肌肉生長抑制素基因工程疫苗的製備及其應用的製作方法

2023-05-24 21:04:46 2

專利名稱：肌肉生長抑制素基因工程疫苗的製備及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及畜牧生產新技術和獸用疫苗領域。
背景技術：
促進農業動物的肌肉生長一直是畜牧生產和畜牧研究所追求的目標。促進畜禽的肌肉生長或提高瘦肉率，不僅提高動物飼養的效率，還可以生產優質和健康的肉類，並且大大提高畜牧生產的經濟效益。
目前主要通過常規的育種工作、調節營養素和營養水平來促進肌肉生長和提高畜禽肌肉生長的速度。但到目前為止，畜禽在常規則生產和飼養技術下的肌肉生長性能已經發揮到了極限，利用以上常規方法促進肌肉生長的空間已經越來越小。要進一步促進肌肉的生長，提高畜牧生產效率和生產優質肉品，必須尋找更新的技術方法，調控和促進肌肉的生長。
可以大幅提高肌肉生長性能的方法主要為內分泌調控技術，包括使用①類固醇激素、②β-腎上腺素受體激動劑、③生長激素、④生長激素釋放激素及其製劑和⑤主動免疫生長抑素等。
以上內分泌調控技術中，由於類固醇激素、β-腎上腺素受體激動劑(即β-興奮劑)和生長激素由於其藥殘問題和潛在的對人體生理活動的影響，都被明令禁止使用。而主動免疫生長抑素的技術則因促生長效應僅限於幼齡動物且效果很不穩定，也不能很好地應用於畜牧生產。
目前發現在動物的肌肉生長過程中特別是在肌肉生長的後期，肌肉細胞產生一種名為第8生長分化因子(Growth Differentiation Factor-8，簡稱GDF-8)的內分泌因子，該因子也被稱為肌肉生長抑制素(Myostatin，簡稱MSTN)。肌肉生長抑制素作用於肌肉細胞表面的受體，從而抑制肌肉細胞的肥大或過度生長。本發明創造的任務或要解決的問題，就是在不影響動物的遺傳基礎、營養和飼養要求或條件下，解除或去除動物「肌肉生長抑制素」對肌肉生長的抑制作用，使肌肉細胞或組織在生長後期能夠不受限制繼續生長或肥大，從而大幅度提高肌肉生長速度。
目前美國已經生產出專門結合或中和抑制「肌肉生長抑制素」的特異性抗體，該抗體使「肌肉生長抑制素」不能與肌肉細胞表面的受體結合，解除其對肌細胞生長的抑制作用，從而實現肌肉的「無限制」生長。目前發現對小鼠注射該抗體(稱為「被動免疫」)可以把肌肉組織重量提高20～30％。但該「被動免疫」技術目前僅處於實驗階段，同時「被動免疫」的做法還必需每天注射抗體，在生產上因操作繁瑣和國外受動物福利人士的抗議而無生產應用前景。因此本發明的目的或任務是採用「主動免疫」的途徑，製備「肌肉生長抑制素」的基因工程疫苗並用該疫苗對動物進行免疫，然後利用動物自身的免疫系統長期生產抗「肌肉生長抑制素」的抗體，該抗體完全具有專門結合和抑制「肌肉生長抑制素」的能力，從而也能夠解除「肌肉生長抑制素」對肌細胞生長的抑制作用，實現肌肉的「無限制」生長。

發明內容
本發明的內容包括1)肌肉生長抑制素基因工程疫苗的製備，和2)對動物或畜禽主動免疫肌肉生長抑制素基因工程疫苗促進動物肌肉生長的兩部分。
一.肌肉生長抑制素基因工程疫苗的製備肌肉生長抑制素基因在肌肉細胞中被首先翻譯為一375個胺基酸殘基的激素肽原，該肽原的263-266胺基酸殘基處有一蛋白裂解位點RSRR，在此處將氨基端的親水性分泌信號肽切下後產生具生物活性的羧基端109個胺基酸殘基的肌肉生長抑制素成熟肽。由於肌肉生長抑制素在不同物種之間(包括畜禽)呈高度保守，其基因核苷酸序列在不同物種之間非常相似，所編碼的成熟肽胺基酸殘基序列在豬、雞和鵝都一樣，因此任何這些動物的基因都可以用於製備肌肉生長抑制素的基因工程疫苗。
肌肉生長抑制素基因工程疫苗的製備，①克隆畜禽肌肉生長抑制素編碼基因，②利用畜禽肌肉生長抑制素編碼基因，製備肌肉生長抑制素的重組融合蛋白，③利用該肌肉生長抑制素重組融合蛋白作為免疫原製備肌肉生長抑制素的基因工程疫苗。
克隆畜禽肌肉生長抑制素編碼基因，①利用根據GenBank中所發表的雞肌肉生長抑制素基因序列，設計出該基因的特異性上遊引物P1(序列為5』-ATGCAAAAGCTAGCAGTCTATG-3』)和下遊引物P2(序列為5』-TCATGAGCACCCGCAACGAT-3』)；②利用異硫氰酸胍-氯仿-異丙醇方法從畜禽肌肉組織中提取總RNA作為模板用引物P2反轉錄成第一鏈cDNA；③用該第一鏈cDNA作為模板和引物P1、P2通過PCR反應擴增出雞、豬或鵝的肌肉生長抑制素的編碼cDNA序列。
製備畜禽肌肉生長抑制素重組融合蛋白製備方法之一是利用IPTG誘導大腸桿菌E.coli BL21(DE3)株表達製備重組融合蛋白①根據肌肉生長抑制素成熟肽的cDNA鹼基序列和大腸桿菌表達質粒pRSET A的多克隆位點鹼基序列，合成上遊引物P3(序列為5『-ATTGGATCCGATTTTGGCCTTG ACT-3』，下劃線部分為BamHI限止性酶切位點)和下遊引物P4(序列為5『-AATGAGCTCAATGAGCACCCGCAACGA-3』，下劃線部分為SacI限止性酶切位點)；②利用該對引物、上述反轉錄擴增出的肌肉生長抑制素編碼cDNA序列作為模板，再次通過PCR反應擴增出肌肉生長抑制素成熟肽的cDNA克隆片段；③擴增出的肌肉生長抑制素成熟肽的cDNA克隆片段經過BamHI和SacI雙酶切後，克隆入表達質粒pRSET A的BamHI和SacI兩酶切位點之間，構建成重組表達質粒pMSTN SCAU；④將重組表達質粒pMSTN SCAU轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)株，在培養液中加入0.01mmol/L的IPTG誘導6小時使重組細菌表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白。
