胰腺幹細胞及其在器官移植中的用途的製作方法

2023-05-14 16:50:46 1

專利名稱：胰腺幹細胞及其在器官移植中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及到幹細胞及其分化領域，尤其是涉及到胰腺胰島β細胞及nestin陽性肝臟幹細胞及其從幹細胞及祖細胞的分化，以及胰腺幹細胞，祖細胞，及已分化的β細胞或nestin陽性肝臟幹細胞或祖細胞在器官移植中的用途。
背景技術：
本發明是在得到至少部分美國政府基金的資助下完成的，其得到國立衛生研究所授予的DK30457及DK30834，因此，美國政府享有本發明的一定權利。
胰島細胞的起源，包括其在胚胎發育還是在成熟哺乳動物細胞階段，儘管已作了許多研究，但依然不確定。一些導管上皮細胞能夠分化或者反分化以形成在成熟胰島中的β細胞及其他類型的細胞(Bouwens，1998)。
來自分離胰島的導管細胞可以在培養物中增殖且如果移植進入動物體內，可以分化成功能性β細胞(Cornelius et al.，1997)。
已經可以證明exendin-4，一個長期作用的GLP-1拮抗劑，當給予鼠類時激發了來自導管祖細胞的(新生)的β細胞的分化及β細胞的增殖。在一個2型糖尿病鼠模型的部分胰切手術中胰切後10天每天給予exendin-4可以減緩糖尿病的發展。已經可以證明exendin-4刺激了胰腺的再生及新生的β細胞群體的擴展及β細胞的增殖(Xuet al.，1999，Diabetes，482270-2276)。
Ramiya等，已經證明分離自成人前驅糖尿病非肥胖糖尿病(NOD)鼠的胰腺導管的多能性幹細胞的體外產生的胰島分化形成葡萄糖響應性胰島其可以在不管是以囊裝是否進入糖尿病NOD鼠類(Ramiyaet al.，2000，Nature Med.，6278-282)移植後反轉胰島素依賴型糖尿病。
促胰島激素，腸生胰高血糖素相似性多肽(GLP)-1可以提高有助於胰腺發育的同源區轉錄因子IDX-1的胰腺表達及胰島素基因的轉錄調控。與此同時，GLP-1被給予糖尿病小鼠刺激胰島素的分泌且可以有效地降低其血糖水平。GLP-1同樣可以提高β細胞的再生及胰島的大小(Stoffers et al.，2000，Diabetes，49741-748)。
Ferber等，已經證明了腺病毒介導的體外PDX-1(同樣也為IDX-1)轉移基因轉移進入小鼠肝細胞結果使得肝實質細胞數量向β細胞顯型反轉。
其表明使用PDX-1腺病毒載體靜脈內輸入小鼠後有超過60％的肝實質細胞合成PDX-1。處理小鼠的血清及肝臟中免疫反應性胰島素濃度大量增加。使用PDX-1處理的小鼠存活於鏈脲黴素誘導的糖尿病且可以調節血糖過高症(Ferber et al.，2000，NatureMed.，6568-572)。
獲自分離胰島的導管細胞培養物明顯含有可以提高胰島素分泌的細胞量，其還不清楚是否這些細胞是真正的幹細胞或僅僅是導管上皮細胞所經歷的反分化狀態。即使這些物質中含有真正的幹細胞，尚不清楚哪一部分代表幹細胞及可以被描述的細胞類型。因此需要從胰腺組織中分離出特定的細胞類型，使用分子標記證明哪一部分是幹細胞的細胞類型且證明其是多能性的且可以長期增殖。
在大腦中已發現能夠分化成為神經元及神經膠質組織的多能性幹細胞。神經幹細胞特定表達nestin，一個中間絲狀體蛋白(Lendahlet al.，1990；Dahlstrand et al.，1992)。在第E11天Nestin表達於發育小鼠胚胎神經管中，其在第E16天在大腦皮層達到表達量的最高水平，然後在成人大腦皮層降低，局限於室管膜細胞群體(Lendahl etal.，1990)。發育中的神經系統及胰腺胰島細胞顯示出其與普通細胞特徵相似的表型。
本發明涉及到胰腺胰島幹細胞/祖細胞(IPCs)群體其與神經元及肝臟幹細胞相似且分化成胰島α-細胞(胰高血糖素)及β細胞(胰島素)。本發明同樣涉及nestin陽性肝臟細胞。按照本發明的IPCs是免疫不容性型還是免疫優勢型通過其自身作為移植受體來證實。按照本發明的IPCs可以被用於同種異基因或經過異源基因載體移植。
本領域需要通過同種異基因或經過異源基因載體的方法移植幹細胞。
本領域同樣需要治療I型糖尿病mellitus的方法其中胰島，nestin陽性胰腺幹細胞或者nestin陽性肝臟幹細胞通過同種異基因或異種基因的載體方法被轉移進入受體細胞且並未發生移植排斥反應。
本領域同樣需要移植進入一個哺乳動物細胞的方法其中胰島，nestin陽性胰腺幹細胞或者nestin陽性肝臟幹細胞通過同種異基因或異種基因的載體方法被轉移進入受體細胞且並未發生移植排斥反立。

發明內容
本發明的目的是提供一個哺乳動物胰腺或肝臟幹細胞用於治療糖尿病mellims及其他病症。提供鑑別，定位及分離胰腺幹細胞的方法也是本發明的目的，同樣為本發明目的的還有提供一個分化胰腺幹細胞以獲得可產生胰島素及其他激素的細胞的方法。本發明的另外一個目的是提供可使用哺乳動物胰腺或肝臟幹細胞移植進入哺乳動物的方法。這些及其他的本發明的目的可通過下述一個或多個具體的技術方案來體現。
本發明的一個技術方案是提供一個治療糖尿病mellitus的患者的方法。一個nestin陽性胰腺幹細胞分離自一個供體的一個胰腺胰島。幹細胞轉移進入患者其中其分化成為一個胰島素生產細胞，另一個技術方案提供了另一種治療糖尿病患者的方法。一個nestin陽性胰腺幹細胞分離自一個供體的一個胰腺胰島然後擴展至體外以產生一個祖細胞。祖細胞被轉移進入患者其中其分化成為一個可產生胰島素的β細胞。另一個技術方案依然提供了另一種治療糖尿病患者的方法。一個nestin陽性胰腺幹細胞分離自一個供體的一個胰腺胰島然後擴展至體外以產生一個祖細胞。祖細胞在培養基中分化形成假胰島相似性聚合體其被轉移進患者。
另一個技術方案提供了另一種治療具有糖尿病mellitus的患者的方法。一個nestin陽性胰腺幹細胞分離自一個供體的一個胰腺胰島然後擴展至體外以產生一個祖細胞。祖細胞被轉移進入患者其中其分化成為一個可產生胰島素的β細胞。
在這些方案中，患者同樣作為胰島組織的供體，提供細胞的同系移植物或已分化的組織。
在一個優選的方案中，患者本身並不作為胰島組織的供體。
在另一個優選的技術方案中，患者是人且供體是非人哺乳動物。
在另一個優選的技術方案中，在轉移步驟之前對患者並不使用免疫抑制劑進行處理。
在另一個優選的技術方案中，在轉移步驟之前，使用選自含有下列組分的組的試劑體外處理幹細胞EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-P，及其結合體。
在另一個優選的技術方案中，轉移步驟是通過內向倒退注射法進行。
在另一個優選的技術方案中，治療具有糖尿病mellitus的患者的方法此外還包括使用免疫抑制劑處理患者的步驟。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑可以防止免疫反應。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑減緩了已經發生的免疫反應。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑減弱了免疫反應的強度。
在另一個優選的技術方案中，免疫反應是免疫移植排斥反應。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑選自含有下列組分的組FK-506，cyclosporin，及GAD65抗體。
在另一個優選的技術方案中，其提供了一個從胰島中分離幹細胞的方法。從供體中分離出胰島，然後對其細胞進行培養。從培養基中選出Nestin陽性幹細胞克隆。可選擇的是，通過在使用伴刀豆球蛋白A包裹的容器中的非胰島細胞中清洗出去可結合在非胰島細胞的胰島細胞。
在一個優選的技術方案中，分離幹細胞的方法進一步包括通過使用選自含有EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activinA，TGF-P，及其結合體的組的試劑進行處理擴展nestin陽性克隆的步驟。
進一步的技術方案提供了一種誘導nestin陽性胰腺幹細胞分化成為胰腺祖細胞的方法。正如這兒所使用到的，＂分化＂指的是這樣一個過程其中細胞經歷一種變化至一個特定的細胞類型，例如一個專門的細胞類型。幹細胞使用選自含有下列組分的組的試劑進行處理EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activinA，TGF-P，及其結合體，幹細胞隨後分化為胰腺祖細胞。
在一個優選的技術方案中，胰腺祖細胞隨後形成假胰島類似性聚合體。
本發明的一個技術方案提供了一種移植進入哺乳動物體內的方法。一個nestin陽性胰腺幹細胞分離自一個供體的胰島。幹細胞轉移進入哺乳動物體內其中其分化成為胰島素生產細胞。
另一個技術方案提供了另一種移植進入哺乳動物體內的方法。一個nestin陽性胰腺幹細胞分離自一個供體的一個胰腺胰島然後擴展至體外以產生一個祖細胞。祖細胞被轉移進入哺乳動物其中其分化成為一個可產生胰島素的β細胞。另一個技術方案也提供了另一種移植進入哺乳動物體內的方法。一個nestin陽性胰腺幹細胞分離自一個供體的一個胰腺胰島然後擴展以產生一個祖細胞。祖細胞在培養基中分化形成假胰島相似性聚合體其被轉移進哺乳動物。
另一個技術方案提供了另一種移植進入哺乳動物的方法。一個nestin陽性胰腺幹細胞分離自一個供體的一個胰腺胰島然後擴展至體外以產生一個祖細胞。祖細胞被轉移進入哺乳動物其中其分化成為一個可產生胰島素的β細胞。
在這些方案中，哺乳動物同樣作為胰島組織的供體，提供細胞的同系移植物或已分化的組織。
在一個優選的方案中，哺乳動物本身並不作為胰島組織的供體。
在另一個優選的技術方案中，哺乳動物是人且供體是非人哺乳動物。
在另一個優選的技術方案中，在轉移步驟之前對哺乳動物並不使用免疫抑制劑進行處理。
在另一個優選的技術方案中，在轉移步驟之前，使用選自含有下列組分的組的試劑體外處理幹細胞EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-P，及其結合體。
在另一個優選的技術方案中，轉移步驟是通過內向倒退注射法進行。
在另一個優選的技術方案中，移植進入哺乳動物的方法此外還包括使用免疫抑制劑處理哺乳動物的步驟。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑可以防止免疫反應。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑減緩了已經發生的免疫反應。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑減弱了免疫反應的強度。
在另一個優選的技術方案中，免疫反應是免疫移植排斥反應。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑選自含有下列組分的組FK-506，cyclosporin，及GAD65抗體。
而另一個技術方案提供了一種分離的，nestin陽性人類胰腺幹細胞， 在這個技術方案中，幹細胞分化成為或者一個β細胞，一個α細胞，一個假胰島類似聚合體或者一個肝實質細胞。在該技術方案中，幹細胞是優先免疫的。在一個技術方案中，幹細胞並不表達I型MHC抗原，在一個技術方案中， 幹細胞並不表達II型MHC抗原，在一個技術方案中，幹細胞並不表達I型或II型MHC抗原。
另一個技術方案也提供了一種鑑別胰腺細胞作為幹細胞的方法。一個細胞使用一個標記的nestin特異性抗體接觸，如果細胞也為該抗體標記，那麼細胞就被鑑別為幹細胞。可選擇的另外的步驟包括使用抗細胞角蛋白19及抗膠原質IV的抗體接觸細胞；如果其並未被或者細胞角蛋白19或者膠原質IV的抗體標記的話其就被鑑別為幹細胞。
另一個技術方案提供了一個誘導nestin陽性胰腺幹細胞分化成為肝實質細胞的方法，nestin陽性胰腺幹細胞使用有效量的可以誘導幹細胞分化成為肝實質細胞或可以分化成為肝實質細胞的祖細胞的試劑進行處理。在一個優選的技術方案中，該試劑是cyclopamine。
而另一個技術方案提供了一個治療具有肝臟疾病的患者的方法。一個分離自供體胰島的nestin陽性胰腺幹細胞且轉移進入患者其中幹細胞分化成為肝實質細胞。
在一個相關的技術方案中，幹細胞體外擴展至一個祖細胞，其被轉移進入患者然後進一步分化成為肝實質細胞。
在另一個相關的技術方案中，幹細胞體外分化成為一個祖細胞，其被轉移進入患者，然後進一步分化成為肝實質細胞。在另一個相關的技術方案中，幹細胞體外分化成為肝實質細胞，其再被移植進入患者。
在這些技術方案中，患者可以作為胰島組織的受體，以提供細胞的同系移植物或分化組織。
在一個優選的技術方案中，患者並不作為胰島組織的供體。
在另一個優選的技術方案中，患者是人且供體是非人哺乳動物。
在另一個優選的技術方案中，在轉移步驟之前對患者並不使用免疫抑制劑進行處理。
另一個優選的技術方案中，治療具有肝病的患者的方法此外還包括使用免疫抑制劑處理患者的步驟。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑可以防止免疫反應。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑減緩了已經發生的免疫反應。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑減弱了免疫反應的強度。
在另一個優選的技術方案中，免疫反應是免疫移植排斥反應。
然而另一個技術方案提供了一種移植進入哺乳動物細胞的方法。一個分離自一個供體胰島的nestin陽性胰腺幹細胞被轉移進入哺乳動物細胞，其中幹細胞分化成為肝實質細胞。在另一個相關的技術方案中，幹細胞被被體外擴展成為祖細胞，其被轉移進入哺乳動物細胞並進一步分化成為一個肝實質細胞。
在另一個相關的技術方案中，幹細胞被體外分化成為祖細胞，其被轉移進入哺乳動物細胞並進一步分化成為一個肝實質細胞。在另一個相關的技術方案中，幹細胞體外分化成為祖細胞，然後被轉移進入哺乳動物細胞。
在這些技術方案中，哺乳動物可以作為胰島組織的供體，其提供一個細胞的同系移植物或分化組織。
在一個優選的技術方案中，哺乳動物並不作為胰島組織的供體。
