檢測呼吸道合胞病毒的免疫檢測試劑的製作方法

2023-09-18 00:58:00 1

專利名稱：檢測呼吸道合胞病毒的免疫檢測試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及利用雜交瘤技術生產單克隆抗體和相應的免疫檢測試劑及試劑盒。
背景技術：
呼吸道合胞病毒(RSV)是世界範圍內嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原體，可引起嚴重的呼吸道疾病，感染後與其他呼吸道感染有相似的臨床表現和X線胸片特徵，不易鑑另|J。十年來呼吸道合胞病毒肺炎及毛細支氣管炎佔我國嬰幼兒病毒性肺炎第一位，其症狀與副流感病毒肺炎、輕症流感病毒肺炎及輕症腺病毒肺炎臨床上幾乎無法區別。重症流感病毒肺炎及重症腺病毒肺炎則高熱持續，中毒症狀及呼吸道症狀重疊，臨床表現卻遠較合胞病毒肺炎嚴重。合胞病毒肺炎其臨床症狀與一般支氣管肺炎有相似之處，但與輕症腺病毒肺炎亦較難區別，確診需結合病毒檢查結果綜合考慮，所以研究敏感快速的針對RSV病毒的檢測方法，可以使檢驗室出具及時準確的病原檢測報告，使臨床醫師及時明確病因，採取特異性針對性的治療方案，避免濫用抗生素，而且可以便於早期及時診斷後立即加強患者管理，有效預防醫院交叉感染，減少病毒傳播。目前，臨床上RSV的檢測方法很多，常見的有直接免疫螢光法、間接免疫螢光法、橋聯酶標免疫法、普通酶聯免疫法、病毒分離法、PCR法及核酸雜交法等。主要使用的是螢光定量PCR法，該方法主要優點是靈敏度高，特異性好。但是缺點是操作複雜，需特定的儀器設備和操作間，且操作易汙染，造成結果不如免疫方法直接檢抗原可靠。而免疫診斷方法通過特異性直接檢抗原，結果更可靠、特異性好，操作簡便，無需特殊的儀器設備，普通實驗室都可操作，易於基層單位推廣和應用。它的主要缺點是不如螢光定量PCR高。因此研發高質量的單抗並製備相應的成試劑盒，使其擁有螢光定量PCR試劑同樣的靈敏度和特異性，並且兼有上述免疫診斷試劑的優點，完全能滿足臨床對該病毒診斷的需求具有非常重要的實用價值。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測呼吸道合胞病毒(RSV)的檢測試劑，包括抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體1，由保藏編號為CCTCC C2012154的雜交瘤細胞株製備；抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體2，由保藏編號為CCTCC C2012155的雜交瘤細胞株製備。進一步地，上述抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體I為包被抗體；抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體2為生物素標記抗體。進一步地，上述檢測試劑還包括親和素-HRP。本發明的另一個目的是提供包括上述抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體I和抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體2的檢測試劑盒。
進一步地，所述試劑盒還包括親和素-HRP。具體地，所述試劑盒的原理是用保藏編號為CCTCC C2012154的雜交瘤細胞株製備的抗RSV單克隆抗體包被的微孔板和用生物素標記由保藏編號為CCTCC C2012155的雜交瘤細胞株製備抗RSV單克隆抗體，形成雙抗體夾心法檢測RSV病毒的NP抗原，利用親和素酶放大反應，從而高靈敏度和特異性地檢測咽拭子抽提液中的RSV病毒。本發明的又一個目的是提供一種檢測呼吸道合胞病毒的方法，包括將待測樣品與上述的檢測試劑接觸，從而檢測樣品中的呼吸道合胞病毒。進一步地，還提供了使用本發明的檢測試劑盒來檢測樣品中的呼吸道合胞病毒的方法。本發明所述的檢測試劑和方法具有較高的靈敏度和特異性，便於臨床推廣使用，能完全滿足臨床對RSV病毒診斷的需要。生物材料的保藏分泌抗RSV單克隆抗體的雜交瘤細胞命名為KRSV2和KRSV5，於2012年10月25日提交到 CCTCC 保藏，保藏號為=CCTCC C2012154 和 CCTCC C2012155。