製備畜禽肌肉生長抑制素重組融合蛋白方法之二是利用畢赤酵母在甲醇誘導下表達此融合蛋白①根據獅頭鵝肌肉生長抑制素成熟肽編碼cDNA的鹼基序列和用於轉化畢赤酵母的穿梭質粒pPICZαA的多克隆位點的鹼基序列，設計上遊引物YP1(序列為5『-AGGGAATTCGATTTTGGCC TTGACTGC-3』，下劃線部分為EcoRI酶切位點)和下遊引物YP2(5『-AATGGTACCTTTGAGCACCCGCAACG-3』，下劃線部分為KpnI酶切位點)；②利用該對引物、以上反轉錄擴增出的肌肉生長抑制素編碼cDNA序列作為模板，再次通過PCR反應擴增出肌肉生長抑制素基因成熟肽的cDNA酵母穿梭質粒克隆片段，該cDNA克隆片段經過EcoRI和KpnI雙酶切後，克隆入穿梭質粒pPICZαA的EcoRI和KpnI酶切位點之間後，構建成重組質粒pPICZ-MSTN SCAU；③將重組質粒pPICZ-MSTN SCAU線性化並轉化感受態酵母菌X-33，並在ZeocinTM的YPDS固體培養基培養，挑選白色菌落至YPDS液體培養基培養，並用上遊引物AOX1(5『-GACTG GTTCCAATTGACAAGC-3』)和下遊引物AOX2(5『-GCAAATGGCATTCT GACATCC-3』)通過PCR反應來鑑定和挑選Mut+表型重組酵母；④挑取將肌肉生長抑制素成熟肽融合基因正確整合入基因組的單個重組酵母菌接種於BMGY培養基培養，對培養液中添加甲醇至終濃度0.5％誘導表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白，所表達的肌肉生長抑制素重組融合蛋白能被酵母菌分泌至胞外培養液中。
純化所表達的肌肉生長抑制素重組融合蛋白，將用8Mol尿素裂解以上表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，或通過離心分離出含有肌肉生長抑制素重組融合蛋白的酵母培養液，將兩種含有肌肉生長抑制素重組融合蛋白的溶液通過Ni-NTA凝膠純化樹脂進行層析，最後洗脫純化出肌肉生長抑制素重組融合蛋白作為免疫用的抗原。
將以上純化出的肌肉生長抑制素重組融合蛋白作為免疫原製備油乳劑疫苗①按2～6mg/mL的濃度將肌肉生長抑制素重組融合蛋白溶於含2～4％Tween80的水溶液中製成水相；②將10號輕質白油和司本80按94％和6％的比例混合，再向內加入2％的硬脂酸鋁，混合均勻製成油相；③將水相和油相按4∶6的比例混合，並於攪拌機下製成油包水的均質乳液作為肌肉生長抑制素基因工程疫苗。
肌肉生長抑制素基因工程疫苗的應用，主要是通過主動免疫的途徑促進動物的肌肉生長，對生長階段的豬、牛、羊、山羊和鹿，每隔3～4周於肌肉內注射肌肉生長抑制素基因工程油乳劑疫苗，促進動物體內免疫系統產生抗自身肌肉生長抑制素的抗體，該抗體可以中和抑制動物肌肉細胞分泌的肌肉生長抑制素，解除肌肉生長抑制素對畜禽肌肉生長的抑制作用，促進動物肌肉的生長。
現結合實例和附圖對該發明作進一步說明，其中附

圖1為肌肉生長抑制素重組融合基因的大腸桿菌表達質粒的構建流程圖。附圖2為含有肌肉生長抑制素重組融合基因的酵母穿梭質粒的構建流程圖。附圖1所列構建步驟為，①從獅頭鵝肌肉生長抑制素編碼cDNA中擴增出其成熟肽cDNA克隆片段，並將該片段經BamHI和SacI雙酶切；②另外將用於在大腸桿菌中表達重組蛋白的質粒pRSET A同樣用BamHI和SacI雙酶切；③然後將酶切後的成熟肽cDNA克隆片段和pRSET A載體用T4連接酶連接，構建成表達質粒pMSTN SCAU，其中用於表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白的核苷酸序列如序列表中序列2所示。附圖2所列構建步驟為，①從獅頭鵝肌肉生長抑制素編碼cDNA中擴增出其成熟肽cDNA克隆片段，並將該片段經EcoRI和KpnI雙酶切後；②另外將用於向酵母基因組整合外源基因的穿梭質粒pPICZαA同樣用EcoRI和KpnI雙酶切；③然後用酶切後的成熟肽cDNA克隆片段和穿梭質粒pPICZαA載體用T4連接酶連接，構建成重組穿梭質粒pPICZ-Mstn SCAU，其中用於表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
具體實施方案以下是利用從獅頭鵝中克隆出的肌肉生長抑制素編碼cDNA進行製備肌肉生長抑制素的基因工程疫苗的說明。由於到目前為止所發現的不同動物的肌肉生長抑制素的成熟肽胺基酸殘基序列極為相似，因此除了利用獅頭鵝的肌肉生長抑制素基因外，還可以用雞、豬、牛和羊的肌肉生長抑制素基因來製備肌肉生長抑制素的基因工程疫苗。
具體的做法是(1)獲得或克隆畜禽的肌肉生長抑制素編碼基因，(2)利用該基因在大腸桿菌或酵母中表達肌肉生長抑制素的重組融合蛋白作為抗原或免疫原，(3)純化所表達的肌肉生長抑制素融合蛋白免疫原並將其與礦物油佐劑混合製成肌肉生長抑制素疫苗。