在另一個優選的技術方案中，哺乳動物是人而供體是非人哺乳動物。
在另一個優選的技術方案中，在轉移步驟之前對哺乳動物並不使用免疫抑制劑進行處理。
在另一個優選的技術方案中，移植進入哺乳動物的方法此外還包括使用免疫抑制劑處理哺乳動物的步驟。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑可以防止免疫反應。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑減緩了已經發生的免疫反應。
在另一個優選的技術方案中，免疫抑制劑減弱了免疫反應的強度。
在另一個優選的技術方案中，免疫反應是免疫移植排斥反應。
然而另一個技術方案提供了一種分離的，nestin陽性人類肝臟幹細胞，在這個技術方案中，幹細胞是優先免疫的。在一個技術方案中，幹細胞並不表達I型MHC抗原，在一個技術方案中，幹細胞並不表達II型MHC抗原，在一個技術方案中，幹細胞並不表達I型或II型MHC抗原。
然而另一個技術方案提供了一種分離的，nestin陽性人類幹細胞其並非是神經幹細胞其可以移植進入動物而並不導致移植過程中寄主的排斥反應。在該技術方案中，幹細胞並非主要組織相容性複合體I型或II型限制的。
這兒所使用的「幹細胞」意指未分化細胞其可以在體內外無限制性地繁殖並能夠分化成為其他細胞類型。其可以是某種分化細胞，定向型細胞，不成熟細胞，祖細胞或成熟細胞類型，例如紅血球及淋巴細胞其來源於相同的祖細胞，甚至是組織發育各階段的細胞類型其完全不同於幹細胞時的組織。例如，血液幹細胞可以變為腦細胞或肝細胞，神經細胞可以變為肝細胞，如此幹細胞是多功能性的，假如從周圍環境中獲得一定的信號，其可以分化成為機體的任何組織。
在一個技術方案中，本發明所述的「幹細胞」是免疫盲或免疫優先的。正如這兒所使用的「免疫盲或免疫優先」指的是細胞並不誘發免疫反應。正如這兒所使用的，「免疫反應」指的是由免疫系統針對外源物質所發生的反應。正如這兒所使用的，包括但並不限於移植排斥，抗體產生，感染及抗原特異性淋巴細胞針對抗原的反應。按照本領域的已知技術如果移植物志被成功移植或排斥都可以檢測到免疫反應，正如在移植排斥反應分析的部分進行定義那樣。在一個技術方案中，按照本發明一個＂免疫盲的幹細胞＂或者一個＂免疫優先的幹細胞＂可以被同種異體移植或者異種移植而不發生移植排斥反應在移植受體或寄主中可以被識別為自身。
如果寄主對移植物質不是免疫不容性的或者並未使用免疫抑制藥劑以防排斥移植物質可能要遭受到移植受體或者寄主的排斥。
正如這兒所使用的，按照本發明，一個寄主如果是免疫不容性的，正如這兒所定義的那樣，其不會馬上發生免疫反應。在一個技術方案中，免疫不容性寄主並不排斥或破壞移植物質。在一個技術方案中，免疫不容性性寄主對抗原並不發生通過產生抗體結合在抗原上的反應。
正如這兒所使用的，＂排斥＂指的是由寄主免疫系統排斥抑制物質。在一個技術方案中，＂排斥意指針對寄主免疫反應的結果移植物有超過90％的細胞或組織壞死現象發生＂。在另一個技術方案中，＂排斥＂意指生存能力的降低而且移植物針對寄主免疫反應的結果其生存能力與移植前相比降低90％甚至更多。生存能力的降低可由本領域的普通技術來確定其包括但並不限於trypan藍色排斥染色。在另一個技術方案中，＂排斥＂意指移植物不能增殖。增殖可以通過本領域的已知技術其包括但並不限於蘇木精/曙紅染色來測量。移植排斥的發生和/或移植後排斥發生的速度將依賴於各種因素，其包括但並不限於移植物質(也就是說，細胞類型，細胞數量)或寄主(也就是說，不管寄主是否免疫不容性的和/或已經使用免疫抑制劑處理過)。正如這兒所使用到的，＂移植物對寄主的排斥＂或＂移植物對寄主的反應＂指的是移植物與寄主抗原發生的T細胞介導的反應。
正如這兒所使用到的，＂寄主對移植排斥＂或＂寄主對移植物反應＂指的是寄主免疫系統抵抗外來移植物的細胞介導的免疫反應。
在另一個技術方案中，特異性抗體的產生發生免疫反應(例如特異性連接在移植物抗原上的抗體或特異性連接在外源物質或外源物質產品上的抗體)通過本領域已知的免疫方法檢測，包括但並不限於ELISA，免疫染色，免疫沉降反應及蛋白質印跡分析。
幹細胞在細胞表面表達形態發生或生長因子受體，且可以感覺到，例如，受傷相關因子然後定位於組織受傷位點，或感受到其周圍的微環境及分化成為合適的細胞類型。
＂基本無限制性增殖＂可以被確定，例如，通過分離幹細胞在細胞培養系統中通過至少50，最好是100，甚至200或者更多的細胞分化進行增殖的能力。幹細胞可以是＂全能的，＂意指其可以成為所有的有機體細胞例如細菌細胞。幹細胞也可以是＂多能性的，＂意指其可以成為不同類型的細胞但並不是所有的有機體細胞，當一個幹細胞分化時，其一般成為一個更加成熟的細胞類型，其可以成為部分分化的細胞例如祖細胞，一個分化的細胞或者一個終止分化的細胞。幹細胞可以是高度活動性的。
＂Nestin＂指的是中間纖維蛋白其序列已在Genbank上登記，號為X65964(圖7)。
一個＂胰腺＂幹細胞指的是分離自胰腺組織的幹細胞和/或具備下述特徵的細胞nestin陽性染色，nestin基因表達，cytokeratin-19負染色，培養基中的長期增殖，及分化成為假胰島細胞的能力。
一個＂肝＂幹細胞指的是分離自肝組織的幹細胞和或nestin陽性染色特徵的細胞，nestin基因表達，及其在培養物中的長期增殖。
一個＂祖細胞＂指的是一個通過分化獲自幹細胞的細胞其能夠進一步分化成為更加成熟的細胞類型。
正如這兒所使用的，詞組＂胰島素產生的β細胞＂指的是能夠產生分泌與人類胰臟胰島細胞β細胞分泌的相同數量的胰島素的所有細胞。
更加適宜的是，胰島素產生的β細胞胰島素的分泌同樣以人類β細胞原位胰島素的分泌調控相似的方式進行調控；例如，胰島素的分泌同樣可為在胰島素產生的β細胞周圍葡萄糖濃度的提高而刺激。
＂假胰島相似性＂聚合體是一個胰島素分泌細胞的人工聚合體其在形態與功能上與胰島細胞相似。假胰島相似性聚合體在細胞培養條件下體外產生。其直徑大約為50-150μm(與胰島平均直徑100μm相比較)且形狀為球形體。
＂分離＂一個幹細胞指的是從組織樣品中移出幹細胞且與另外的非組織幹細胞分開。一個分離的幹細胞可以從其他類型的細胞中自由分出且具有增殖能力而分化成為組織中的成熟細胞。然而，當處理幹細胞的收集時，例如幹細胞的培養，已經得知其有部分可能性獲得100％純度的幹細胞。因此，一個分離的幹細胞可以存在於其他類型的細胞僅有一部分時且並不與幹細胞的分析或生產其它分化種類的細胞類型使用相衝突時，分離的幹細胞一般至少為30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，98％，或99％純度。最好是，按照本發明分離幹細胞至少有98％或99％的純度。
一個幹細胞是＂擴展的＂當其在培養物中增值時且通過細胞分化變為其他類型的幹細胞和/或祖細胞。幹細胞的擴展可以在幹細胞的增殖的同時進行其也可能需要某種特定的生長環境，例如最小的細胞濃度，容器表面的細胞匯集度或者加入化學因子例如生長因子，分化因子或信號因子。
一個幹細胞，祖細胞或分化細胞被移植或者引入一個哺乳動物細胞當其從一個培養器中轉移至一個患者時。這兒所使用到的移植可以包括按照本發明所述的幹細胞分離步驟及將幹細胞轉移進入哺乳動物或患者體內。移植可能涉及到通過注射細胞懸液進入哺乳動物或者患者，外科手術將細胞移植進入哺乳動物或患者體內的組織或器官，使用細胞懸浮灌注組織或器官等將幹細胞轉移進入哺乳動物或患者體內。轉移幹細胞或移植的路徑將通過細胞在特定組織或器官中的定位的需要及細胞為靶定組織或器官所發現或獲得的能力來確定。在一個案例中移植細胞定位於特定的位點，其可以被外科轉移進入組織或器官或者簡單地注射進入血流如果該細胞在靶定細胞中有移植的能力。
正如這兒所使用的，移植可以包括按照本發明分離幹細胞，培養和轉移幹細胞進入哺乳動物或者患者體內去的步驟。正如這兒所使用的，移植可以包括按照本發明分離幹細胞，分化幹細胞，轉移幹細胞進入哺乳動物或者患者體內去的步驟。正如這兒所使用的，移植可以包括按照本發明分離幹細胞，分化和擴展幹細胞，轉移幹細胞進入哺乳動物或者患者體內去的步驟。
這兒所使用到的一個＂移植物質＂按照本發明指的是至少105幹細胞甚至到108或109個幹細胞。
通過給予患者人以試劑其可以預防延緩如移植細胞組織器官的排斥等免疫反應的發生或已發生免疫反應強度的降低的免疫抑制劑。
正如這兒所使用到的，＂免疫抑制反應＂指的是防止免疫反應(例如如這兒所定義的給予免疫抑制劑)以至於免疫反應並不能檢測到。正如這兒所使用到的，免疫反應的預防指的是免疫反應檢測不到。一個免疫反應(例如移植排斥或抗體產生)按照本領域已知技術檢測到。
按照本發明＂免疫抑制＂同樣意指與任一併未受到免疫抑制試劑的移植受體或者不是「免疫盲的」或「免疫優先」的如這兒所定義的那樣的移植物質移植的受體相比較免疫反應發生的延緩。免疫反應的延緩發生可以是短期延緩，例如1小時至10天例如1小時，2，5或10天。免疫反應發生的延緩也可以是長期延緩例如10天至10年(例如30天，60天，90天，180天，1，2，5，10年)。
按照本發明＂免疫抑制反應＂同樣意指免疫反應強度的減少，按照本發明免疫反應強度可以減少例如5-100％，最好是25-100％及最好是75-100％任一併未受到免疫抑制試劑的移植受體或者不是「免疫盲的」或「免疫優先」的如這兒所定義的那樣的移植物質移植的受體的免疫反應強度。免疫反應強度的減少通過確定移植物質被排斥的時間點來測量。例如一個含有移植物質在在移植後1天被排斥的免疫反應比較在移植後30天被排斥的免疫反應強度要大。
免疫反應的強度同樣可以通過定量可特異性結合至移植物質上的抗體的數量來測量其中所產生抗體的水平與免疫強度正相關。此外，免疫反應強度可以通過確定檢測到的特異性抗體可特異性結合至移植物質上的時間點來確定。
不同的方法和試劑可被用於免疫抑制。例如淋巴細胞的增殖和活化一般可通過使用這樣的試劑例如FK-506，環孢黴素或其他免疫抑制劑進行抑制。另外的可能的方法是給予抗體例如抗GAD65單抗或其他的化合物其可以掩蓋移植細胞表面上的抗原並因此使得部分細胞為寄主免疫系統所看不到。
一個＂免疫抑制試劑＂是這樣的一個試劑其可以預防延緩寄主中外源細胞尤其是移植細胞的免疫反應強度。最好是這樣的免疫抑制試劑其可以抑制細胞介導為其免疫系統鑑別為非自身的免疫反應，免疫抑制試劑例如包括但並不限於環孢黴素，環磷醯胺，強的松，地塞米松，甲氨喋呤，咪唑硫嘌呤，mycophenolate，鎮靜劑，FK506，系統類固醇，及其他的大範圍內的抗體，受體拮抗劑，及其他本領域已知的試劑。
一個＂促有絲分裂劑＂可以是任一試劑其可以刺激細胞的有絲分裂及增殖。
一個＂分化因子＂指的是可以導致幹細胞或祖細胞分化為另外細胞類型的試劑。分化一般通過改變幹細胞或祖細胞一個或多個基因的表達來實現其結果在於細胞改變了結構及功能。
正如這兒所使用到的一個＂信號因子＂為一個細胞所分泌的試劑其可以作用於相同或不同的細胞。例如一個信號因子其可以抑制或誘導生長，增殖或其本身的分化，機體中的相鄰細胞或距離較遠的細胞。信號因子可以例如在組織中傳遞位置信息，調控結構形成，或影響各種解刨學構造的大小，形狀及功能。
正如這兒所使用到的，哺乳動物指的是任一哺乳動物包括但並不限於人類，鼠，羊，猴，山羊，兔子，碩鼠，馬，牛或豬。
一個＂非人哺乳動物＂，正如這兒所使用到的，意指非人的任一哺乳動物。
正如這兒所使用到的，＂同種異源基因＂指的是同種遺傳性不同的成員。
正如這兒所使用到的，＂同基因＂指的是同樣的遺傳構造。
正如這兒所使用到的，＂異基因＂指的是不同種的成員。
正如這兒所使用到的，＂培養＂指的是增殖或營養一個細胞，細胞，組織或器官的收集通過在一定環境下孵育一段時間並在此條件下支持細胞的增殖或存活。培養包括一個或多個擴展或增殖細胞，按照本發明收集細胞組織或器官的步驟。
本發明同樣提供了一個藥物組合物其包括本發明的分離幹細胞以及藥理學上合適的載體。


圖1A及1B顯示了鼠胰島在胚胎16天雙重螢光免疫細胞化學染色(圖1A)及在出生後60天(圖1B)。Nestin的抗體免疫染色以白色顯示(一開始是紅色，使用Cy3作為螢光團)且抗胰島素抗體是以灰色顯示(一開始是綠色，使用Cy2作為螢光團)。
圖2顯示了使用獲自50個鼠胰島mRNA進行的RT-PCR結果，前後引物都已被標明。834bp的單鏈被測序且被標明為nestin序列。
圖3顯示了nestin陽性細胞其已從培養的鼠胰島中增殖。
圖4顯示了鼠胰島類似物在培養物中的發育。
圖5顯示了培養物中產生的胰島類似結構的RT-PCR的分析結果。NCAM及cytokeratin-19(CK19)的表達都被檢測到。
圖6顯示了高葡萄糖刺激nestin mRNA的表達。APRT作為對照進行鑑定。
圖7是nestin的胺基酸及核苷酸序列。
圖8描述了在胰島中獨特的細胞群體的神經幹細胞特異性標記nestin的表達如免疫細胞化學或RT-PCR所確定的那樣。
圖9描述的是通過免疫細胞化學或RT-PCR從胰腺中分離的幹細胞nestin。
圖10描述的是獲自nestin陽性胰島祖細胞(NIPs)的人類胰島類似性聚合體中的同族區域蛋白IDX-1及proglucagon的表達。
圖11證明了nestin陽性細胞在鼠胰腺管區域定位。
圖12描述其為胰島內分泌細胞祖先的胰管細胞的起源的替代模型。
圖13A及B描述了nestin陽性肝臟幹細胞的免疫螢光染色。
圖14描述了在鼠內分泌胰腺發育期間轉錄因子的序列。
圖15描述了在含有幹細胞的人類NIP培養物中神經內分泌，外分泌胰腺及肝臟標記。
圖16描述了通過RT-PCR確定的proglucagon及胰島素mRNA的表達。
具體實施例方式
現在的發明家已經鑑別且分離出了來自具有幹細胞功能及分子特徵的哺乳動物胰腺胰島管細胞的一個特定的亞簇。尤其是，這些新發現的胰腺幹細胞通過一個或多個(最好是全部)的其他事物來描述nestin陽性染色，nestin基因表達，cytokeratin-19陰性染色，培養物中的長期增殖，分化成為培養物中假胰島的能力。這些發明者同樣也鑑別出展示nestin陽性染色的肝細胞。
在一個技術方案中，本發明提供了用於不同應用的幹細胞，其包括但並不限於當研究工具發展至可以研究不同糖尿病條件下，荷爾蒙異常及遺傳疾病或條件例如具有特定生理及病理特徵的多態性等條件下治療I型胰島素依賴型的糖尿病及其他類型的糖尿病的細胞替換。本發明的幹細胞被同樣用於內分泌胰腺及其他組織在同系移植物，同種異體移植物或異種移植物移植時的基因治療。而且，這兒所描述的幹細胞可被用於產生重組細胞，人工組織及器官替換。