具體實施例方式以下實施例有助於進一步了解本發明的優點和特點，不應視為對本發明的限制。所使用的實驗材料和試劑如無特別說明`，均為普通市售。實施例1RSV單克隆抗體的研製和配對篩選1.免疫和篩選用抗原的製備為研製RSV單克隆抗體，從該病毒蛋白組學分析，本發明選擇該病毒相對保守且含量相對較高的NP(核衣殼)蛋白作為診斷的目標蛋白。1.1用大腸桿菌表達RSV的NP蛋白並純化將RSV的NP蛋白基因通過PET30a質粒轉入大腸桿菌表達，產物用HIS柱層析親和純化，用作免疫用抗原。具體方法和過程參見文獻(地區人呼吸道合胞病毒核蛋白基因的序列分析及原核表達，病毒學報，CHINESEJOURNAL OF VIROLOGY 2007.06.vol. 23459-465)。1. 2RSV的培養和分離純化將RSV的LONG株(國際標準株)接種H印_2細胞，將100TCID/0. 2mLRSV接種於已成片的!fep-2細胞試管中33°C旋轉培養，待細胞病變後，收集培養物並濃縮超速離心純化，用作篩選用抗原。具體方法和過程參見文獻(呼吸道合胞病毒檢測方法比較，臨床兒科雜誌，2003年第21卷第I期)。2.雜交瘤細胞株的建立2.1 免疫2.1.1免疫原用上述1.1部分製備的RSV免疫BALB/C小鼠，雌性，6_8周齡(湖北省實驗動物中心)。2.1. 2方法按100微克/每隻的免疫劑量，初免用完全弗氏佐劑，2周後用不完全佐劑100微克/每隻加強一次。加強兩次後，靜脈抗原直接加強。三天後取脾細胞融合。2. 2細胞融合2. 2.1融合用小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0 (P2_X_Ag8 · 6 · 5 · 3)，為Ig非分泌型(武漢生物製品研究所)。
2. 2. 2融合方法取加強免疫後第三天的小鼠，摘眼球放血，拉頸處死，置75%酒精浸泡5分鐘，無菌操作取出脾臟，並用眼科剪刀將其剪成數段，放入盛有不含小牛血清RPMI1640培養基的IOmL圓底塑料管中，用外包塑料王的研磨棒擠壓出脾細胞，靜置數分鐘，取出細胞懸液，並用不含小牛血清RPMI1640培養基混合，離心洗滌兩次，棄上清，計數，配製成細胞懸液。將SP2/0細胞與免疫脾細胞按1: 5比例混合，於4°C、1400rpm離心10分鐘，吸淨上清，加入50% PEG (Sigma P7181)處理，在5分鐘內慢慢加入IOmL不含小牛血清的RPMI1640培養基，在IOOOrpm條件下離心10分鐘，棄上清，加入含20%小牛血清的RPMI1640培養基配製的HAT (Sigma H0262)中，然後接種到96孔接種預先點有飼養層細胞培養板上，於融合後第10-14天挑選有雜交瘤細胞生長的孔，吸取培養上清液進行篩選，並換以HT培養基。2. 3篩選和克隆化2. 3.1篩選採用間接ELISA法，用超離心純化的RSV抗原包被聚苯乙烯板，加入細胞培養上清孵育，洗板加入羊抗鼠酶結合物，洗板顯色。2. 3. 2克隆和再克隆在96孔細胞培養板中進行。取陽性孔細胞計數，用含20%小牛血清的RPMI1640培養基稀釋細胞含量為5個細胞/mL，接種於一塊96孔板中，每孔O. 2mL，第10-14天採用間接檢測，挑選強陽性孔細胞擴大培養後凍存和再克隆，以連續兩次克隆陽性率100%為止。通過以上方法，共篩選出5株能穩定分泌抗RSV核蛋白(NP)的單抗雜交瘤細胞株，分別命名為 KRSV1、KRSV2、KRSV3、KRSV4、KRSV5。3.單克隆抗體的配對和選擇3.1將實施例1所獲 得的5株單抗細胞株製備腹水，分別用Protein-A蛋白親和膠純化，取一部分分別都標記上HRP。3. 