1.動物肌肉生長抑制素編碼cDNA的克隆①根據GenBank中所發表的畜禽肌肉生長抑制素基因序列，設計出該基因的特異性引物。上遊引物P1(5』-ATGCAAAAGCTAGCAGTCTATG-3』)對應於肌肉生長抑制素基因編碼區第1-22位核苷酸；下遊引物P2(5』-TCATGAGCACCCGCAACGAT-3』)對應於肌肉生長抑制素基因編碼區第1109-1128位核苷酸。上下遊引物之間包含了1128bp的核苷酸序列，覆蓋了畜禽肌肉生長抑制素編碼區cDNA的完整序列及之後的TGA終止密碼子。
②取100mg獅頭鵝骨骼肌，置於1ml異硫氰酸胍苯酚溶液(Trizol液，Invitrogen公司)中勻漿，然後用氯仿去除蛋白質，離心15分鐘後取出上清液，向上清液中加入異丙醇再離心沉澱總RNA。把總RNA配成1μg/μl的濃度溶於含DEPC的水中，並與下遊引物P2和dNTP混合，在AMV反轉錄酶催化下進行反轉錄合成第一鏈cDNA。
③用引物P1、P2、dNTP和反轉錄合成的第一鏈cDNA作為模板，在DNA聚合酶的催化下通過PCR反應擴增出獅頭鵝的肌肉生長抑制素的編碼cDNA片段。
④將所擴增出的獅頭鵝肌肉生長抑制素cDNA片段與克隆質粒pUCm-T載體(購於上海生工公司)的連接，並將構建成的重組質粒轉化入大腸桿菌DH5α株(Invitrogen公司)進行複製、永久保存、核苷酸序列測定。序列表中序列1為用此方法反轉錄擴增出的獅頭鵝肌肉生長抑制素cDNA的核苷酸序列，其中下劃線部分分別對應P1和P2引物，第799～1125位核苷酸為肌肉生長抑制素成熟肽的編碼cDNA序列，最後的tga為終止密碼子。該擴增的獅頭鵝肌肉生長抑制素基因核苷酸序列與其它禽類的同源性在90％以上，和家畜的同源性在85％以上；所編碼的成熟肽胺基酸殘基序列與雞、豬的完全一樣，與牛的僅有2個胺基酸殘基的差異，與羊的僅有3個胺基酸殘基的差異。因此完全可以用獅頭鵝肌肉生長抑制素編碼cDNA製備肌肉生長抑制素基因工程疫苗。
2.肌肉生長抑制素重組融合蛋白的表達利用獅頭鵝肌肉生長抑制素cDNA，可以通過原核表達系統如大腸桿菌BL21DE3株(Invitrogen公司)或真核表達系統如畢赤酵母(Invitrogen公司)進行肌肉生長抑制素重組融合蛋白的表達。
(1)大腸桿菌BL21 DE3株(Invitrogen公司)中表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白①根據測序所得到的獅頭鵝肌肉生長抑制素cDNA的核苷酸序列，按其成熟肽的cDNA序列(序列表中序列1)，設計一上遊引物P3(5『-ATT GATT TTGGCCTTGACT-3』)對應於肌肉生長抑制素基因編碼區的第799～814位核苷酸序列，並含一BamHI酶切位點(雙下劃線部分)和一下遊引物P4(5『-AAT TGAGCACCCGCAACGA-3』)，對應於肌肉生長抑制素基因編碼區的第1109～1125位核苷酸序列，含一SacI酶切位點(雙下劃線部分)和該位點之後補充的兩個腺嘌呤核苷酸(單下劃線部分)以維持擴增片段的閱讀框架。②利用引物P3、P4、擴增得到的肌肉生長抑制素cDNA片段作為模板和dNTP在Pfu DNA聚合酶催化下經PCR反應再次擴增出兩端帶有BamHI和SacI酶切位點的肌肉生長抑制素成熟肽的cDNA克隆片段，用於插入表達質粒pRSET A(Invitrogen公司)。圖1顯示了含有肌肉生長抑制素重組融合基因的大腸桿菌表達質粒的構建流程利用引物P3和P4擴增得到肌肉生長抑制素成熟肽cDNA克隆片段，將該片段經BamHI和SacI雙酶切；將具有多克隆酶切位點、能夠裝載並在大腸桿菌中表達外源基因的表達質粒pRSETA用BamHI和SacI雙酶切；然後用T4連接酶連接肌肉生長抑制素成熟肽cDNA克隆片段和表達質粒pRSET A載體，構建成表達質粒pMSTNSCAU。其中肌肉生長抑制素重組融合基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，其中下劃線部分分別與引物P3和P4相對應，下劃線之間的部分為肌肉生長抑制素成熟肽cDNA序列，其餘部分為來自於質粒的核苷酸序列。③將該重組表達質粒pMSTN SCAU轉化大腸桿菌BL21 DE3株，重組細菌在培養後0.01mmol/L在IPTG濃度下誘導6小時表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白。該重組融合蛋白的胺基酸殘基序列如序列表中序列3所示，其中單下劃線部分即為肌肉生長抑制素成熟肽109個胺基酸殘基序列，其前方和後方分別為來自表達質粒的36位和14位胺基酸殘基序列，雙下劃線部分為6個組氨酸殘基標記(His-Tag)。