他們同樣可用於體外產生胰島素及其他激素。
本發明者所發現的胰腺幹細胞的分子特徵例如nestin陽性及cytokeratin-19陰性染色，或者肝幹細胞，例如nestin陽性染色，其可被用於各種診斷，病理或調查性的方法以鑑別，定位及計量患者或實驗動物組織中幹細胞的數量。
胰島幹細胞的鑑別以前的研究都聚焦於胰島管上皮細胞或者外分泌組織作為幹細胞可能的來源以用於胰島外分泌細胞的再生。Nestin是一個中間纖維蛋白其通過從一個E15鼠胚胎使用一個單克隆抗體R.401(Hockfield McKay，1985；Lendahl et al.，1990)篩選一個cDNA文庫進行克隆。Nestin最初發現於神經上皮幹細胞且其在發育中的中樞神經系統中表達。在鼠胚胎E16中達到最高水平後，nestin表達量在成人大腦皮層降低至幾乎不可檢測的水平，其正好與早期nestin表達祖細胞的終止分化相一致(Lendahl et al.，1990)。Nestin起初僅發現於胚胎發育的腦及骨骼肌中的幹細胞中(Lendahl et al.，1990)。最近的研究表明在成人哺乳動物前腦中室管膜下層nestin陽性神經幹細胞(Morshead et al.，1994)。
Nestin陽性幹細胞已被證明其是一個多能性的甚至當其分離出成熟小鼠大腦中。例如，nestin陽性幹細胞可以產生所有三種主要類型神經細胞神經元，星形膠質細胞及少突細胞(Reynolds Weiss，1996)。Nestin陽性神經幹細胞反應脊髓的損傷是通過可以分化成為星形膠質細胞的遷移細胞的增殖及降解，其也參與疤的形成(Johansson et al.，1999)且在輸入照射鼠後儲存骨髓造血細胞(Bjornson et al.，1999)。
幹細胞的特徵按照本發明所述的幹細胞可以通過nestin的表達，例如FACS，免疫細胞化學染色，RT-PCR，DNA印跡及蛋白質印跡分析，及其他的本領域已知的細胞鑑別技術進行鑑別。
免疫細胞化學染色，例如，按照下述方法進行準備自胰腺或肝臟的Cryosections(6pM)以及細胞在磷酸溶液的4％的多聚甲醛中固定。細胞首先使用3％正常的驢血清室溫下凝固30分鐘且與最初的抗相關蛋白的抗血清在4℃下過夜孵育培養。抗血清使用PBS洗滌且在合適的螢光標記的第二抗體下室溫下孵育1小時。然後使用PBS再次洗滌斜面且使用螢光封固劑塗附斜面(Kirkegaard and PerryLabs，Gaithersburg，MD)。使用裝有界面上有一個PowerMac 7100裝有IP實驗光譜分析軟體(Signal Analytics Corp，Vienna，VA)的光學TEC-470 CCD照相機(Optronics Engineering，Goleta，CA)的Zeiss Epifluorescence顯微鏡獲取螢光圖片。
按照本發明所述的有用的抗血清包括下列抗人細胞角蛋白19(clone K4.62，Sigma，St.Louis，MO)的鼠單抗，抗鼠nestin的兔多克隆抗血清以及抗鼠IDX-1(使用純化的GST-nestin融合蛋白或鼠IDX-1最後十二個胺基酸分別免疫兔子所準備)(McManus et al.，1999，J.Neurosci.，199004-9015)的兔多克隆抗血清，豚鼠抗胰島素及抗胰腺多肽抗血清，獲自Linco，St.Charles，MO，且鼠抗胰高血糖素及兔抗生長激素抑制素，分別購買自Sigma(St.Louis，MO)及DAKO(Carpinteria，CA)，鼠抗人galanin(PeninsulaLaboratories，Belmont，CA)，角原質IV抗血清(CaltagLaboratories，San Francisco，CA)，鼠抗鼠MHC I型血清(Seroteck)，及抗鼠MHC II型抗血清。本發明預期這些指向一定標記的抗血清是可獲得的，另外的一些抗血清的使用也在本發明的保護範圍之內。
RT-PCR及DNA印跡法按照下述方法進行。獲自鼠或人胰島的總的細胞RNA被反轉錄且通過PCR擴增按照擴增的預期程度大約35個循環，正如前所述(Daniel，et al.，1998，Endocrinology，1393721-3729)。用作PCR引物或擴增引物以及RNA印跡雜交的探針的寡聚核苷酸可以為鼠nestin正向，5′gcggggcggtgcgtgactac3′
反向，5′aggcaagggggaagagaaggatgt3′；雜交，5′aagctgaagccgaatttccttgggataccagagga3′。
鼠角蛋白19正向，5′acagccagtacttcaagacc3′；反向，5′ctgtgtcagcacgcacgtta3′；雜交，5′tggattccacaccaggcattgaccatgcca3′。
Rat NCAM正向，5′cagcgttggagagtccaaat3′；反向，5′ttaaactcctgtggggttgg3′；雜交，5′aaaccagcagcggatctcagtggtgtggaacgatgat3′。
Rat IDX-1正向，5′atcactggagcagggaagt3′反向，5′gctactacgtttcttatct3′雜交，5′gcgtggaaaagccagtggg3′人類nestin正向，5′agaggggaattcctggag3′；反向，5′ctgaggaccaggactctcta3′；雜交，5′tatgaacgggctggagcagtctgaggaaagt3′。
人類角蛋白正向，5′cttttcgcgcgcccagcatt3′；反向，5′gatcttcctgtccctcgagc3′；雜交5′aaccatgaggaggaaatcagtacgctgagg3′。
人類胰高血糖素正向，5′atctggactccaggcgtgcc3′；反向，5′agcaatgaattccttggcag3′；雜交，5′cacgatgaatttgagagacatgctgaaggg3′；人E-Cadherin正向，5′agaacagcacgtacacagcc3′反向，5′cctccgaagaaacagcaaga3′
雜交，5′tctcccttcacagcagaactaacacacggg3′人transthyretin正向，5′gcagtcctgccatcaatgtg3′反向，5′gttggctgtgaataccacct3′雜交，5′ctggagagctgcatgggctcacaactgagg3′人胰澱粉酶正向，5′gactttccagcagtcccata3′反向，5′gtttacttcctgcagggaac3′雜交，5′ttgcactggagaaggattacgtggcgttcta3′人羧肽酶原正向，5′tgaaggcgagaaggtgttcc3′反向，5′ttcgagatacaggcagatat3′雜交，5′agttagacttttatgtcctgcctgtgctca3′人Synaptophysin正向，5′cttcaggctgcaccaagtgt3′反向，5′gttgaccatagtcaggctgg3′雜交，5′gtcagatgtgaagatggccacagacccaga3′人類肝實質細胞生長因子(HGF)正向，5′gcatcaaatgtcagccctgg3′反向，5′caacgctgacatggaattcc3′雜交，5′tcgaggtctcatggatcatacagaatcagg3′人cMET(HGF-receptor)正向，5′caatgtgagatgtctccagc3′反向，5′ccttgtagattgcaggcaga3′雜交，5′ggactcccatccagtgtctccagaagtgat3′人XBP-1正向，5′gagtagcagctcagactgcc3′反向，5′gtagacctctgggagctcct3′
雜交，5′cgcagcactcagactacgtgcacctctgca 3′人Glut-2正向，5′gcagctgctcaactaatcac 3′反向，5′tcagcagcacaagtcccact 3′雜交，5′acgggcattcttattagtcagattattggt 3′人胰島素正向，5′aggcttcttctacaca 3′反向，5′caggctgcctgcacca 3′雜交，5′aggcagaggacctgca 3′其他的一些這樣的一些序列是可能的且這些序列被認為在本技術方案的範圍之內。正如普通教導，選自兩個不同外顯子的引物其包含至少一個內含子序列。此外，一個RT負對照也用於許多樣品。PCR擴增在94℃下1分鐘隨後再在94℃下10秒鐘，58/56℃下10秒，72℃下1分鐘，35個循環，及在72℃下2分鐘。退火溫度是58℃對於鼠nestin來講且對於其他的引物鹼基對來講為56℃。
對於分離自非鼠或人的哺乳動物的mRNA的RT-PCR，特異於來自要準備分析的哺乳動物種的擴增核酸的寡聚核苷酸。這些引物的選擇及使用為本領域技術人員所共知。
對於DNA雜交寡聚核苷酸探針使用合適的放射性核來進行標記，例如y32PATP，其使用傳統的技術。
放射性標記探針在37℃下雜交於轉移進入尼龍膜的PCR產品一小時，然後在1×SSC+0.5％SDS在55℃下洗滌10-20分鐘或在0.5×SCC+0.5％SDS在42℃下對於人類的PCR產品。
Nestin作為胰腺幹細胞的標記發明家已經出乎意料地發現成人哺乳動物包括人類的胰臟含有表達nestin的細胞。重要的是，nestin陽性細胞在胰臟中的分布並不相應於激素產生細胞。例如特異性反應與胰島素或胰高血糖素的螢光標記抗體分別標記有胰島的β及α細胞，其中發明者已經發現在老鼠及人類中螢光標記的nestin抗體僅位於管上皮的某些細胞中且並不是α，β，delta，及產生於胰島的胰臟多肽(圖1)。發明者同樣發現特異於膠原質IV的抗體，動脈管endothelial細胞galanin，神經末梢的一個標記及細胞角蛋白19，管細胞的一個標記，其並不共位於nestin抗體。此外，發明家已經發現nestin陽性胰島細胞並不與抗胰島素，胰高血糖素，生長激素抑制素或者胰多肽共標記(圖1)。這表明這些nestin包含細胞並非內分泌細胞，管細胞，神經細胞或者動脈endothelial細胞，但是其卻代表一個先前並未描述的胰島中的真正獨特的細胞類型。發明者已經發現胰島中的nestin陽性細胞正如胰臟導管中的其他區域一樣且位於外分泌胰臟的centroacinar區域。
nestin mRNA在胰島中的表達通過使用RT-PCR使用分離自鼠胰島的RNA(圖2)進行檢測。nestin陽性胰臟細胞的功能性特點使用通過從胰島中分離出nestin陽性細胞且細胞培養技術進行檢測，這些下面進一步描述。
發明家同樣發現了鼠肝含有可以表達nestin的細胞(圖13)。
細胞角蛋白-19作為管上皮細胞截然不同的細胞特徵的標記細胞角蛋白-19(CK-19)是另一種中間纖維蛋白。CK-19及相關的細胞角蛋白先前已經被發現在胰臟導管細胞中表達(Bouwens etal.，1994)。發明家已經發現，雖然如此但是CK-19表達限制於小導管，特異於CK-19的螢光抗體完全不同於nestin特異性抗體標記的導管細胞。這表明胰島中的nestin陽性細胞可能是一種很特別的導管細胞類型其不同於CK-19陽性細胞。
從胰島中分離幹細胞及其用途幹細胞可分離自準備的胰腺組織，例如，獲自糖尿病患者組織的活組織切片的胰島。幹細胞然後被體外擴展然後結果產生的移植細胞再回到供體作為移植物。在供體內，其可以分化成為胰島素分泌細胞例如β細胞以取代可因自身免疫反應導致糖尿病的β細胞丟失。該方法可以克服來自於移植組織的免疫排斥問題，例如，來自於另一可能作為供體的個體的胰島。在本發明的一個技術方案中，同系移植幹細胞的使用促使開發別的方法以避免免疫排斥，也就是移植細胞的基因治療以實施其對免疫排斥的抵抗，例如I型糖尿病中的自身免疫性疾病。在整個胰島中使用幹細胞的一個優勢是移植幹細胞可以原位分化以更好地適應寄主細胞的環境，例如提供合適的微循環及反應於寄主生理需要的不同胰島細胞類型的互補。本發明另一個技術方案中設計了部分分化幹細胞體外的用途，例如，形成祖細胞，其進一步被移植進入寄主再在寄主中選擇性進一步分化。儘管幹細胞，祖細胞或假胰島細胞同系移植物的用途，另一個技術方案也設計了獲自其他的個體或種的哺乳動物的幹細胞，祖細胞或假胰島細胞的同種異體移植物。
在本發明的另外的技術方案中，幹細胞是免疫盲的或免疫優先的。在本發明的一個技術方案中，免疫優先的幹細胞並不表達足夠量的I型和/或II型主要組織相容性抗原(a.k.a.HLA或者人類白細胞抗原)以誘導來自寄主的免疫反應。例如，這些幹細胞獲自同種異基因或異種異基因來源其在免疫活性的移植受體中並不誘發寄主抗移植物反應。
在本發明的另外的技術方案中，免疫優先的幹細胞並不表達I型MHC抗原和/或II型MHC抗原。這些幹細胞，獲自同種異基因或異種異基因來源的其在免疫活性的移植受體中並不誘發寄主抗移植物反應。
在本發明的另外的技術方案中，人類組織移植物包括表達人類特異性的I型和II型MHC抗原的幹細胞，但是卻為免疫活性鼠本身所識別而且並不忍受寄主對移植物的排斥。這些幹細胞，獲自同種異基因或異種異基因來源的其在免疫活性的移植受體中並不誘發寄主抗移植物反應。
本發明同樣提供了從異種異基因供體中分離幹細胞及將結果的幹細胞移植進入其他種的哺乳動物細胞中去的方法(例如鼠幹細胞被移植進入人體例如一個人糖尿病患者)作為異種移植物。
本發明提供了進行nestin陽性幹細胞的同基因，同種異基因，及異源異基因的移植方法其特徵在於幹細胞在移植前已被培養了很長一段時間，例如，2-4小時，4-5小時，5-10小時或1-3天。
本發明同樣提供了進行nestin陽性幹細胞的同基因，同種異基因，及異源異基因的移植方法其特徵在於幹細胞在移植前已擴展了一段時間，例如，2-4小時，4-5小時，5-10小時或1-3天通過細胞分化成為其他的幹細胞或祖細胞。
本發明同樣提供了幹細胞的同基因，同種異基因，及異源異基因的移植方法其特徵在於nestin陽性幹細胞通過使用選自下列組份的組的試劑EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，IDX-1，編碼IDX-1的一個核酸分子，GLP-1，exendin-4，betacellulin，activinA，TGF-，或其組合在移植前一段時間例如2-4小時，4-5小時，5-10小時或1-3天誘導其分化成為祖細胞。以胰臟幹細胞為例，幹細胞最終分化成為胰臟祖細胞。
