、病人年齡、病情嚴重程度等因素而改變，成人口服劑量為20-60g (生藥)/日。
本發明的有益效果
試驗證明，杜仲丸能顯著抑制由於大鼠去卵巢造模引起的大鼠血清中鹼性磷酸酶、羥脯氨酸的含量；可以顯著提高骨密度、骨重係數、骨鈣和骨磷，具有顯著性治療骨質疏鬆的活性，在製備治療骨質疏鬆的藥物中具有很好的應用前景。
具體實施方式
I.實驗材料
I. I主要儀器
TDL80-2B型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；CSS_4420電子萬能材料實驗機 (長春機械研究所)discovery W型雙能X射線骨密度掃描儀(美國Hologic) ;TB_25型十萬分之一電子天平(DENVER，北京丹佛儀器有限公司)；DG5033A型酶聯免疫檢測儀(華東電子管廠)；BS-124S型電子天平(Sartorius，北京賽多利斯科技有限公司)；TGL_20M冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；高溫電爐、電晶體式自動恆溫控制臺(江蘇省東臺縣電器廠)。
I. 2主要藥品與試劑盒
仙靈骨葆膠囊(批號111043，貴州同濟堂製藥有限公司)；羧甲基纖維素鈉 (CMC-Na，天津市科密歐化學試劑開發中心，批號20070429);水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號=30037517);注射用青黴素鈉(批號:B111106，80萬單位/支，山東魯抗醫藥股份有限公司)；碘伏(武漢市聯華衛生消毒用品廠)；杜仲、續斷(先聲再康江蘇藥業有限公司)；17 β -雌二醇(湖北大仝生物化工科技有限公司)。
血清鹼性磷酸酶(ALP)試劑盒、血清羥脯氨酸(HOP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。
I. 3實驗動物
雌性，280±20g，64隻，清潔級SD大鼠(南通大學實驗動物中心)，實驗動物生產許可證號:SCXK (蘇)2008-0010。
I. 4試劑配製
O. 5%CMC-Na :稱取15g CMC-Na,加入3000mL蒸餾水，混合均勻，使其充分溶脹，放置過夜，攪拌均勻，即得。
3%水合氯醛精密稱取水合氯醛15g，加入500mL蒸餾水，使其充分溶解，即得到 3%水合氯醛麻醉液，在使用前現用現配。
75%乙醇溶液移取95%乙醇789. 5mL,加入210. 5mL蒸餾水，混合均勻，即得到 IOOOmL的75%乙醇溶液。
O. 9%生理鹽水溶液稱取4. 5g NaCl，加入500mL蒸餾水，混合均勻，使其充分溶解，即得。
10%的中性甲醛溶液移取37% 40%甲醛溶液IOOmL,加入900mL的PBS緩衝溶液， 混合均勻，即得到IOOOmL的10%中性甲醛溶液。
仙靈骨葆膠囊混懸液取仙靈骨葆膠囊內容物，用研缽研碎，精密稱取5. 0g，置於 IOOmL容量瓶中，加入0. 5%CMC-Na溶液定容至刻度，超聲使其形成混懸液。仙靈骨葆大鼠給藥體積為10mL/kg · Cf1 ;給藥量為O. 50g/kg[1]。
17 β-雌二醇混懸液精密稱取17 β-雌二醇I. 5mg，置於250mL容量瓶中，加入0.5%CMC-Na溶液定容至刻度，超聲使其形成混懸液。17 β -雌二醇給藥體積為10mL/kg -d^1 大鼠，給藥劑量為eoyg/kg 。
杜仲丸樣品的製備方法
杜仲丸(鹽炙品)精密稱取同批次的杜仲炮製品(鹽炙杜仲，剪成2mm以下碎片)及續斷炮製品粗粉(鹽炙續斷，粉碎，過2號篩)各250g (共500g)，置5L圓底燒瓶中，加入 5L 60%乙醇，浸泡lh，分別以5L、4L、4L的60%乙醇，各水浴回流提取一次，提取時間分別為I.5h、lh、0. 5h，合併三次濾液，減壓回收乙醇部位至無醇味，經脫脂處理後的藥液置於真空減壓乾燥箱中(-0. 08MPa，60°C )，乾燥，研細得提取物，得率為30. 53%，備用。
杜仲丸(生品)採用生品杜仲和生品續斷按照與杜仲丸(鹽炙品)相同的方法製備提取物，得率為25. 50%,備用。
杜仲丸(鹽炙品)低劑量組藥液杜仲丸(鹽炙品)提取物適量，用O. 5%CMC-Na溶解製成O. 061g/mL的混懸液。給藥體積為O. 01mL/g大鼠；高劑量組給藥劑量為O. 61g/kg(2g 生藥/kg)大鼠。