(2)在畢赤(Pichia)酵母中表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白①根據獅頭鵝肌肉生長抑制素成熟肽cDNA核苷酸序列和用於轉化畢赤酵母的穿梭質粒pPICZαA(Invitrogen公司)的多克隆位點核苷酸序列，設計一對特異性引物。上遊引物YP1(5『-AGG GATTTTGGCCTTGACTGC-3』)，對應於肌肉生長抑制素基因編碼區的第799～816位核苷酸序列，含EcoRI酶切位點(雙下劃線部分)；下遊引物YP2(5『-AA TGAGCACCCGCAACG-3』)，對應於肌肉生長抑制素基因編碼區的第1110～1125位核苷酸序列，含一KpnI酶切位點(雙下劃線部分)和維持閱讀框架的兩個鹼基TT(單下劃線部分)。②利用引物YP1、YP2、dNTP、反轉錄PCR擴增得到的肌肉生長抑制素cDNA片段作為模板，在Pfu DNA聚合酶催化下經PCR反應擴增出兩端帶有EcoRI和KpnI酶切位點的肌肉生長抑制素成熟肽的cDNA克隆片段。圖2顯示了含有肌肉生長抑制素重組融合基因的酵母穿梭質粒的構建流程利用引物YP1和YP2擴增得到肌肉生長抑制素成熟肽cDNA克隆片段，將該片段用EcoRI和KpnI雙酶切；將具有多克隆酶切位點、能夠裝載並在將外源基因整合到畢赤酵母基因組中的穿梭質粒pPICZαA用EcoRI和KpnI雙酶切；然後用T4連接酶連接肌肉生長抑制素成熟肽cDNA克隆片段穿梭質粒pPICZαA載體，構建成重組穿梭質粒pPICZ-Mstn SCAU。該質粒中的肌肉生長抑制素重組融合基因的cDNA序列如序列表中序列4所示，其中下劃線部分分別對應於YP1和YP2，中間為肌肉生長抑制素成熟肽編碼cDNA，之前為α因子信號肽編碼cDNA，之後為來自於穿梭質粒的核苷酸所編碼的胺基酸殘基，其中包括一個6個組氨酸的標記(His-tag)。③將重組穿梭質粒pPICZ-Mstn SCAU轉化大腸桿菌DH5α株在其中進行複製，取培養的含有重組穿梭質粒的DH5α培養菌液塗布低鹽LB(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白腖，5g/L NaCl)+ZeocinTM(25μg/mL)固體培養基上培養，挑取單菌落至低鹽LB+ZeocinTM液體培養基培養，進行PCR和酶切鑑定和測序鑑定。④將鑑定構建正確的重組質粒pPICZ-Mstn SCAU線性化，提純後電擊轉化感受態酵母菌X-33，塗布含ZeocinTM的YPDS(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白腖，20g/L D-葡萄糖，1mol/L山梨醇，20g/L瓊脂粉)固體培養基，培養至白色菌落出現。挑單菌落至YPDS(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白腖，20g/L D-葡萄糖)液體培養基培養。同時合成一對引物，上遊引物AOX1(5『-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3』)和下遊引物AOX2(5『-GCAAAT GGCATTC TGAATCC-3』)。用引物AOX1、AOX2、dNTP、重組酵母培養菌在DNA聚合酶催化下進行PCR反應，鑑定並挑選Mut+表型重組酵母。⑤挑選構建正確的已經將肌肉生長抑制素成熟肽基因整合入基因組的單個重組酵母菌接種於25mLBMGY(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白腖，13.4g/L酵母氮源，4×10-5g/LD-生物素，10mL/L丙三醇，100mmol/L磷酸緩衝液，pH6.0)培養基30℃培養至OD600＝2.6，收穫重組酵母菌並用BMMY(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白腖，13.4g/L酵母氮源，4×10-5g/L D-生物素，5mL/L甲醇，100mmol/L磷酸緩衝液，pH6.0)培養基稀釋至OD600＝1，30℃振蕩培養4d，每隔24h添加甲醇至終濃度0.5％，每12h取樣備SDS-PAGE分析所表達的肌肉生長抑制素重組融合蛋白。
以上用畢赤酵母所表達的重組蛋白的胺基酸序列如序列表中序列5所示。其中含來自於載體的89個胺基酸的α因子信號肽序列，109個胺基酸殘基的肌肉生長抑制素成熟肽序列(下劃線部分)，來自質粒基因序列所編碼的29個殘基的肽序列和用於純化的6個胺基酸殘基的組氨酸標記。酵母在表達時會將該蛋白分泌至胞外培養液中，此時會把氨基端的89個胺基酸的α因子信號肽序列裂解開，形成包含一個144胺基酸殘基的肌肉生長抑制素重組融合蛋白，其中109個胺基酸殘基為肌肉生長抑制素成熟肽的胺基酸殘基序列，羧基端的35個胺基酸殘基為來自質粒pPICZαA的基因所編碼，包括位於最後的6個組氨酸殘基標記(His-tag)。
3.肌肉生長抑制素重組融合蛋白的純化利用大腸桿菌表達的肌肉生長抑制素重組融合蛋白的氨基端具有一6個連續組氨酸的標記(His-tag)，在酵母表達的肌肉生長抑制素重組融合蛋白的羧基端具有一6個連續組氨酸的標記。此His-Tag標記能夠與鎳離子發生特異親和結合，因此將表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白的細菌經8M尿素溶液裂解、或將在甲醇誘導後表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白的酵母培養表達液加載到Ni-NTA凝膠純化樹脂層析柱，使其中的肌肉生長抑制素重組融合蛋白被吸附到Ni-NTA凝膠純化樹脂並洗脫不能與鎳離子樹脂結合的菌體雜蛋白，最後改變洗脫液pH值將目的蛋白肌肉生長抑制素重組融合蛋白洗脫純化。