本發明同樣提供了同基因，同種異基因，及異源異基因的移植方法其特徵在於nestin陽性幹細胞在移植前並不培養擴展或分化成為祖細胞或者其特徵在於nestin陽性幹細胞在移植前被培養和/或擴展和/或分化。
Nestin陽性細胞在來自分離胰島的培養物中被增殖隨後被分離以形成可以無限增殖的幹細胞系。
發明家發現了nestin表達細胞在培養胰島中生長且在培養後4天就發現在其周圍生長。這些細胞具有神經元類似的形態(圖3)，表現出nestin陽性染色，且表達nestin mRNA。含有nestin陽性細胞的胰島也可分離自其他細胞，例如纖維原細胞其通過使用伴刀豆球蛋白培養胰島使其增殖。這些含有nestin陽性幹細胞的胰島將不再粘附在伴刀豆球蛋白包覆的容器表面例如，這樣可使胰島被簡單移出而其他類型細胞卻被粘附在容器上。胰島然後被移至不含伴刀豆球蛋白包覆的容器中。以鼠細胞為例的具體的培養及分離方法詳見實施例1所述。相似的結果獲自人類細胞。
培養物中假胰島及導管結構的形成本發明的一個技術方案提供了通過使其形成假胰島類似聚合體以至於可被移植進入胰島細胞數量在不給予激素治療時不足以維持正常的生理學調控的患者移植幹細胞或祖細胞的替代途徑。胰島衍生幹細胞可如上所述獲自培養物胰島或獲自增殖的幹細胞系。將幹細胞暴露於不同的生長因子條件下以誘導其分化，這個過程在實施例2和3中進行描述。
幹細胞或祖細胞分化成為胰島細胞可以誘導胰臟幹細胞分化的生長因子包括但並不限於EGF-2，鹼性FGF，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，betacellulin，activin A，TGF-P，及其組合。
GLP-1指的是胰高血糖素類似的多肽-1。高葡萄糖指的是比培養幹細胞所使用的正常的濃度要高的葡萄糖濃度。例如，幹細胞在大約5.6mM濃度葡萄糖下可以正常培養及增殖，而高葡萄糖濃度指的是另外的高於5.6mM的葡萄糖濃度。在一個優選的技術方案中，設計了一個16.7mM的葡萄糖濃度。在實施例2中，可能還要使用這樣的生長因子如鹼性纖維生長因子(bFGF)及上皮生長因子(EGF)。
在培養基中除了加入生長因子之外還包括在幹細胞被移植進入動物或人體時其他有助於分化的生長因子。在這種情況下許多生長因子不管是已知的還是未知的都能被內生細胞所分泌且暴露於幹細胞周圍。移植幹細胞通過內源或外源給予的與預期目標也就是說最終的分化的細胞類型或形成的解剖學特徵(如組織或器官)相適應的生長因子的任意組合誘導其分化。
一個技術方案提供了一個刺激分化的方法給予生長因子的下遊感受器或使用編碼該感受器的核酸分子轉染幹細胞或祖細胞。一個例子是IDX-1，其是一個可為GLP-1或exendin-4誘導的轉錄因子。
引入的感受器例如IDX-1可以引發分化以形成內分泌胰島細胞。
移植排斥分析本發明提供了一個體內評估移植物質存活的方法。按照本發明通過移植一個幹細胞或一個假胰島類似性聚合體入一個免疫抑制的或非免疫抑制的哺乳動物分析實驗性移植排斥反應。
例如，非免疫抑制的C57BL/6小鼠按照本發明被使用人類幹細胞移植(例如在腎囊中)，通過犧牲移植受體且對存活移植物染色或在移植物上(例如移植物上的一個器官或組織)在移植後合適的時間點進行免疫細胞化學染色對移植排斥進行分析。在該時間點對移植物的染色(例如蘇木精/曙紅或免疫染色)可以變化，例如按照移植哺乳動物平均的存活時間或預期的存活時間。通過染色分析移植位點，移植後1天至10年(例如，1，5，10，30，100或更多天，1，2，5，或10年)，最好是10天至1年且更好是10-100天。例如，如果移植物質在鼠腎囊中被引入，檢查移植鼠的腎。如果移植物質被檢測到和/或移植物質在組織中進行增殖的話說明移植物被成功移植(也就是說沒有被排斥)。
移植物的增殖及檢測例如通過準備自移植位點的冷凍部分(例如腎)的蘇木精/曙紅染色及並不起源於移植受體的新生長(例如不是寄主腎獲得的)的檢測進。在異種移植的情況下，使用特異於獲自移植物起源的種的抗原的抗血清進行的特異性的免疫染色的話移植物被成功移植，按照本領域已知的且這兒所描述的免疫細胞化學染色方法鑑別陽性細胞。此外，在一個技術方案中進行的異種移植，如果獲自移植種的(從其中移植物質所獲得的種)分子(例如蛋白或抗原)在移植受體的血液中檢測到的話移植物被成功移植。
正如這兒所使用到的，＂排斥＂指的是寄主免疫系統對移植物的排斥。在一個技術方案中，「排斥」意指移植物中有超或90％的細胞或組織因為寄主免疫反應壞死的發生。在另一個技術方案中，「排斥」意指生存能力的降低也就是說因為寄主的免疫反應移植物中有90％甚至更多與移植前相比較生存能力降低。生存能力的降低可通過本領域已知的技術檢測到，包括但並不限於trypan藍專一染色。在另一個技術方案中，「排斥」意指移植物增殖的失敗。增殖可通過本領域已知的技術包括但並不限於蘇木精/曙紅染色檢測到。移植排斥的發生和/或移植後排斥發生的速度將因各種因素而變化，包括但並不限於移植物質(例如細胞類型或細胞數量)或寄主(也就是說不管寄主是免疫不容性的和/或使用免疫抑制劑處理過的)。
移植方法本發明提供了移植進入哺乳動物的方法。一個幹細胞，祖細胞或分化細胞被「移植」或「引入」進入一個哺乳動物細胞當期從培養器皿中進入患者時。
按照本發明，移植包括按照本發明所述分離幹細胞的步驟且轉移幹細胞進入哺乳動物或患者的步驟。按照本發明，移植還涉及到轉移幹細胞進入哺乳動物或患者通過注射細胞懸液進入哺乳動物或患者的途徑，外科輸入哺乳動物或患者的組織或器官的細胞，或使用細胞懸液注入組織或器官。轉移幹細胞或移植的路徑，將按照細胞在特定組織或器官中的位置需要及細胞發現且滯留在預期目標組織或器官位置的能力確定。當移植細胞停留在特定的位置時，其可以通過外科手術方法進入組織或器官或簡單地注入到血漿中去如果細胞具有移動至目標靶器官的能力的話。按照本發明所述的移植包括分離幹細胞的步驟以及培養且轉移幹細胞進入哺乳動物或患者體內去的步驟。在另一個實施例中，這兒所使用的移植還包括分離幹細胞，分化幹細胞，轉移幹細胞進入哺乳動物或患者體內去的方法。這兒所使用的移植還包括按照本發明分離幹細胞，分化及擴展幹細胞且轉移幹細胞進入哺乳動物或患者體內去的方法。
使用胰臟幹細胞治療胰島素依賴型糖尿病患者的方法幹細胞對於取代I型糖尿病患者的喪失的β細胞或提高II型糖尿病患者的β細胞的總的數量是非常有用的。糖尿病患者更適宜作為用於產生幹細胞，祖細胞或假胰島類似物聚合體的供體。幹細胞存在成人胰島或胰臟導管。對糖尿病患者進行活組織檢查後，從活組織中分離出胰島且體外準備24小時，幹細胞然後使用上述方法在2-3周內分離且增殖。分離後或經過一段時間生長因子誘導的分化幹細胞可被直接移回患者。胰島可通過如實施例2所述的亞培養產生。胰臟外科手術活組織分析的整個過程在大約30天內進行。
在本發明的一個技術方案中可用到多功能幹細胞。這些細胞是免疫盲的或免疫優先的例如在異源或異種移植物中，其可以被受體作為自身識別而不是限制於I型或II型抗原的MHC。在本發明該技術方案的一方面，這些細胞並不表達MHC型和/或II型抗原。
在本發明另一個技術方案中，移植物受體可以證明寄主對其它移植細胞的移植排斥其可以通過給予抗體激起反應，例如一個自身抗原如GAD65，通過給予一個或多個這裡所述的免疫抑制劑或使用本領域已知的技術以預防或減緩自身免疫排斥反應。
此外，按照本發明分離自非人哺乳動物的幹細胞移植進入人糖尿病患者。在移植步驟之前，幹細胞可被培養和/或擴展和/或分化。
使用胰臟幹細胞治療肝病患者的方法胰臟幹細胞或祖細胞分化形成肝實質細胞的能力是眾所周知的(Bisgaard Thorgeirsson，1991)。本發明的胰臟幹細胞可以用於提供肝實質細胞以治療肝病患者所遭受的肝病例如cirrosis，肝炎，或肝癌其中功能性肝組織已經被減少。本發明所述的幹細胞同樣可被經過基因治療處理遺傳缺陷並引入患者恢復肝功能。Nestin陽性幹細胞可以在培養物中被分化也可在體內使用一個或多個生長因子或其它的處理例如使用核酸分子轉染其結果是幹細胞分化形成肝實質細胞。在一個技術方案中，發明設計了使用cyclopamine以抑制例如sonichedgehog，結果使得肝實質細胞形成。在本發明另一個技術方案中，幹細胞可不經過任何體外處理移植且在患者體內使用合適的生長因子。在另一個技術方案中，幹細胞使用生長因子或其它試劑體外處理結果以部分分化或結果分化的狀態移植進入患者。在發明的另一個方面，包括轉染幹細胞或祖細胞的方法，注射的劑量及途徑，藥物組合物，供體一同系移植物的方法及免疫抑制方法可用與反分化為肝實質細胞就像分化為胰臟組織一樣。
本發明專門設計了移植進入患者的同基因移植，異基因移植或異種異基因移植幹細胞或其組合。
幹細胞轉染的方法有不同的方法基因轉移進入胰臟幹細胞。磷酸鈣沉降DNA法已被使用但轉化效率很低，尤其是對非粘附性細胞來講。此外，磷酸鈣沉降DNA法經常導致多種反覆子的插入，增加了內外源DNA功能的損害的可能性(Boggs，1990)。陽離子脂類例如以脂質體的形態，同樣是包裝DNA以轉染真核細胞的有效方法且幾種商業陽離子脂類試劑也是可獲得的。電穿孔法相比較磷酸鈣沉降法提高了轉化效率，其具有在基因組單一位點提供單一拷貝插入子的優勢。DNA直接微注射進入細胞核是另外一種基因轉移的方法，其已經顯示可提供對於短期轉染來講將近100％的效率且對於穩定的DNA整合有20％的效率。微注射有時避免了外源DNA通過細胞質的細胞運輸的問題。該方法要求轉移物體積要小，其還要考慮到在每細胞中引入已知量的DNA。獲取事實上較純的幹細胞的能力將提高微注射途徑用於靶定胰臟幹細胞基因修飾的可行性。儘管如此，微注射也是一項沉悶的，高度專一的技術。該技術的這一特徵限制了在一定時間內注射進入細胞的數量，因此其在大範圍內的使用是很受限制的。是用逆轉錄病毒的方法將基因插入胰臟幹細胞是較為理想的方法。逆轉錄病毒提供了一個任意的，單拷貝的單位點插入子且轉染效率很高。其它的一些轉染方法對於本領域技術人員來講是已知的且被認為是在本發明的保護範圍之內。
胰臟幹細胞的逆轉錄病毒轉化胰臟細胞基因轉化涉及到逆轉錄病毒也作「輔助病毒」(也就是說，膜缺陷型病毒基因組其攜有相關外源基因但是不能形成完整的病毒顆粒)。例外的載體例如DNA介導的轉移，腺病毒，SV40，腺病毒相關病毒，及單純皰疹病毒載體也可被用到。當選擇不同的載體用於轉染時要考慮到各種因素，有時最好使用一個病毒長末端重複子或者一個強的內源啟動子以表達外源基因而不是簡單依靠拼接的亞基因簇RNA。
幹細胞轉化的兩種最基本的方法是共培養或上清感染。上清感染涉及到將幹細胞重複暴露於病毒上清液中。共培養涉及到幹細胞及一感染的「組裝細胞系」(參見下面)混合24-48小時，共培養一般要較上清感染對於幹細胞轉化來講更為有效。共培養後，感染的幹細胞進一步被培養以建立一個長期培養物(LTC)。
含有輔助病毒的細胞系指的是包裝細胞系，不同的包裝細胞系也是可獲得的。包裝細胞系的一個重要的特點是其並不能產生複製完整的輔助病毒。
在本發明的一個技術方案中從中獲得幹細胞的動物或患者在抽取幹細胞前使用5-fluorouracil(5-FU)對其進行處理，相比較未處理的細胞來講，5-FU處理的幹細胞更易於逆轉錄病毒的轉染。然而，5-FU幹細胞很大程度地減少了克隆基因起源的數量。
在另一個技術方案中，收穫的幹細胞暴露於不同的生長因子條件下，例如那些用於提高胰臟幹細胞增殖及分化的生長因子。生長因子在轉染之前，其中或之後被引入培養物以提高細胞的複製及轉導。研究表明生長因子的使用提高了轉化效率從30到80％不等。
典型的逆轉錄病毒轉化方案哺乳動物胰臟幹細胞的體外轉導及隨後移植進入未被切除的受體以充分獲得可能的移植及基因表達在含有已顯示於小鼠的後裔細胞的不同組織中。靶細胞在輸入受體之前在含有相關基因的合適載體的存在下培養2-4天。
更確切地講，骨髓幹細胞獲自雄性供體(4-8周年齡時)BALB/cAnNCr小鼠(National Cancer Institute，Division of Cancer TreatmentAnimal Program，Frederick，MD)。這些細胞被培養在一個密度為1-2×107cells/10cm的平皿上且在含有10％熱失活的牛胎血清，穀氨酸鹽，Pen/Strep，100U/ml的白細胞介素-6(IL-6)及以激活細胞生長的幹細胞因子(SCF；Immunex，Seattle，WA)(Schiffmann，et。al.，1995)的DMEM培養基上培養48小時，
與此同時，培養一個病毒包裝細胞系24小時，該包裝細胞係為Schiffmann，等所使用。其為GP+E86且病毒載體為基於逆轉錄病毒載體LN系列的LG逆轉錄病毒載體。
經過一段合適的培養時間，1-2×107幹細胞被培養在一個10cm的含有病毒包裝細胞的平皿上然後在8g/ml polybrene的存在下共培養48小時然後在相同的生長因子刺激的環境下其作為供體幹細胞。收穫該幹細胞，洗滌生長培養基注入受體鼠以2×107細胞/注射的劑量並進行多次注射(總共5次以每天或每周計)。
幹細胞的轉導及移植的成功可通過例如PCR分析，免疫細胞化學染色，DNA印跡法或蛋白質印跡法或其它本領域已知技術來進行。
哺乳動物本發明所述的哺乳動物可以是任意哺乳動物(例如，人，小鼠，鼠，綿羊，兔子，山羊，猴子，馬，東歐鼠，豬或牛)。本發明所述非人哺乳動物可以是任意非人哺乳動物包括但並不限於小鼠，鼠，綿羊，兔子，山羊，猴子，馬，東歐鼠，豬或牛。
給予的劑量及模式作為一個例子，這兒所述的需要胰臟幹細胞的患者可以如下進行處理，本發明的細胞可被給予患者，最好以生物學上適宜的溶液形式或藥物學上可接受的輸入載體，通過攝取，注射，吸入或其它的一些方法。一個可行的方法是內向倒退注射。另外的方法是注射或取代細胞或假胰島類似性聚合體進入腎囊中。給予的藥劑量可因患者而不同，一個「治療有效性劑量」可被確定，例如但不限於通過功能性增強的水平(例如，胰島素產量或血漿葡萄糖水平)。幹細胞引入水平的監控，由該轉移影響的某些基因的表達水平，和/或編碼產品的存在及表達，同樣也使得本領域技術人員選擇及調整給予的劑量。一般來講一個含有幹細胞的藥物組合物以105-108，最好是106-107個細胞每公斤體重的範圍以單一劑量給予患者。這些劑量可以以每天，每周，每月，每年計或者由治療醫師確定合適的劑量。本發明提供了同樣可被移出患者體內的細胞群體或者通過體外擴展，使用含有預期治療基因的質粒轉染，然後再重新輸入患者體內。