杜仲丸(鹽炙品)高劑量組藥液杜仲丸(鹽炙品)提取物適量，用O. 5%CMC_Na溶解製成O. 183g/mL的混懸液。給藥體積為O. 01mL/g大鼠；高劑量組給藥劑量為I. 83g/kg(6g 生藥/kg)大鼠。
杜仲丸(生品)低劑量組藥液杜仲丸(生品)提取物適量，用O. 5%CMC-Na溶解製成 O. 051g/mL的混懸液。給藥體積為O. 01mL/g大鼠；高劑量組給藥劑量為O. 51g/kg (2g生藥/kg)大鼠。
杜仲丸(生品)高劑量組藥液杜仲丸(生品)提取物適量，用O. 5%CMC-Na溶解製成 O. 153g/mL的混懸液。給藥體積為O. 01mL/g大鼠；高劑量組給藥劑量為I. 53g/kg (6g生藥/kg)大鼠。
2.實驗目的
通過採用大鼠去卵巢的骨質疏鬆模型，以大鼠血清中羥脯氨酸(HOP)、血清中鹼性磷酸酶含量；股骨骨密度；股骨骨灰重係數；骨鈣和骨磷含量作為考察指標，證明杜仲丸治療去卵巢大鼠骨質疏鬆的在體藥理活性。
3.實驗方法
3. I動物模型的製備
取體重280土20g的6月齡清潔級雌性SD大鼠64隻M。隨機分組，禁食24小時 (不禁水)後，其中8隻在相應部位只作手術切口，不摘除卵巢作為正常對照組(假手術對照組)；40隻按文獻法M進行卵巢摘除術，大鼠用3%水合氯醛麻醉(3g水合氯醛/IOOmL,給藥劑量IOOg動物/mL，腹腔注射)，背位固定，於距最末肋骨下約Icm和脊柱外測約2cm處， 剪毛，然後切開約I. 5-2cm皮膚和背肌，切口視野中可見一團白色發亮的脂肪，卵巢即包埋在其中，用小鑷子輕夾住脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到粉紅色菜花狀的卵巢， 將其餘子宮連接處用4號手術縫合線結紮後，再摘除卵巢，同法摘除另一側卵巢，術後順勢將子宮送回原位，皮膚切口處給予少許青黴素粉劑，縫合切口。
各組大鼠術後分籠飼養,大鼠術後活動正常,可自行飲水攝食,術後大鼠傷口癒合正常，沒有紅腫、滲出、化膿等現象。各組大鼠再分籠飼養，術後每日腹腔注射青黴素注射液 (生理鹽水配製，10萬單位/mL，給藥體積0. 5mL/100g, 80萬單位/瓶)，連續3天。手術2 周后開始給藥，連續給藥12周。
3. 2動物分組及給藥
將去卵巢大鼠分別按體重隨機分為8組假手術組、模型對照組(OVX)、兩組陽性對照組、杜仲丸(鹽炙品)的高劑量組和低劑量組、杜仲丸(生品)的高劑量組和低劑量組。假手術對照組(SHAM)和模型對照組(OVX)，給予蒸餾水；兩組陽性對照組，分別給予仙靈骨德膠囊O. 5g/kg(中陽)和17 β -雌二醇60 μ g/kg(西陽)；杜仲丸(鹽炎品)的高、低劑量組分別為0.61g/kg(DZW低)、和1.83g/kg(DZW高);杜仲丸(生品)的高、低劑量組分別為 O. 51g/kg(DZW 低)、和 I. 53g/kg(DZff 高)。
灌胃給藥，給藥體積為O. 01mL/g大鼠，每周給藥6次(周日休息一天)，均於每天晚上18:00-20:00左右給藥，連續給藥12周，於給藥過程中，每周稱一次體重，根據體重調整給藥量。
3. 3樣品採集
末次給藥後禁食24小時(不禁水)後，先對大鼠進行稱重，然後3%水合氯醛麻醉 (3g水合氯醛/IOOmL,給藥劑量IOOg動物/mL，腹腔注射)，大鼠頸總動脈插管取血，至IOmL 的離心管中並處死大鼠。
血液室溫靜置15min，3500rpm離心IOmin後，分離血清及血漿，血清標號後，_20°C 保存，用於各指標含量測定。
總動脈插管取血後處死大鼠，分離雙側股骨，取右側股骨測定以下指標①將標本用10%的中性甲醛溶液固定，用雙能X射線骨密度測定儀測定股骨骨密度再將測完骨密度之後的右側股骨幹燥並碳化後置於800°c馬福爐中灰化製成骨灰，測定骨灰重係數(mg/ g體重)；⑦稱取一定量骨灰，用血清磷測定試劑盒測定骨磷；另取一定量的骨灰用鈣試劑盒測定骨鈣含量，將所測結果折算成每克骨重所含骨鈣或骨磷的量。
3. 4實驗各項指標測定及實驗結果
3. 4. I血清各不同指標測定
3. 4. I. I羥脯氨酸(HOP)的含量測定
(I)基本原理
羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產生的氧化產物與二甲氨基苯甲醛作用呈現紫紅色，根據其呈色的深淺可推算出其含量。
(2)測定方法
按試劑盒要求測定。在550nm處，測各孔的吸光度OD值。
(3)樣品中HOP濃度的測定結果