4.肌肉生長抑制素油乳劑疫苗的製備將以上所表達並純化出的肌肉生長抑制素重組融合蛋白按2～6mg/mL的濃度溶於含2～4％Tween 80的水溶液中製成水相；再將10號輕質白油和司本80按94％和6％的比例混合，再向加入2％的硬脂酸鋁混合均勻製成油相；將水相和油相按4∶6的比例混合，並於攪拌機下製成油包水的均質乳液作為肌肉生長抑制素基因工程疫苗。
二.畜禽主動免疫「肌肉生長抑制素」基因工程疫苗促進肌肉生長的方法對豬、牛、羊、山羊和鹿每隔3-4周肌肉注射以上製備的「肌肉生長抑制素」的基因工程油乳劑疫苗，即可以有效促進動物體內免疫系統產生抗自身肌肉生長抑制素的抗體，該抗體可以中和抑制動物肌肉細胞自身分泌的肌肉生長抑制素，解除肌肉生長抑制素對畜禽肌肉生長的抑制作用，促進畜禽肌肉的生長。
與現有技術相比所具有的優點、特點或者積極效果「主動免疫肌肉生長抑制素基因工程疫苗促進畜禽肌肉生長的方法」所使用的物質是「肌肉生長抑制素」基因工程疫苗或「肌肉生長抑制素」的重組融合蛋白，該蛋白無毒性，不對動物造成任何疾病；該蛋白作為基因工程疫苗使用後使動物產生本質是上免疫球蛋白的抗體，不會造成其他藥物殘留，對人畜無害，不會對消費者產生任何不良影響。與其他任何技術相比，該技術促進肌肉組織生長的效力強，特異性高，具有其他任何技術無法比擬的優點和性能。
序列表110華南農業大學120肌肉生長抑制素基因工程疫苗的製備及其應用140
141
160521012111128212DNA213獅頭鵝(Anser anser)220
222(1)...(1128)223肌肉生長抑制素編碼區cDNA序列220
221misc_recomb222(1)...(12)223引物P1對應區域220
221misc_recomb222(799)...(814)223引物P3對應區域220
221mat_peptide222(799)...(1125)223肌肉生長抑制素成熟肽cDNA序列220
221misc_recomb222(1109)...(1128)223引物P2對應區域220
221misc_recomb222(1110)...(1125)223引物P4對應區域4001atgcaaaagc tagcagtcta tgtttatatt tacctgttca tgctgatttc agttgatccg 60gtggctcttg atgacggtag tcaccccaca gagaatgctg aaaaagatgg actgtgcaat 120gcttgtacat ggagacagaa tacaaaatct tccagaatag aagccataaa aattcaaatc 180ctcagcaaac tgcgtctgga acaagctcct aacattagca gggatgttat taaacaactt 240ttacccaaag ctcctccact acaggaactg gttgatcaat atgacgtcca gagagatgac 300agtagcgatg gctctttgga agacgatgac tatcatgcca caactgaaac gattatcaca 360atgcctacag agtctgattt tcttgtacaa atggagggaa aaccaaaatg ttgcttcttt 420aagtttagct ctaaaataca atataacaaa gtagtaaagg cacaattgtg gatatacttg 480aggcaagtcc aaaaacctac aacagtgttt gtgcagatcc tgagacttat taagcccatg 540aaagacggta caagatatac tggaattcga tctttgaaac ttgacatgaa cccaggcact 600
ggtatttggc agagtattga tgtgaagaca gtgttgcaaa attggctcaa acagcctgaa 660tccaatttag gcgtcgaaat aaaagctttt gatgagaatg gacgagatct tgctgtaact 720ttcccaggac caggtgaaga tggattgaat ccatttttag aggtcagagt tacagacaca 780ccgaaacgat cccgcaga gcgatg agcactcgac agaatccaga 840tgttgtcgct acccactaac tgtggacttt gaagcttttg gatgggactg gattatcgca 900cctaaaagat acaaagccaa ttactgctct ggagaatgtg aatttgtatt tctacagaaa 960tatccgcaca ctcatcttgt acaccaagca aatcctagag gctcggcagg cccctgctgc 1020acgcccacca agatgtcccc cataaatatg ttgtatttca atggaaaaga acaaataata 1080tacggaaaga taccagccat ggttgtag 1128
2102211480212DNA213人工序列220