藥物組合物本發明提供了包含如本發明所述幹細胞混合有生理學上可接受載體的藥物組合物。正如這兒所使用的，＂生理學上適宜的載體＂指的是生理學上可接受的稀釋劑例如水，磷酸緩衝鹽或鹽及進一步包括佐劑，佐劑例如有不完整的傅氏佐劑，正磷酸鋁，氫氧化鋁，以及明礬等本領域已知的物質。
本發明同樣也提供了藥物組合物。除了活性成分以外，這些藥物組合物還包括合適的藥學載體其可以被藥理學上使用。
用於口服的藥物組合物可使用本領域已知的適於口服的藥物載體一起包裝。這些載體使得藥物組合物以片劑，藥丸，糖衣，膠囊，液體，凝膠體，糖漿，漿液，懸浮液及其類似的形式為患者所攝取。
用於口服的藥劑可通過結合活性成分與固體賦形劑，加入合適的輔助劑後，例如為了獲得片劑或糖衣核心混合後選擇性碾磨，處理混合細粒。相應的賦形劑可為糖類或蛋白類例如糖包括乳糖，蔗糖，甘露糖或山梨糖糖，玉米澱粉，小麥，大米，馬鈴薯及其他植物；維生素例如甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，或者羧甲基纖維素鈉；以及橡膠包括阿拉伯膠及黃芪膠；以及蛋白例如凝膠及膠原質。如果需要，加入溶解劑或分解劑例如交聯的乙烯聚合物pyrrolidone，瓊脂，褐藻酸，或其鹽例如藻酸鈉。
所提供的糖衣核心具有合適的糖衣例如濃縮的糖溶液，其也含有阿拉伯樹膠，雲母，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，carbopol凝膠，聚乙二醇，和/或二氧化鈦漆溶液，及合適有機溶液及溶液混合物。染料或色料加入到片劑中或糖衣上用於產品識別或表明活性成分的數量例如劑量。
可被用於口服的藥物製劑包括由凝膠製成的推入契合膠囊以及軟的由凝膠製成的封閉膠囊一樣以及衣被甘油或山梨糖醇。推入契合膠囊包括混有諸如乳糖或澱粉的添充劑，諸如雲母或硬脂酸鎂的潤滑劑以及可選擇性的穩定劑的活性成分。在軟的膠囊中，活性化合物可被溶解或懸浮在合適的液體中例如油脂，液體石蠟或液體聚乙二醇有或無穩定劑。
腸胃外投藥的藥劑包括活性成分的液體溶液。對於注射，本發明的藥物組合物可以溶液形式，最好在生理學上適宜的緩衝劑例如Hank′s溶液，Ringer′溶液，或生理緩衝鹽的存在下製成。液體注射懸浮液可以包括可提高懸浮液粘度的物質例如羧甲基鈉纖維素，山梨糖，或右旋糖酐。此外，活性溶劑或載體的懸浮液包括油脂例如香油，或合成的脂肪酸酯例如乙基油酸鹽或甘油三酸酯，或脂質體。可選擇地，該懸浮液也包括適宜的穩定劑或可以提高化合物溶解度以形成高濃度溶液的化合物。
對於鼻給藥形式，適於特定屏障的滲透劑在製藥時考慮使用，該滲透劑對於本領域技術人員來說均為已知。
本發明的藥物組合物可以本領域已知技術生產例如通過傳統的混合，溶解，粒化，糖衣製備，懸浮，乳化，形成膠囊，包載及凍幹途徑。
藥物組合物可以鹽的形式提供也可以許多酸的形式形成，包括但不限於鹽酸，硫酸，醋酸，乳酸，酒石酸，蘋果酸，琥珀酸等等。適宜在液體情況下更易溶解的鹽及其他的質子溶劑其也具有相應自由的鹼基。在另外的情況下，首選的試劑也可以是一凍幹的乾粉其在lmM-50mM組氨酸，0.1％-2％蔗糖，2％-7％甘露醇在PH值4.5至5.5其在使用前使用緩衝液混合。
在含有本發明化合物的藥物組合物以一合適載體形成完成時，其可放置於合適的容器標籤上給藥的條件包括數量，頻率及途徑。
上述基本描述了本發明，其通過下述實施例可以更好地完整理解，其在這裡僅僅是證明本發明而不是限制本發明的範圍。
實施例1從鼠胰臟中分離Nestin陽性幹細胞鼠胰島分離自2-3個月的老的Sprague-Dawley鼠使用如Lacy及Kostianovsky所述的膠原酶溶解的方法。人體胰島由糖尿病研究所，邁阿密，FL提供使用膠原酶溶解法獲得。胰島在37℃下在12孔平板培養96小時(Falcon 3043 plates，Becton Dickinson，LincolnPark，NJ)在該平板上塗覆有伴刀豆球蛋白A。培養基為RPMI 1640補充有10％牛胎血清，1mM丙酮酸鈉，10mM HEPES緩衝液，100μg/ml鏈黴素，100units/ml青黴素，0.25μg/ml兩性黴素B(GIBCOBRL，Life Science Technology，Gaithersburg，MD)，及71.5mMβ巰基乙醇(Sigma，St。Louis，MO)。
96小時後，纖維原細胞及其他非胰島細胞粘附在伴刀豆球蛋白A塗覆的培養孔表面上而胰島在漂浮(並未附在表面)。這時，含有胰島的培養基被移走，離心分離，將純化的胰島重新種植在沒有伴刀豆球蛋白A塗覆的12孔平板上。胰島然後在上述RPMI1640培養基補充有20ng/ml鹼性纖維原細胞生長因子-2及20ng/ml上皮生長因子下培養。
粘附在平板表面的胰島及長出且離開胰島的細胞在一個單層。這些形成單層的細胞使用麻州普通醫院的Dr。Mario Vallejo所創立的兔抗鼠nestin抗血清免疫染色為nestin陽性。另外的nestin抗體也可能被用到，例如這兒所述的R.401抗體，或MAB533抗體。特異於鼠胚胎脊髓nestin的單抗，MAB353，ATCC No.1023889；描述於神經系統科學雜誌1996；161901-100；其同樣可獲自ChemiconInternational，Single Oak Dr.，Temecula，CA 92590 USA。培養後兩周，幾個(3-5)nestin陽性單層細胞通過毛細管採摘移出(cylinder cloning)且在12孔平板上重新種植(其上不再塗覆有伴刀豆球蛋白A)且培養在RPMI1640培養基進一步補充有bFGF-2及EGF。細胞以很快的速度進行增殖且培養後六天覆蓋平板。培養後12天細胞單層形成波動其中其開始以co-linear型式疊加。培養第15天，細胞波開始濃縮，移入球形體後在第17天形成含有球形體的孔表面(ca.直徑為100μm)，中空，一部分保留有單層細胞，重新挑選幾個這樣的單層細胞且重新克隆，然後上述途徑在相同的時間段再次進行。
實施例2胰腺幹細胞分化形成胰島鼠胰島首先在含有10％的牛胎血清的RPMI培養基上在伴刀豆球蛋白A包覆的12孔平板上培養，胰島在除了牛胎血清外未加入培養因子的情況下培養三天。經過這個期間，其中胰島並未粘附，胰島被轉移至不含伴刀豆球蛋白A的新的平板。
幹細胞然後通過暴露其於bFGF-2(20ng/ml)及EGF(20ng/ml)24天被刺激從幹細胞中增殖形成單層。24天以後，單層達到豐度其中圍繞著胰島的是一群細胞，這些細胞被挑選然後被亞克隆進入新的12孔平板並再次在含有bFGF及EGF的培養基中培養。
亞克隆快速以無性繁殖的形式增殖進入單層，並從中心向外延擴展。細胞在第6天達到豐度並在第12天重疊細胞波。在第17天細胞幾乎被全部移植進入球形結構體及關係型結構體等胰島類似結構(假胰島類似聚合體)及管狀類似結構(假導管)(圖4)。RT-PCR分析表明假胰島類似聚合體表達NCAM(內分泌細胞的一個標記，參見圖5)，細胞角蛋白19(導管細胞的一個標記，參見圖5)，以及轉錄因子brain-4(一個貝塔細胞標記)。使用生長因子處理以實現其最終分化成為成熟胰島細胞的目的。
實施例3人或鼠胰島的分離及培養分離及培養人類胰島，人類胰島組織獲自細胞移植中心，糖尿病研究所，邁阿密大學醫學院哈佛醫學院，Boston，MA的用於胰島移植的青少年糖尿病基金的胰島分配程序，手工挑選徹底洗滌的胰島，在修飾的RPMI1640培養基(11.1mM葡萄糖)補充有10％牛胎血清，10mM HEPES緩衝液的，1mM丙酮酸鈉，100U每mL青黴素G鈉鹽，100μg/mL鏈黴素硫酸鹽，0.25ng/mL兩性黴素B，及71.5uMβ巰基乙醇，及加入鷹3043且包覆有伴刀豆球蛋白A(ConA)的12孔組織培養平板。胰島在37℃下在有5％空氣及5％CO2下孵育96小時。在這種條件下，更多的胰島依然保留在懸浮液中(漂浮)，而纖維原細胞及其他的非胰島細胞黏附在培養基上，孵育後96小時，含有懸浮胰島的培養基被小心移出，手工挑選胰島然後在修飾的RPMI1640補充有20ng/mL鹼性纖維原細胞生長因子(bFGF)及上皮生長因子(EGF)中重懸浮。胰島懸浮液(包含有20-30個胰島的平板)被加入到12孔並不附有ConA的組織培養平板上，胰島快速黏附在平板表面。
在幾天內，發現細胞單層從胰島中長出。在有些情況下，人源細胞被培養在含有2.5mM葡萄糖及幾種包括activin-A(2nM)，肝實質細胞生長因子(100pM)，或betacellulin(500pM)的生長因子的組合的修飾的RPMI培養基中培養。這些實驗中細胞使用10mM菸鹼處理，培養基不含有血清及生長因子。
實施例4葡萄糖及GLP-1對胰腺幹細胞分化的影響。
可使胰島尺寸增加的血漿葡萄糖濃度的評估。培養基中葡萄糖的濃度使用含有nestin陽性幹細胞的分離的胰島來調查。鼠胰島被培養在含有高葡萄糖濃度(16.7mM)的培養基或正常的(5.6mM)葡萄糖濃度中。四天後，使用RT-PCR確定nestin mRNA的水平。結果表明與正常葡萄糖濃度培養的胰島相比高濃度葡萄糖濃度培養下的胰島nestin mRNA的水平提高了3倍(圖6)。
類似的，注入glucagon類似的多肽-1(GLP-1)進入小鼠發現48小時後胰島數提高了2倍。具有編碼GLP-1受體的分裂的基因的暈的小鼠再次檢查其胰島nestin的表達。
使用一nexin抗體進行的免疫染色被發現可以大大減少其與正常小鼠的GLP-1受體相比較。
糖尿病動物模型給予結果是其症狀的減少的糖尿病類型的治療在一個其可展示糖尿病症狀的動物中進行測試。所設計的進行試劑或方法測試的動物有益於人體的糖尿病的治療。糖尿病的潛在治療首先在動物模型中測試並觀察其效果並比較其與未處理的對照組的區別。
非肥胖的糖尿病(NOD)小鼠對於I型糖尿病或胰島素依賴的糖尿病來說是重要的(參見Kikutano and Makino，1992，Adv.Immunol.52285 and references cited therein，herein incorporated by reference)。在NOD小鼠中I型糖尿病的發展不需要外界的任何刺激可以自然發生也可突然發生，當NOD小鼠發展糖尿病時，其遭到β細胞的程序性破壞其由慢性自身免疫性疾病所致。在NOD小鼠中胰島素依賴型的糖尿病的發展可以被大概分為兩個階段自身免疫刺激的誘發(胰島中淋巴細胞感染)及胰島破壞的加速並爆發糖尿病。糖尿病NOD小鼠以euglycemia開始其生命，或正常的血液葡萄糖水平，但是在大約過了15至16周時NOD小鼠開始變成hyperglycemic，表明其大部分胰腺β細胞的破壞且胰腺喪失產生足夠量的胰島素的能力。除了胰島素缺乏及多糖症外，糖尿病NOD小鼠也要遭受嚴重的糖尿，polydypsia，及多尿症，伴隨有體重的快速減少。這樣，該疾病的發生及進程非常相似於遭受胰島素依賴型的糖尿病的人體患者。自然康復很少發生於NOD小鼠上，且這些糖尿病動物在糖尿病發生後1-2個月如果不接受胰島素治療的話均死去。
NOD小鼠被用作動物模型以測試按照本發明給予幹細胞治療糖尿病的不同方法的有效性。同樣地，通過給予幹細胞治療在NOD小鼠中也進行測試以驗證其對I型糖尿病的有效性。
幹細胞被給予一個NOD小鼠，一般是通過腹腔進行，按照下述的劑量。NOD小鼠被給予大約每個小鼠1×101至1×104個細胞每小鼠。在NOD小鼠中在大約4周給予小鼠，然後從8至10周，每周3次。用於檢測糖尿病的小鼠在大約13周時開始，按照下述方法一周兩次。治療效果可比較處理及未處理的NOD小鼠得出。
在NOD的小鼠中對糖尿病的治療效果可通過分析NOD小鼠中糖尿病進行其使用本領域已知技術，例如，檢查NOD小鼠是否多渴，多尿，糖尿，多糖症及胰島素缺乏症或者體重減少。例如，葡萄糖尿的水平(糖尿)可通過Testape(Eli Lilly，Indianapolis，IN.)進行檢測且血漿葡萄糖水平使用如Burkly，1999，U.S.Patent 5,888,507，這兒被引用作為參考等所述的Glucometer 3血糖儀(Miles，Inc.，Elkhart，IN.)。通過這些方法檢測尿糖及血糖水平，NOD小鼠被認為是糖尿病患者在經過兩個連續的尿陽性測試使用Testape值+1或更高或血漿葡萄糖水平＞250mg/dL(Burkly，1999，supra)。在NOD小鼠中另外的檢測糖尿病的方法在NOD小鼠中檢測胰島素水平，例如胰島素水平可由免疫測定且在處理及對照組比較後確定(Yoon，U.S.Patent 5,470,873，herein incorporated by reference)。在這種情況下，從鼠胰臟中抽取的胰島素及其濃度可由免疫活性例如放射性免疫測定來進行確定，使用鼠胰島素作為一個標準。
除了一般使用NOD小鼠檢測糖尿病外，治療方法效果如果幹細胞被使用外源基因轉化或轉染通過基因特異性或基因產品特異性來進行檢測，因此，考慮到在外源基因表達及其對糖尿病的效果之間有一定的關聯。例如，外源基因產品的存在可以通過產生基因產品及胰島素的NOD小鼠胰臟β細胞的胰島的免疫組織化學而確定。通過檢測RNA轉錄補丁或平滑受體在NOD小鼠中進一步測定補丁及平滑基因的表達。反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增是通過已知技術擴增一個鼠補丁或平滑cDNA片段來進行的，且按照標準技術進行瓊脂糖凝膠電泳。擴增cDNA片段的鑑別通過雜交擴增片段與用於補丁或者平滑基因的螢光標記的內寡聚核苷酸探針，或者通過本領域已知的其它技術進行。
實施例5nestin陽性的人或鼠胰腺幹細胞的免疫細胞化學鑑別通過分析nestin的表達來分析胰島。胰島及幹細胞如上進行分離。Nestin的表達通過在胚胎第16天(E16)鼠胰腺中(圖8A)及在成人胰腺胰島中(出生後60天)(圖8B)發育的胰島群中明顯的免疫細胞化學染色來觀察。免疫細胞化學染色如下進行。
取自胚胎第16天及成人(60天)的鼠胰腺Cryosections(6M)與細胞一樣使用4％多聚甲醛磷酸溶液固定。