2簡易過碘酸鈉法標記HRP 本法是以NaIO 4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然後再與Ig上的氨基相結合，所獲酶標記抗體的產率高，將近70%的HRP和Ig結合，99%的Ig與酶結合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前最常用的方法。(I)稱取5mgHRP溶解於ImL蒸餾水中。(2)於上液中加入O. 2mL新配的O.1M NaIO 4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。(3)將上述溶液裝入透析袋中，對ImM pH4. 4的醋酸鈉緩衝液透析，4°C過夜。(4)加20 μ I O. 2Μ ρΗ9. 5碳酸鹽緩衝液，使以上醛化程RP的pH升高到9. O
9.5，然後立即加入IOmg IgG (抗體，或SPA5mg)在ImL O. OlM碳酸鹽緩衝液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。(5)加O.1mL新配的4mg/mL NaBH 4液，混勻，再置4°C 2小時。(6)將上述液裝入透析袋中，對O. 15M pH7. 4PBS透析，4°C過夜。3. 3將RSV培養物用PBS按1: 100比例的稀釋做陽性標準品，以PBS作為陰性標準品。3. 4 單抗 ELISA 配對實驗將 KRSV1、KRSV2、KRSV3、KRSV4、KRSV5 製備的單克隆抗體，分別以5微克/毫升包被聚苯乙烯板，將以上抗體HRP標記物3微克/毫升，方法為雙抗體夾心法，抗體之間兩兩配對，以陽性標準品和陰性標準品做樣品，測其OD值，見結果如下表I 表I
權利要求
1.一種檢測呼吸道合胞病毒的雙抗體檢測試劑，包括 抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體1，由保藏編號為CCTCC C2012154的雜交瘤細胞株製備; 抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體2，由保藏編號為CCTCC C2012155的雜交瘤細胞株製備。
2.如權利要求1所述的試劑，其中所述抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體I為包被抗體；抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體2為生物素標記抗體。
3.如權利要求2所述的試劑，還進一步包括親和素-HRP。
4.包括權利要求1-3中任一項所述試劑的檢測試劑盒。
5.抗呼吸道合胞病毒的單克隆抗體1，所述單克隆抗體由保藏編號為CCTCCC2012154的雜交瘤細胞株製備。
6.抗呼吸道合胞病毒的單克隆抗體2，所述單克隆抗體由保藏編號為CCTCCC2012155的雜交瘤細胞株製備。
7.—種檢測呼吸道合胞病毒的方法，包括將待測樣品與權利要求1所述的免疫檢測試劑接觸，從而檢測樣品中的呼吸道合胞病毒。
8.—種檢測呼吸道合胞病毒的方法，包括使用權利要求4所述的試劑盒檢測呼吸道合胞病毒的步驟。
9.如要求7所述的方法，其中所述樣品為咽拭子抽提液。
全文摘要
本發明提供一種檢測呼吸道合胞病毒的雙抗體檢測試劑及相應的試劑盒，其中所述試劑包括作為包被抗體的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體、作為生物素標記抗體的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體以及親和素-HRP。本發明還提供了應用所述試劑或試劑盒進行檢測呼吸道合胞病毒的方法，該方法具有較高的靈敏度和特異性，且易於臨床推廣使用。
文檔編號G01N33/577GK103048459SQ20121051611
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月5日 優先權日2012年12月5日
發明者嚴兵 申請人:中國科學院武漢病毒研究所