222(1)...(480)223質粒pMSTN SCAU中肌肉生長抑制素重組融合基因序列220
222(103)...(124)223引物P3對應區域220
222(419)...(443)223引物P4對應區域4002atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatcgat ggggatccga ttttggcctt120gactgcgatg agcactcgac agaatccaga tgttgtcgct acccactaac tgtggatttt 180gaagcttttg gatgggactg gattatcgca cctaaaagat acaaagccaa ttactgctct 240ggagaatgtg aatttgtatt tctacagaaa tatccgcaca ctcatcttgt acaccaagca 300aaccctagag gctcggcagg cccctgctgc acgcccacca agatgtcccc cataaatatg 360ttgtatttca atggaaaaga acaaataata tacggaaaga taccagccat ggttgtagat420cgttgcgggt gctcattgag ctcgagatct gcagctggta ccatggaatt cgaagcttga 480
2103211159212PRT213人工序列220
222(1)...(159)223重組大腸桿菌表達的肌肉生長抑制素重組融合蛋白胺基酸殘基序列220
222(5)...(10)223His-tag標記胺基酸殘基序列220
222(27)...(145)223肌肉生長抑制素成熟肽胺基酸殘基序列4003Met Arg Gly Ser 1 5 10Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln11 15 20Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp21 25 30Lys Asp Arg Trp Gly SerAsp Phe Gly Leu31 35 40Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg
41 45 50Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe51 55 60Glu Ala Phe Gul MMT arp Asp Trp Ile Ile Ala61 65 70Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser71 75 80Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys81 85 90Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala91 95 100Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys101 105 110Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met111 115 120Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile121 125 130Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp131 135 140Arg Cys Gly Cys SerLeu Ser Ser Arg Ser141 145 150Ala Ala Gly Thr Met Glu Phe Glu Ala151 155 159
2104211702212DNA213人工序列220
222(1)...(702)223質粒pPICZ-MSTN SCAU中肌肉生長抑制素重組融合基因序列220
222(268)...(291)223引物YP1對應的區域220
222(585)...(608)223引物YP2對應的區域4004atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgaa ttcgattttg gccttgactg cgatgagcac300tcgacagaat ccagatgttg tcgctaccca ctaactgtgg actttgaagc ttttggatgg 360gactggatta tcgcacctaa aagatacaaa gccaattact gctctggaga atgtgaattt 420gtatttctac agaaatatcc gcacactcat cttgtacacc aagcaaatcc tagaggctcg 480gcaggcccct gctgcacgcc caccaagatg tcccccataa atatgttgta tttcaatgga 540aaagaacaaa taatatacgg aaagatacca gccatggttg tagatcgttg cgggtgctca600aaggtacctc gagccgcggc ggccgccagc tttctagaac aaaaactcat ctcagaagag 660gatctgaata gcgccgtcga ccatcatcat catcatcatt ga 702