細胞首先使用3％正常的猴血清在室溫下處理30分鐘且在4℃下使用第一抗體過夜培養。抗血清使用PBS洗滌且分別使用Cy-3及Cy-2標記的第二抗體在室溫下孵育一小時。再使用PBS洗滌斜面PBS且使用螢光封固劑(Kirkegaard and Perry Labs，Gaithersburg，MD)重新覆蓋斜面。組織部分在4℃下使用第一抗體過夜培養。第一抗血清使用PBS洗滌，且斜面使用3％正常猴血清在室溫下孵育10分分鐘在其使用猴抗Cy3(indocarbocyanine)及抗豚鼠豬(胰島素)，抗鼠(胰高血糖素)，或抗綿羊(生長激素抑制素)sera DTAF(Jackson Immuno Research Laboratories，West Grove，PA)在室溫下孵育30分鐘。斜面然後再使用PBS洗滌並使用螢光封固劑(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)重新覆蓋。使用裝有界面上有一個PowerMac7100裝有IP實驗光譜分析軟體(Signal Analytics Corp，Vienna，VA)的光學TEC-470 CCD照相機(Optronics Engineering，Goleta，CA)的Zeiss Epifluorescence顯微鏡獲取螢光圖片。
Nestin陽性細胞區別於β-，α-，δ-，及PP細胞因為其並不與抗荷爾蒙胰島素，胰高血糖素，生長激素抑制素，或者胰腺多肽的抗血清共染色-(圖8AB)。Nestin陽性細胞同樣也並不與抗膠原質IV，動脈endothelial細胞標記(圖8C)的抗血清共染色，也不與抗galanin，神經細胞的一個標記或者細胞角蛋白19也即導管細胞的一個單抗(圖8)的一個單抗共染色。Nestin陽性染色與核共染色所清楚觀察到的胰島的截然不同細胞相關(圖4D)。
實施例6通過RT-PCR鑑別nestin陽性人及鼠幹細胞為了證實胰島中nestin表達的免疫細胞化學鑑別，我們使用準備自新的分離鼠胰島及人類胰島組織的總的RNA進行的nestin mRNA的RT-PCR。按照下述方法進行RT-PCR取自鼠及人胰島的總的細胞RNA被反轉錄且通過PCR擴增35個循環如前所述(Daniel等.，1998，Endocrinology，1393721-3729)。用作PCR的引物或擴增引物以及隨後DNA印跡雜交的探針的寡聚核苷酸如下鼠nestin正向，5′gcggggcggtgcgtgactac3′；反向，5′aggcaagggggaagagaaggatgt3′；
雜交，5′aagctgaagccgaatttccttgggataccagagga3′。
鼠角蛋白19正向，5′acagccagtacttcaagacc3′；反向，5′ctgtgtcagcacgcacgtta3′；雜交，5′tggattccacaccaggcattgaccatgcca3′。
鼠NCAM正向5′cagcgttggagagtccaaat3′；反向5′ttaaactcctgtggggttgg3′；雜交，5′aaaccagcagcggatctcagtggtgtggaacgatgat3′。
鼠IDX-1正向，5′atcactggagcagggaagt3′反向，5′gctactacgtttcttatct3′雜交，5′gcgtggaaaagccagtggg3′人類nestin正向，5′agaggggaattcctggag3′；反向，5′ctgaggaccaggactctcta3′；雜交，5′tatgaacgggctggagcagtctgaggaaagt3′。
人類角蛋白正向，5′cttttcgcgcgcccagcatt3′；反向，5′gatcttcctgtccctcgagc3′；雜交，5′aaccatgaggaggaaatcagtacgctgagg3′。
人類胰高血糖素正向，5′atctggactccaggcgtgcc3′；反向，5′agcaatgaattccttggcag3′；雜交，5′cacgatgaatttgagagacatgctgaaggg3′。
選自兩個不同外顯子的引物包含至少一個內含子序列。此外，一個RT負的對照也有很多例子。PCR循環在94℃下1分鐘然後再在94℃下10秒，58/56℃下10秒，72℃下1分鐘，35個循環且在72℃下2分鐘。退火溫度為58℃對於鼠nestin來講且在56℃下對其它的引物鹼基。
對於DNA雜交寡聚核苷酸探針使用螢光標記的T4多聚核苷酸激酶及y32P ATP。螢光標記探針雜交於PCR產品其轉移到尼龍膜上在37℃下1小時，然後使用1×SSC+0.5％SDS在55℃下洗滌10-20分鐘或在0.5×SCC+0.5％SDS在42℃下洗滌對於人類PCR產品來講。
合適預期尺寸的RT-PCR產生的產品(圖8E，上面板)且通過DNA印跡法證實(圖8E，較低面板)且通過產品的DNA測序。這些數據證明表達nestin的且可能代表胰島多功能性幹細胞其相似於中樞神經系統的nestin陽性幹細胞的胰島中新的細胞類型的鑑別。
實施例7nestin陽性幹細胞的體外增殖nestin陽性幹細胞的體外增殖能力的確定。
獲自60天大的小鼠或正常成人的胰島首先種植在伴刀豆球蛋白A包覆的盤子上然後在修飾的含有10％牛胎血清的RPMI1640培養基上培養四天以洗滌去胰島中的粘附在ConA-包覆的盤子上的纖維原細胞及其他非胰島細胞。在這些培養基條件下並不黏附在盤子上的胰島被收集然後轉移進入一個12孔平板上(並不含有ConA包覆)其含有相同的修飾RPMI1640培養基此外補充有bFGF及EGF(20ng/mL每一個)。生長因子bFGF及EGF一起被選擇因為其已知可以刺激獲自大腦室管膜的神經幹細胞的增殖(Reynolds and Weiss，1996，Dev.Biol.，1751-13)。粘附在平板上的胰島及細胞慢慢地長出胰島形成單層(在人類細胞中估計細胞有兩倍的時間40-45小時)。長出的細胞單層表型同類(圖9A，平板1)且表達nestin(圖9A，平板12)。鼠細胞從單層中挑出(一批至少20-30個細胞)，亞克隆進入一個12孔平板上，及在含有bFGF及EGF的修飾的RPMI1640培養基中(11.1mM葡萄糖濃度)下培養。亞克隆細胞快速生長且在第6天達到豐度估計細胞數加倍的時間為12-15小時(圖9A，平板3)，且在第12天形成波狀結構。培養後15-17天，細胞形成胰島類似性聚合體(ILCs)(圖9A，平板14)。相同的細胞克隆自人類細胞(圖9B)。在達到豐度時(圖9B，平板1)，人類細胞遷移以形成大空泡結構(圖9B，平板2及3)。大範圍的細胞形態改變，圓的聚集形成三維ILCs(圖9B，平板4-6)。
這些形成ILCs的nestin陽性胰島祖細胞(NIPs)的分化的指示劑通過RT-PCR及DNA印跡法進行確定發現其可以表達內分泌標記NCAM(神經細胞黏附分子)(Cirulli et al.，1994，J.Cell Sci.，1071429-36)(圖9C，右邊的盤子)且導管細胞標記CK19(細胞角蛋白19)(Bouwens et al.，1998，J.Pathol.，184234-9；Bouwens et al.，1995，J.Histochem.Cytochem.，43245-53；Bouwens et al.，1994，Diabetes，431279-93)(圖9C，左邊盤子)。在研究的這個階段其得出結論當NIPs形成豐度並聚合進胰島類似性細胞聚合物，其開始表達胰腺基因(NCAM及CK19)，但是因為缺乏其分化為內分泌細胞的生長因子胰島基因的表達很受局限性，同樣發現祖細胞群體的分化一般需要首先一個增殖階段然後在分化特異成形素生長因子的存在下增殖靜止階段。因此培養條件在某些情況下是需要修飾的例如更替含有其誘導細胞的增殖的11.1mM葡萄糖，bFGF及EGF的培養基，取而代之的是包含低濃度葡萄糖(2.5mM)，其是低增殖活性的，且生長因子HGF/散開因子或betacellulin及ActivinA的培養基。對於胰島β細胞來講葡萄糖是已知的增殖因子(Swenne，1992，Diabetologia，35193-201；Bonner-Weir，1989，Diabetes，3849-53)且包括HGF/分散因子及Activin A表明可以分化胰腺導管細胞系AR42J以形成一個可分泌胰島素，胰高血糖素及其它胰腺內分泌細胞蛋白的內分泌表型(Mashima et al.，1996，Endocrinology，1373969-76；Mashima et al.，1996，J.Clin.Invest.，971647-54)。
含有ILCs的培養物表達胰腺特異性homeodomain蛋白IDX-1通過免疫細胞化學(圖10A，上層)，RT-PCR及DNA印跡法(圖10B)，及通過蛋白質印跡(圖10C)。ILCs同樣表達編碼如RT-PCR(Fig。10D)所示胰高血糖素前體且產生免疫反應性的胰高血糖素，胰高血糖素類似性多肽-1及胰島素。在幾個正好給定值為40-80pg/ml GLP-1，30-70pg/ml胰高血糖素，29-44pg/ml胰島素的胰島類似聚合體培養後72-96小時後獲得的培養基的放射性免疫測定。放射性免疫測定如下進行。
培養基中胰島素及胰高血糖素的濃度分別通過購買自Linco研究公司以及DPC公司的超敏感性放射性免疫試劑盒來確定。在各自的試劑盒中的抗血清是豚鼠抗人胰島素及兔抗人胰高血糖素。GLP-1分泌物使用合成多肽CFIAWLVKGR氨基化合物配對keyhole limpet血藍質免疫兔形成的抗人GLP-1(7-36)氨基化合物兔多克隆抗血清進行測量。該抗血清對於GLP-1(7-36)氨基化合物的檢測是高度特異性的而且僅僅是每周檢測胰高血糖素前體，這些測試的敏感水平分別是6pg/mL，13pg/mL及10.2pg/mL。
在10mM鹽鹼中孵育ILCs 7天，正如Ramiya等(Ramiya et al.，2000，Nat.Med.，6278-282)所述那樣，可以將胰島素的分泌提高2至3倍。
幾個額外的胰腺標記在分化的NIPs例如葡萄糖運輸子-2(Wanget al.，1998)，synaptophysin，及HGF(Menke et al.，1999)如圖15所示進行表達。為了確定分化的NIPs是否具有胰腺外分泌組織的特點，我們使用RT-PCR以及檢測澱粉酶以及羧肽酶原的表達(圖15)。
含有幹細胞的一些NIPs培養物通過RT-PCR同樣表達編碼如16A及B所示的胰島素及胰高血糖素前體的mRNA。
IDX-1的表達顯得尤為重要因為其被鑑別為一個胰腺發育的主要調控子且尤其是在可產生胰島素的胰島β細胞成熟及形成功能所必需的因子(Stoffers et al.，1997，Trends Endocrinol.Metab.，8145-151)。
在胰管中尤其是在新生階段(鼠及小鼠)甚至在有些情況下整個成人階段(Bonner-weir et al.，1993，Diabetes，421715-1720；Rosenberg，1995，Cell Transplant，4371-383；Bouwens et al.，1996，Virchows Arch.，427553-560)由細胞分化所形成新的胰島已為大家所共知，在成熟數的胰管中分析nestin的表達。通過雙重抗nestin及抗細胞角蛋白螢光免疫細胞化學抗血清，一個導管上皮細胞標記，nestin都是很強地表達於大小導管的一定區域以及在一些外分泌腺泡組織中的centrolobular導管(圖11A及11B)。尤其是，導管中nestin表達的一定區域大部分沒有使用抗CK19抗血清染色。更進一步講，nestin陽性細胞表現出具有一定的形態其區別於包含有同系立體，圓柱細胞的上皮細胞。Nestin陽性細胞是有核的，匐行的且停留在上皮細胞中或其周圍的裂縫中。(圖11C)。
這樣，CK19並未表達於大多數的表達nestin的導管細胞中其表明這些nestin表達細胞位於胰臟導管中其為一個過客細胞不同於導管上皮細胞且為尚未分化進入導管或內分泌表型的幹細胞。胰腺導管中及成熟鼠胰島中nestin表達細胞的定位的發現進一步支持了這樣的觀點鼠胰管包含有胰島細胞(新生)的祖細胞，但是這些祖細胞卻並不是導管上皮細胞本質上的亞簇。
實施例8所設計的在糖尿病患者的人體中表達IDX-1的胰腺幹細胞的移植分離自豬或人供體胰臟的胰島，或來自最終的人體轉移受體的的胰腺活組織的胰島在體外培養，培養條件是可以刺激幹細胞的增殖的條件。幹細胞從胰島中分離(克隆的)，在含有bFGF-2，EGF，及11.1mM葡萄糖的增殖培養基中體外擴展，使用含有編碼轉錄因子IDX-1的DNA的表達載體轉染或注入並轉錄進入糖尿病受體中。
作為一種選擇，在移植以激發設計幹細胞分化形成β細胞之前IDX-1轉染幹細胞使用GLP-1處理1-3天或其他分化的成形素或生長因子。在一個技術方案中，幹細胞在給予受體之前既不擴展也不分化或者僅僅在給予受體之前擴展或分化。在一個技術方案中，在移植以刺激幹細胞分化期間或之後幾天GLP-1給予受體並使得其成功移植。按照這種方法，xenographs(豬胰島)或allographs(來自人供體而不是受體的人胰島)，也正如進行的isographs(獲自受體的胰島)一樣。假定當移植進入寄主受體時幹細胞遺傳庫被重新設計以至於寄主將幹細胞識別為自身(在所有的xenographs或allographs情況下)，以至於由自身免疫反應所形成的免疫不容或或破壞以及移植排斥不發生。
實施例9在患有糖尿病的人體中移植培養的胰腺幹細胞以激發IDX-1的表達所述分離胰島體外培養幾天首先激發胰島中幹細胞的擴展或增殖然後表達轉錄因子IDX-1。幹細胞的增殖通過在含有bFGF-2，EGF，及11.1mM葡萄糖的培養基中培養胰島實現。經過預處理的上述胰島被移植進入受體。此外，移植後幾天或期間寄主受體可被給予GLP-1以進一步分化或擴展幹細胞形成胰島素產生細胞以提高移植的成功性。
按照這種方法，xenographs(豬胰島)，allographs(來自人體供體而不是受體的人胰島)，正如isographs(獲自受體的胰島)一起進行。
實施例10胰腺幹細胞異種移植進入腎人類nestin陽性胰島祖細胞(NIPS)如所述進行分離並在非免疫抑制的8個C57B16小鼠的腎囊中移植。移植的人體細胞並不為鼠受體所排斥。一般的理解是一個異種移植物例如人體組織將在5-10天內為鼠所排斥。與該理解相反的是，我們發現8個非免疫抑制的小鼠中有8個如期測試所有的移植物成功移植且在大約移植105-106個細胞之後一個月(30-38天)吸附腎的組織中增殖。