羥脯氨酸含量(μ g/mL)=(測定管吸光度_空白管吸光度)/ (標準管吸光度_空白管吸光度)X標準管含量(5 μ g/mL) X水解液總體積(mL) /取樣量(mL)
實驗結果見下表I所示。
3. 4. I. 2血清中鹼性磷酸酶(ALP)的含量測定
(I)原理
鹼性磷酸酶分解磷酸苯二鈉，產生游離酚和磷酸，酚在鹼性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據紅色深淺可以測定酶活力的高低。
(2)測定方法
按試劑盒要求測定。在450nm處，測各孔的吸光度OD值。
(3)樣品中鹼性磷酸酶的測定結果
鹼性磷酸酶(金氏單位/IOOmL)=(測定管吸光度-空白管吸光度)/ (標準管吸光度-空白管吸光度)X酚標準品濃度(0. lmg/mL) X IOOmLX樣本測定前稀釋倍數。
實驗結果如下表2所示。
3. 4. 2股骨相關參數的測定
3. 4. 2. I股骨骨灰重係數測定
大鼠右側股骨在進行骨密度測定和Micro-CT檢測後，先置坩鍋內於120°C幹烤 2h，取出，置乾燥器中保存，放置過夜。隔日，將烤乾的股骨盛於坩鍋內，置箱式電阻爐(馬弗爐)中，分別在250°C，400°C，600°C各加熱O. 5h，最後於800°C灰化lh，取出，置乾燥器冷卻O. 5h,對骨灰稱重,實驗結果見下表3。
電子天平稱量，骨灰重係數=股灰重(g) X 1000/大鼠體重(g)。
3. 4. 2. 2 骨鈣測定
(I)原理
尿液中鈣離子在鹼性溶液中與甲基百裡香酚藍(MTB)結合，生成藍色絡合物。通過比色與同樣處理的鈣標準進行比較，可計算出鈣的含量。
(2)測定方法
按試劑盒要求測定。
(3)樣品中骨鈣的測定結果
實驗結果如下表4所示。骨灰中鈣的含量(mmol/g)=(測定孔吸光度一空白孔吸光度)+ (標準孔吸光度一空白孔吸光度)X標準品濃度(lmmol/L)-待測樣本的重量 (O. Ig)。
3. 4. 2. 3 骨磷測定
(I)原理
樣品中的無機磷與鑰酸作用生成磷鑰酸，後者被還原成鑰藍，在660nm處有最大吸收峰，通過比色法可以計算出無機磷的含量。
(2)測定方法
按試劑盒要求測定。
(3)樣品中骨磷的測定結果
實驗結果如下表5所示。磷含量(mm0l/g) = (測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)X標準管濃度(O. 5mmol/L) X測試前稀釋倍數(5)-骨灰濃度(O. I g/mL)。
3. 4. 3股骨骨密度的測定
分離出大鼠右側股骨後，股骨標本經10%甲醛溶液固定，用雙能X射線骨密度測定儀測定股骨的骨密度。股骨骨密度測定結果如下表6。
3. 5統計學處理
實驗數據均採用均數土標準差(SD)來表示，組間差異顯著性用t-test比較， p〈0. 05為有顯著性差異。不同亞組之間採用SPSS 15. O統計軟體進行數據處理。
4.實驗結果及結論
4. I實驗結果
實驗結果，詳見1-6。
表I大鼠去卵巢的骨質疏鬆模型實驗中杜仲丸對羥脯氨酸含量的影響
權利要求
1.杜仲丸在製備治療骨質疏鬆藥物中的應用，所述的杜仲丸為杜仲和續斷按照1:1的重量比例關係混合提取的提取物。
2.根據權利要求I所述的應用，其特徵在於所述的藥物包括治療有效量的杜仲丸和醫藥學上可接受的載體。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述的藥物為丸劑、散劑、膠囊、片劑、顆粒劑、注射劑、複方製劑或其他口服劑型。
4.根據權利要求I所述的應用，其特徵在於所述的杜仲為鹽炙杜仲或生品杜仲，所述的續斷為鹽炙續斷或生品續斷。
5.根據權利要求1、2、3或4所述的應用，其特徵在於所述的骨質疏鬆為由性激素水平下降導致的骨質疏鬆。
全文摘要
本發明公開了一種杜仲丸在製備治療骨質疏鬆藥物中的應用，所述的杜仲丸為杜仲和續斷按照11的重量比例關係混合提取的提取物。試驗證明，杜仲丸能顯著抑制由於大鼠去卵巢造模引起的大鼠血清中鹼性磷酸酶、羥脯氨酸的含量；可以顯著提高骨密度、骨重係數、骨鈣和骨磷，具有顯著性治療骨質疏鬆的活性，在製備治療骨質疏鬆的藥物中具有很好的應用前景。
文檔編號A61P19/10GK102920769SQ20121045427
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者楊中林 申請人:楊中林