2105211233212PRT213人工序列220
222(1)...(233)223重組酵母表達的肌肉生長抑制素重組融合蛋白胺基酸殘基序列220
222(1)...(89)223α因子信號肽胺基酸殘基序列220
222(92)...(200)223肌肉生長抑制素成熟肽胺基酸殘基序列4005Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val1 5 10Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala11 15 20Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr21 25 30Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly31 35 40
Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val41 45 50Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn51 55 60Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile61 65 70Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val71 75 80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu81 85 90PheAsp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His91 95 100Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro101 105 110Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp111 115 120Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys121 125 130Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe131 135 140Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His141 145 150Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser151 155 160Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met161 165 170
Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly171 175 180Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro181 185 190Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser191 195 200Lys Val Pro Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser201 205 210Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu211 215 220Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His221 225 230His His His231 23權利要求
1.肌肉生長抑制素基因工程疫苗的製備，其特徵在於①克隆畜禽肌肉生長抑制素編碼基因，②利用畜禽肌肉生長抑制素編碼基因，製備肌肉生長抑制素的重組融合蛋白，③利用該肌肉生長抑制素重組融合蛋白作為免疫原製備肌肉生長抑制素的基因工程疫苗。
2.根據權利要求1所說的肌肉生長抑制素基因工程疫苗的製備，其特徵在於克隆畜禽肌肉生長抑制素編碼基因，①利用根據GenBank中所發表的雞肌肉生長抑制素基因序列，設計出該基因的特異性上遊引物P1(序列為5』-ATGCAAAAGCTAGCAGTCTATG-3』)和下遊引物P2(序列為5』-TCATGAGCACCCGCAACGAT-3』)；②利用異硫氰酸胍-氯仿-異丙醇方法從畜禽肌肉組織中提取總RNA作為模板用引物P2反轉錄成第一鏈cDNA；③用該第一鏈cDNA作為模板和引物P1、P2通過PCR反應擴增出雞、豬或鵝的肌肉生長抑制素的編碼cDNA序列。