一個C57B16小鼠作為試驗以確定在移植位點大範圍的新的生長。具有新組織的部分腎被分為兩部分被冷凍為組織冷凍切片，另一部分組織學石蠟切片在多聚甲醛中固定。準備冷凍切片使用蘇木精和曙紅(HE)及抗不同胰島細胞抗原的抗血清染色。
檢查HE染色的腎部分證明其不是部分腎的新的生長的存在，顯示了含有混合間葉細胞以及含有肝，神經系統，導管，adipodipic及hematopoetic組份的多態性。腎切片的顯微圖片證明了新的生長的腎parenchyme，及glomeruli。使用人體(非鼠)特異的抗血清的免疫染色揭示了許多人類特異性的角蛋白，vimentin及CD45白細胞抗原特異於人類造血淋巴細胞的免疫細胞染色。另外一個C57B16小鼠的腎同樣具有NIP移植位點相似外觀的新生長。
C57B16小鼠的NIP移植腎的石蠟切片(殺死第一小鼠)被檢測。被檢測的凝血組織來自腎的頂部其在沒有顯示進入腎實質中的腎囊中顯示出外源組織很好的相容性。顯著的是，在多態相似性移植組織中為腎實質區域。不局限於任一理論的是含有幹細胞的移植物分化該幹細胞不是侵入而只是簡單的轉移且增殖一個小生境，即間葉細胞結構中。其可從腎臟中獲取某種誘導並分化為腎。移植細胞不是惡性的，但卻是具有其功能的幹細胞。
實施例11胰腺幹細胞異種移植進入胰臟人類nestin陽性胰島祖細胞(NIPS)如上所述被分離並移植進入非免疫抑制的小鼠的胰臟且(a)使用鏈脲黴素(產生鏈脲黴素誘導的糖尿病)處理或(b)NOD小鼠中胰島正在發炎。
移植動物的胰腺被檢測以確定是否NIPs發現其合適的小生境並接受來自胰島區域的誘導分化為胰島β細胞。
實施例12通過異種移植胰腺幹細胞治療糖尿病人類胰島如上進行分離然後體外培養幾天以擴展幹細胞數目，人類NIPS通過靜脈移植進入肝臟(按照本領域已知的移植進入肝臟的技術)。
作為一種選擇，一定數量的人類NIPs(如上所述進行分離)被引入血管。在一些技術方案中，人類NIPS通過胰腺動脈被引入並將其導向糖尿病胰腺。
對照組(未移植動物)及移植動物被用於分析糖尿病症狀的改善(例如血糖水平，胰島素水平，胰腺β細胞數量)。
實施例13
肝臟中Nestin陽性幹細胞的鑑別按照本領域已知技術及這裡所描述的技術分離鼠肝臟且凍結切片。
鼠肝凍結切片(6μM)使用兔抗nestin多克隆抗體免疫染色。免疫螢光信號通過反應標記有螢光團Cy3(黃橙顏色)的抗猴IgG血清來進行測定。圍繞在一個大的膽管的Nestin陽性細胞如圖13A所示。圍繞在幾個小的膽管的nestin陽性細胞如圖13B所示。
實施例14NIPs向肝顯型分化因為報導的肝幹細胞(卵形細胞)，肝星細胞，及胰腺祖細胞的外觀相似性，隨後一些損傷的觀察，再生的胰腺經歷了肝的轉化(Slack，1995；Reddy et al.，1991；Bisgaard et al.，1991；Rao et al.，1996)，我們進行RT-PCR異在幹細胞中檢測肝表達基因。PCR產品獲得XBP-1，一個肝實質細胞發育中所需要的轉錄因子(Reimold等.，2000)，以及transthyretin，一個肝急性狀態蛋白。幾個其他的肝標記同樣被表達例如胎蛋白(Dabeva et al.，2000)，E-Cadherin(Stamatoglou et al.，1992)，c-MET(Ikeda et al.，1998)，HGF(Skrticet al.，1999)以及synaptophysin(Wang et al.，1998)；see Fig.15))。胰腺及肝臟所共同進行的蛋白表達，例如HGF及synaptophysin，可以反映出其共同起源於胚胎前腸內胚葉且表明其分化為或者胰腺或者肝的顯型。
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其他的一些技術方案權利要求書中所出現的其它的技術方案如下。
權利要求
1.治療糖尿病患者的方法，包括以下步驟(a)從供體的胰島中分離出nestin陽性胰腺幹細胞；且(b)將該幹細胞轉移進患者中，其特徵在於幹細胞分化形成胰島素產生細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於患者作為步驟a所述幹細胞的供體。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於患者並不作為步驟a所述幹細胞的供體。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於患者是人而步驟a所述幹細胞的供體是非人哺乳動物。
5.如權利要求3或4所述的方法，其特徵在於在步驟(b)之前患者並不使用免疫抑制劑進行處理。
6.如權利要求1所述的方法其特徵在於，在轉移步驟之前，使用選自含有下列組分的組的試劑體外處理幹細胞EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-P，及其結合體。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於轉移步驟是通過內向倒退注射法進行。
8.如權利要求1所述的方法，此外又包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理患者。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑可以防止免疫反應。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑可以延緩已經發生的免疫反應。
11.如權利要求8所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑降低了免疫反應發生的程度。
12.如權利要求8，9，10或11所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
13.如權利要求8所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑選自下列組份FK-506，環孢黴素，及GAD65抗體。
14.治療糖尿病患者的一個方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個nestin陽性胰腺幹細胞；(b)體外培養幹細胞；且(c)將祖細胞轉移進入患者，其特徵在於祖細胞分化形成一個胰島素生產β細胞。
15.治療糖尿病患者的一個方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個nestin陽性胰腺幹細胞；(b)體外擴展幹細胞以產生祖細胞；且(c)將祖細胞轉移進入患者，其特徵在於祖細胞分化形成一個胰島素生產β細胞。
16.如權利要求14或15所述的方法，其特徵在於患者作為步驟a所述幹細胞的供體。
17.如權利要求14或15所述的方法，其特徵在於患者並不作為步驟a所述幹細胞的供體。
18.如權利要求14或15所述的方法，其特徵在於患者是人而步驟a所述幹細胞的供體是非人哺乳動物。
19.如權利要求17或18所述的方法，其特徵在於患者在步驟(b)之前並不為免疫抑制劑處理。
20.如權利要求15所述的方法，其特徵在於擴展步驟是在選自含有下列組份的組的情況下進行的EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-β，及其結合體。
21.如權利要求14或15所述的方法，其特徵在於轉移步驟是通過內向倒退注射法進行。
22.如權利要求14所述的方法，此外又包括步驟(d)使用免疫抑制劑處理患者。
23.如權利要求15所述的方法，此外又包括步驟(d)使用免疫抑制劑處理患者。
24.如權利要求22或23所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑可以防止免疫反應的發生。
25.如權利要求22或23所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑延緩了免疫反應的發生。
26.如權利要求22或23所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑降低了免疫反應發生的程度。
27.如權利要求24所述的方法，其特徵在於所述免疫反應是移植排斥反應。
28.如權利要求25所述的方法，其特徵在於所述免疫反應是移植排斥反應。
29.如權利要求26所述的方法，其特徵在於所述免疫反應是移植排斥反應。
30.如權利要求22或23所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑選自含有下列組份的組FK-506，環孢黴素，及GAD65抗體。
31.治療糖尿病患者的方法，包含下列步驟(a)從供體胰島中分離一個nestin陽性胰腺幹細胞；(b)擴展幹細胞以產生祖細胞；(c)在培養基中分化祖細胞以形成假胰島類似聚合體；且(d)將假胰島類似聚合體轉移進入患者。
32.如權利要求31所述的方法，其特徵在於患者作為步驟a所述幹細胞的供體。
33.如權利要求31所述的方法，其特徵在於患者並不作為步驟a所述幹細胞的供體。
34.如權利要求31所述的方法，其特徵在於患者是人而步驟a所述幹細胞的供體是非人哺乳動物。
35.如權利要求33或34所述的方法，其特徵在於患者在步驟(b)之前並不為免疫抑制劑處理。
36.如權利要求31所述的方法，其特徵在於擴展步驟是在選自含有下列組份的組的情況下進行的EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activinA，TGF-β，及其結合體。
37.如權利要求31所述的方法，其特徵在於轉移步驟是通過內向倒退注射法進行。
38.如權利要求31所述的方法此外還包括步驟(e)使用免疫抑制劑處理患者。
39.如權利要求38所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑防止免疫反應。
40.如權利要求38所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑延緩了免疫反應的發生。
41.如權利要求38所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑降低了免疫反應發生的程度。
42.如權利要求39，40或41所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
43.如權利要求38所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑選自含有下列組份的組FK-506，環孢黴素，及GAD65抗體。
44.從胰島中分離幹細胞的方法，包括下列步驟(a)從供體中轉移出胰島；(b)培養來自胰島的細胞；且(c)從培養物中挑選nestin陽性克隆。
45.如權利要求44所述的方法，其特徵在於培養是首先在一個伴刀豆球蛋白A包覆的容器中進行的，然後再在沒有伴刀豆球蛋白A包覆的容器中進行培養。
46.如權利要求44所述的方法，此外還包括下列步驟(d)通過使用選自含有EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activinA，TGF-P，及其結合體的組的試劑進行處理擴展nestin陽性克隆。
47.一種誘導nestin陽性胰腺幹細胞分化成為胰腺祖細胞的方法。包括下列步驟幹細胞使用選自含有下列組分的組的試劑進行處理EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-P，及其結合體，幹細胞隨後分化為胰腺祖細胞。
48.如權利要求47所述的方法，其特徵在於胰腺祖細胞隨後形成假胰島類似聚合體。
49.移植進入哺乳動物的方法，包括下列步驟(a)從供體胰腺中分離出一個nestin陽性胰腺幹細胞且(b)將幹細胞轉移進入哺乳動物，其特徵在於幹細胞分化形成胰島素產生細胞。
50.如權利要求49所述方法，其特徵在於哺乳動物作為步驟a所述幹細胞的供體。
51.如權利要求49所述方法，其特徵在於哺乳動物並不作為步驟a所述幹細胞的供體。
52.如權利要求49所述方法，其特徵在於哺乳動物是人，而步驟a所述幹細胞的供體是非人哺乳動物。
53.如權利要求51或52所述的方法，其特徵在於在步驟(b)之前並不使用免疫抑制劑處理哺乳動物。
54.如權利要求49所述的方法，其特徵在於在轉移步驟之前，使用選自含有下列組分的組的試劑體外處理幹細胞EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-P，及其結合體。
55.如權利要求49所述的方法，其特徵在於轉移步驟是通過內向倒退注射法進行。
56.如權利要求49所述的方法，此外還包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理哺乳動物。
57.如權利要求56所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑防止免疫反應的發生。
58.如權利要求56所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑延緩了免疫反應的發生。
59.如權利要求56所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑降低了免疫反應發生的程度。
60.如權利要求56，57，58，或59所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
61.如權利要求56所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑選自含有FK-506，環孢黴素，及GAD65抗體的組。
62.移植進入哺乳動物的一個方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個nestin陽性胰腺幹細胞；(b)體外培養幹細胞；且(c)將祖細胞轉移進入哺乳動物，其特徵在於祖細胞分化形成一個胰島素生產β細胞。
63.移植進入哺乳動物的一個方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個nestin陽性胰腺幹細胞；(b)體外擴展幹細胞以產生祖細胞；且(c)將祖細胞轉移進入哺乳動物，其特徵在於祖細胞分化形成一個胰島素生產β細胞。
64.如權利要求62或63所述的方法，其特徵在於哺乳動物作為步驟a所述幹細胞的供體。
65.如權利要求62或63所述的方法，其特徵在於哺乳動物並不作為步驟a所述幹細胞的供體。
66.如權利要求62或63所述的方法，其特徵在於哺乳動物是人而步驟a所述幹細胞的供體是非人哺乳動物。
67.如權利要求65所述的方法，其特徵在於在步驟(b)之前使用免疫抑制劑處理哺乳動物。
68.如權利要求66所述的方法，其特徵在於在步驟(b)之前並不使用免疫抑制劑處理哺乳動物。
69.如權利要求63所述的方法，其特徵在於擴展步驟是在選自含有下列組份的組的情況下進行的EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-β，及其結合體。
70.如權利要求62或63所述的方法，其特徵在於轉移步驟是通過內向倒退注射法進行。
71.如權利要求62所述的方法此外還包括步驟(d)使用免疫抑制劑處理哺乳動物。
72.如權利要求63所述的方法此外還包括步驟(d)使用免疫抑制劑處理哺乳動物。
73.如權利要求71或72所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑防止免疫反應的發生。
74.如權利要求71或72所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑延緩了免疫反應的發生。
75.如權利要求71或72所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑降低了免疫反應發生的程度。
76.如權利要求73所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
77.如權利要求74所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
78.如權利要求75所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
79.如權利要求71或72所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑選自含有FK-506，環孢黴素，及GAD65抗體的組。
80.移植進入哺乳動物的方法，包括步驟(a)從供體胰島中分離出一個nestin陽性胰腺幹細胞；(b)擴展幹細胞以生產一個祖細胞；(c)在培養基中分化祖細胞以形成一個假胰島類似聚合體；且(d)將該假胰島類似聚合體轉移進入哺乳動物。
81.如權利要求80所述的方法，其特徵在於哺乳動物作為步驟a所述幹細胞的供體。
82.如權利要求80所述的方法，其特徵在於哺乳動物並不作為步驟a所述幹細胞的供體。
83.如權利要求80所述的方法，其特徵在於哺乳動物是人而步驟a所述幹細胞的供體是非人哺乳動物。
84.如權利要求82或83所述的方法，其特徵在於在步驟(b)之前並不使用免疫抑制劑處理哺乳動物。
85.如權利要求80所述的方法，其特徵在於擴展步驟是在選自含有下列組份的組的情況下進行的EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-β，及其結合體。
86.如權利要求80所述的方法，其特徵在於轉移步驟是通過內向倒退注射法進行。
87.如權利要求80所述的方法此外還包括步驟(e)使用免疫抑制劑處理哺乳動物。
88.如權利要求87所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑可以防止免疫反應的發生。
89.如權利要求87所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑可以延緩免疫反應的發生。
90.如權利要求87所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑可以降低免疫反應發生的程度。
91.如權利要求88，89或90所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
92.如權利要求87所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑選自含有FK-506，環孢黴素，及GAD65抗體的組。
93.一個分離的，非神經幹細胞的nestin陽性人類胰腺幹細胞。
94.如權利要求93所述的分離幹細胞其分化形成胰島素生產的β細胞。
95.如權利要求93所述的分離幹細胞其分化形成胰高血糖素生產的β細胞。
96.如權利要求93所述的分離幹細胞其分化形成假胰島類似聚合體。
97.如權利要求93所述的分離幹細胞其分化形成肝實質細胞。
98.權利要求93的分離幹細胞是免疫優勢的。
99.如權利要求93所述的分離幹細胞其並不表達I型MHC抗原。
100.如權利要求93所述的分離幹細胞其並不表達II型MHC抗原。
101.如權利要求93所述的分離幹細胞其並不表達I型或II型MHC抗原。
102.鑑別胰腺細胞是否幹細胞的方法，其包括步驟接觸細胞以標記的nestin特異性抗體，如果細胞也被抗體標記該細胞也就被鑑別為幹細胞。
103.如權利要求102所述的方法其進一步包括步驟接觸細胞以標記的細胞角蛋白19特異性抗體，如果細胞沒有被抗體標記該細胞也就被鑑別為幹細胞。
104.如權利要求102或103所述的方法其進一步包括步驟接觸細胞以標記的膠原質IV特異性抗體，如果細胞沒有被抗體標記該細胞也就被鑑別為幹細胞。
105.一種誘導nestin陽性胰腺幹細胞分化為肝實質細胞的方法，包括下列步驟使用可以誘導幹細胞分化為肝實質細胞或分化為肝實質細胞的祖細胞的有效劑量的試劑處理nestin陽性的胰腺幹細胞。
106.如權利要求105所述的方法，其特徵在於試劑是cyclopamine。
107.治療肝病患者的方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個nestin陽性胰腺幹細胞；且(b)轉移幹細胞進入患者，其特徵在於幹細胞分化形成肝實質細胞。
108.如權利要求107所述的方法，其特徵在於患者作為步驟a所述的幹細胞的供體。
109.治療肝病患者的方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個nestin陽性胰腺幹細胞；(b)體外擴展幹細胞以形成祖細胞；且(c)轉移組細胞進入患者，其特徵在於祖細胞分化形成一個肝實質細胞。
110.如權利要求109所述的方法，其特徵在於患者作為步驟a所述幹細胞的供體。
111.治療肝病患者的一個方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個nestin陽性胰腺幹細胞；(b)體外分化幹細胞以產生一個肝實質細胞；且(c)轉移肝實質細胞進入患者。
112.如權利要求111所述方法，其特徵在於患者作為步驟a所述幹細胞的供體。
113.如權利要求107，109或111所述方法，其特徵在於患者並不作為步驟a所述幹細胞的供體。
114.如權利要求107，109或111所述方法，其特徵在於患者是人而步驟a所述幹細胞的供體是非人哺乳動物。
115.如權利要求113所述的方法，其特徵在於患者在步驟(b)之前並不使用免疫抑制劑處理。
116.如權利要求114所述的方法，其特徵在於患者在步驟(b)之前並不使用免疫抑制劑處理。
117.如權利要求113所述的方法此外還包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理患者。
118.如權利要求114所述的方法此外還包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理患者。
119.如權利要求117所述的方法，其特徵在於免疫抑制劑可以防止免疫反應。
120.如權利要求117所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑延緩免疫反應的發生。
121.如權利要求117所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑降低了免疫反應發生的程度。
122.如權利要求117所述的方法，其特徵在於所述免疫反應是移植排斥反應。
123.如權利要求118所述的方法，其特徵在於所述免疫反應是移植排斥反應。
124.如權利要求119所述的方法，其特徵在於所述免疫反應是移植排斥反應。
125.如權利要求120所述的方法，其特徵在於所述免疫反應是移植排斥反應。
126.如權利要求121所述的方法，其特徵在於所述免疫反應是移植排斥反應。
127.移植進入哺乳動物的方法，包括下述步驟(a)從供體胰島中分離一個nestin陽性胰腺幹細胞；且(b)轉移幹細胞進入所述哺乳動物，其特徵在於幹細胞分化形成一個肝實質細胞。
128.如權利要求127所述的方法，其特徵在於所述哺乳動物作為步驟a幹細胞的供體。
129.移植進入哺乳動物的一個方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個nestin陽性的胰腺幹細胞；(b)體外擴展幹細胞以產生一個祖細胞；且(c)轉移祖細胞進入所述哺乳動物，其特徵在於祖細胞分化形成一個肝實質細胞。
130.如權利要求129所述的方法，其特徵在於所述哺乳動物作為步驟a所述幹細胞的供體。
131.移植進入一個哺乳動物的方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離出一個nestin陽性胰腺幹細胞；(b)體外分化幹細胞以產生一個肝實質細胞；且(c)轉移肝實質細胞進入所述哺乳動物。
132.如權利要求131所述的方法，其特徵在於所述哺乳動物作為步驟a所述幹細胞的供體。
133.如權利要求127，129或131所述的方法，其特徵在於所述哺乳動物並不作為步驟a所述幹細胞的供體。
134.如權利要求127，129或131所述的方法，其特徵在於所述哺乳動物是人而步驟a所述幹細胞的供體是非人哺乳動物。
135.如權利要求133所述的方法，其特徵在於所述哺乳動物在步驟(b)之前並不使用免疫抑制劑處理。
136.如權利要求134所述的方法，其特徵在於所述哺乳動物在步驟(b)之前並不使用免疫抑制劑處理。
137.權利要求133所述的方法此外還包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理所述哺乳動物。
138.權利要求134所述的方法此外還包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理所述哺乳動物。
139.如權利要求137所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑可以防止免疫反應的發生。
140.如權利要求137所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑延緩了免疫反應的發生。
141.如權利要求137所述的方法，其特徵在於所述免疫抑制劑降低了免疫反應發生的程度。
142.如權利要求137所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
143.如權利要求138所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
144.如權利要求139所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
145.如權利要求140所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
146.如權利要求141所述的方法，其特徵在於免疫反應是移植排斥反應。
147.一個分離的，非神經幹細胞的nestin陽性人類肝臟幹細胞。
148.如權利要求147所述的分離的幹細胞其是免疫優先的。
149.如權利要求147所述的分離的幹細胞其並不表達I型MHC抗原。
150.如權利要求147所述的分離的幹細胞其並不表達II型MHC抗原。
151.如權利要求147所述的分離的幹細胞其並不表達I型或II型MHC抗原。
152.一個分離的，非神經幹細胞的nestin陽性人類幹細胞其可以移植進入動物而並不導致移植物對寄主的移植排斥反應。
153.如權利要求152所述的分離的，nestin陽性人類幹細胞其並不是主要組織相容性複合體I型或II型限制的。
154.含有如權利要求93所述的分離幹細胞且混和有一個生理學上適宜的載體的藥物組合物。
155.含有如權利要求147所述的分離幹細胞且混和有一個生理學上適宜的載體的藥物組合物。
156.含有如權利要求152所述的分離幹細胞且混和有一個生理學上適宜的載體的藥物組合物。
全文摘要
治療I型胰島素依賴型糖尿病及其他使用新辨認的能夠分化為不同的胰島細胞,包括胰島素生產的β細胞以及肝實質細胞的幹細胞的情況的方法及組合物。Nestin已被鑑別為胰腺幹細胞的一個分子標記,而細胞角蛋白19作為胰導管細胞的一個明確的類的標記。本發明同樣也描述了nestin陽性幹細胞可分離自胰島且培養以獲得幹細胞或假胰島類似結構的方法。同樣也描述了胰腺幹細胞的體外分化的方法。分離,擴展及移植胰腺幹細胞進入患者以或者同種異體移植,或者同種移植或者異種異體移植以取代丟失或損壞胰島素分泌細胞或其它細胞的方法。
文檔編號C12N5/02GK1423563SQ00816754
公開日2003年6月11日 申請日期2000年12月6日 優先權日1999年12月6日
發明者伊利莎白·J·亞伯拉罕, 丹尼斯·福斯特曼, 喬·L·哈本娜, 馬裡奧·瓦立喬, 亨德裡克·祖裡烏斯基, 梅利莎·K·託馬斯 申請人:通用醫療公司