3.根據權利要求1所說的肌肉生長抑制素基因工程疫苗的製備，其特徵在於製備畜禽肌肉生長抑制素重組融合蛋白，製備方法之一是利用IPTG誘導大腸桿菌E.coli BL21(DE3)株表達製備重組融合蛋白①根據肌肉生長抑制素成熟肽的cDNA鹼基序列和大腸桿菌表達質粒pRSET A的多克隆位點鹼基序列，合成上遊引物P3(序列為5『-ATTGGATCCGATTTTGGCCTTG ACT-3』，下劃線部分為BamH I限止性酶切位點)和下遊引物P4(序列為5『-AATGAGCTCAATGAGCACCCGCAACGA-3』，下劃線部分為Sac I限止性酶切位點)；②利用該對引物、上述反轉錄擴增出的肌肉生長抑制素編碼cDNA序列作為模板，再次通過PCR反應擴增出肌肉生長抑制素成熟肽的cDNA克隆片段；③擴增出的肌肉生長抑制素成熟肽的cDNA克隆片段經過BamH I和SacI雙酶切後，克隆入表達質粒pRSET A的BamH I和Sac I兩酶切位點之間，構建成重組表達質粒pMSTN SCAU；④將重組表達質粒pMSTN SCAU轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)株，在培養液中加入0.01mmol/L的IPTG誘導6小時使重組細菌表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白。
4.根據權利要求1所說的肌肉生長抑制素基因工程疫苗的製備，其特徵在於製備畜禽肌肉生長抑制素重組融合蛋白，製備方法之二是利用畢赤酵母在甲醇誘導下表達此融合蛋白①根據獅頭鵝肌肉生長抑制素成熟肽編碼cDNA的鹼基序列和用於轉化畢赤酵母的穿梭質粒pPICZαA的多克隆位點的鹼基序列，設計上遊引物YP1(序列為5『-AGGGAATTCGATTTTGGCC TTGACTGC-3』，下劃線部分為EcoR I酶切位點)和下遊引物YP2(5『-AATGGTACCTTTGAGCACCCGCAACG-3』，下劃線部分為Kpn I酶切位點)；②利用該對引物、以上反轉錄擴增出的肌肉生長抑制素編碼cDNA序列作為模板，再次通過PCR反應擴增出肌肉生長抑制素基因成熟肽的cDNA酵母穿梭質粒克隆片段，該cDNA克隆片段經過EcoR I和KpnI雙酶切後，克隆入穿梭質粒pPICZαA的EcoRI和KpnI酶切位點之間後，構建成重組質粒pPICZ-MSTN SCAU；③將重組質粒pPICZ-MSTN SCAU線性化並轉化感受態酵母菌X-33，並在ZeocinTM的YPDS固體培養基培養，挑選白色菌落至YPDS液體培養基培養，並用上遊引物AOX1(5『-GACTG GTTCCAATTGACAAGC-3』)和下遊引物AOX2(5『-GCAAATGGCATTCT GACATCC-3』)通過PCR反應來鑑定和挑選Mut+表型重組酵母；④挑取將肌肉生長抑制素成熟肽融合基因正確整合入基因組的單個重組酵母菌接種於BMGY培養基培養，對培養液中添加甲醇至終濃度0.5％誘導表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白，所表達的肌肉生長抑制素重組融合蛋白能被酵母菌分泌至胞外培養液中。
5.根據權利要求1所說的肌肉生長抑制素基因工程疫苗的製備，其特徵在於純化所表達的肌肉生長抑制素重組融合蛋白，將用8Mol尿素裂解以上表達肌肉生長抑制素重組融合蛋白的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，或通過離心分離出含有肌肉生長抑制素重組融合蛋白的酵母培養液，將兩種含有肌肉生長抑制素重組融合蛋白的溶液通過Ni-NTA凝膠純化樹脂進行層析，最後洗脫純化出肌肉生長抑制素重組融合蛋白作為免疫用的抗原。
6.根據權利要求1所說的肌肉生長抑制素基因基因工程疫苗的製備，其特徵在於將以上純化出的肌肉生長抑制素重組融合蛋白作為免疫原製備油乳劑疫苗①按2～6mg/mL的濃度將肌肉生長抑制素重組融合蛋白溶於含2～4％Tween 80的水溶液中製成水相；②將10號輕質白油和司本80按94％和6％的比例混合，再向內加入2％的硬脂酸鋁，混合均勻製成油相；③將水相和油相按4∶6的比例混合，並於攪拌機下製成油包水的均質乳液作為肌肉生長抑制素基因工程疫苗。
7.肌肉生長抑制素基因工程疫苗的應用，主要是通過主動免疫的途徑，用於促進動物的肌肉生長，其特徵在於對生長階段的豬、牛、羊、山羊和鹿，每隔3～4周於肌肉內注射肌肉生長抑制素基因工程油乳劑疫苗，促進動物體內免疫系統產生抗自身肌肉生長抑制素的抗體，該抗體可以中和抑制動物肌肉細胞分泌的肌肉生長抑制素，解除肌肉生長抑制素對畜禽肌肉生長的抑制作用，促進動物肌肉的生長。
全文摘要
本發明屬於獸用疫苗製備領域，通過基因工程的方法，克隆肌肉生長抑制素的基因，在大腸桿菌或酵母中表達肌肉生長抑制素的重組融合蛋白作為免疫原或基因工程疫苗。對生長畜禽主動免疫此肌肉生長抑制素基因工程疫苗，可以促進動物產生抗肌肉生長抑制素的抗體，該抗體可以中和抑制畜禽體內肌肉自身產生的肌肉生長抑制素，解除肌肉生長抑制素的抑制肌肉生長作用，從而促進肌肉生長。該技術促進肌肉生長效力強，特異性高，並且無毒性，無致病性，無藥物殘留，不對消費者產生任何不良影響。
文檔編號C12P19/00GK1569230SQ20031011202
公開日2005年1月26日 申請日期2003年11月5日 優先權日2003年11月5日
發明者施振旦, 劉穎, 郭文軍 申請人:華南農業大學