一種細胞晶片製作方法及其器具的製作方法
2023-04-23 18:01:36
專利名稱：一種細胞晶片製作方法及其器具的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞的檢測方法，具體涉及一種細胞晶片。
背景技術：
目前培養細胞製備細胞晶片的方法有3種細胞離心沉澱紙包固定的石蠟包埋法、瓊脂糖為基質固定的石蠟包埋法以及瓊脂糖平板上鑿孔，孔內灌注細胞固定的石蠟包埋法。這三種方法各有其缺點，前兩種方法導致過於細胞彌散，儘管後一種方法能得到密度較高均勻一致的細胞，但工藝流程多，操作複雜。此外，製作細胞晶片時，上述三種處理方法的最大缺陷在於製作細胞晶片時均需按製作組織晶片的方法對受體石蠟塊進行穿刺製作受體細胞芯條，由於培養細胞無間質纖維，穿刺細胞時常導致細胞分散，不利於重複穿刺製作細胞晶片。隨著人類基因組計劃的完成，後基因組時代的功能基因組學研究方法正朝著大規模、高能量的方向發展。基因晶片、組織晶片、蛋白質晶片等晶片的研製開發為功能基因組學的研究提供了一系列高通量的研究工具，極大地加快了功能基因組的研究步伐。但是目前市場上的各種晶片不能滿足於大規模原位檢測各種蛋白和基因在永生化的良惡性研究培養細胞株中表達。因此研究開發出一種更為簡單實用、一步到位的製作細胞晶片方法，使細胞晶片用於基因原位表達的研究則是需要解決的問題。
發明內容
本發明旨在提供一種工藝簡單，不需要穿刺製作的新方法，製作的細胞晶片可用於基因原位表達的研究。
本發明是通過以下技術方案實現發明目的的。經細胞培養、收集固定細胞、細胞脫水、細胞透明後，浸蠟是將細胞懸液從Tube管移入透明條形模具中，將在條形模具中均勻沉積的細胞與模具直立浸入溶點為58℃的低溶點石蠟溶液中浸蠟三次，受體石蠟塊和受體孔的製作是製作間距為2mm的點陣列模具紙貼於按細胞晶片的密度製作的相應規格大小的受體石蠟塊上，依次用真空穿刺針在網格紙中穿出受體孔，受體細胞晶片石蠟塊的製作是將經置於37℃溫箱內軟化的細胞石蠟混合物截去條形模具的下端，從切端擠出條形細胞石蠟混合物，並截斷成段，放入相應石蠟塊受體孔中。浸蠟用一種透明條形模具，該模具底部直徑為1.0mm，底部塞有少量阻擋細胞並有利於松節油經模具底部流出的棉花。
下面結合附圖進一步詳述本發明。
圖1為條形模具示意圖；其中1、底部直徑1mm模具；2、底部填塞的棉花圖2為條形細胞石蠟混合物；
圖3為置於Tube管中的石蠟細胞芯條；圖4為受體細胞點陣圖；圖5為受體細胞點陣圖；圖6為免疫組化，4×細胞微陣列圖；圖7為HE，4×細胞微陣列圖；圖8為HE，20×細胞微陣列圖；圖9為免疫組化，20×細胞微陣列圖；圖10為免疫組化，20×細胞微陣列圖。
製作細胞晶片的具體方法如下(1)培養細胞培養各種組織和器官來源的永生化惡性腫瘤細胞和良性永生化細胞株於100ml培養瓶，每種細胞培養3瓶。(2)收集固定細胞待細胞長至90％密度時，收集細胞進行如下處理D-Hanker’s液洗滌細胞4次，充分洗淨殘餘培養基，培養瓶中加入1ml D-Hanker’s液，塑料細胞刮子輕輕刮下細胞，細胞移入1.0ml～1.5ml Tube管中，離心2500轉/分，共5min，倒掉Tube管中液體，濾紙吸淨殘餘液體，加入1.0ml～1.5ml 4％多聚甲醛於Tube管中並輕輕吹打重懸細胞(隨後每一步驟的無特殊說明時，均在1.0ml～1.5ml Tube管中進行，試劑為1.0ml～1.5ml)，使其分散為單個細胞懸液，4℃放置固定過夜。(3)細胞脫水依次按以下6個步驟梯級脫水，每次脫水後，離心5000轉/分，5min/次，棄去前一步的脫水劑，70％(酒精中含有0.5％伊紅指示劑)酒精脫水40min，80％酒精脫水40min，90％酒精脫水45min，95％酒精脫45min，100％酒精脫水60min共2次。(4)細胞透明脫水後離心5000轉/分，5min/次，濾紙吸盡殘餘酒精，松節油(二甲苯具有毒性，用松節油代替二甲苯，)使細胞透明二次，每次60min。(5)浸蠟離心5000轉/分，5min/次，吸去上層0.8ml松節油，反覆吹打細胞形成松節油細胞懸液，然後把細胞懸液從Tube管移入底部直徑為1.0mm的透明條形塑料模具(1)中，模具底部塞有少量棉花(2)阻擋細胞並有利於松節油經模具底部流出，在重力作用下，細胞均勻沉積在條形模具中。依次將裝有細胞的條形模具直立浸入3個裝有低溶點石蠟溶液燒杯中(溶點為58℃)，每一燒杯中放置有模具架的，浸蠟時間分別為30min，45min，60min，共三次。浸蠟後的條形模具中細胞石蠟混合物編號保存於常溫或4℃冰箱中備用。(6)細胞晶片受體石蠟塊和受體孔的製作按所需製作細胞晶片的密度，製作相應規格大小的受體石蠟塊。間距為2mm的點陣列模具紙貼於石蠟塊上，依次用直徑1.0mm真空穿刺針在網格紙中穿出直徑為1.0mm，深度為4～10mm的受體孔。(7)受體細胞晶片石蠟塊的製作裝有細胞石蠟混合物的條形模具放置於37℃溫箱內，30min，目的使細胞石蠟混合物軟化。截去條形模具的下端，止血鉗夾住條形模具的上端逐步往下移動，從切端擠出直徑為1.0mm左右的條形細胞石蠟混合物(圖2)。將條形細胞石蠟混合物截斷成4-10mm/段，放入相應石蠟塊受體孔中。待全部受體孔中填滿細胞石蠟條形混合物後，受體石蠟塊37℃烤箱中30min，玻璃切片平壓受體蠟塊表面，使所有細胞芯條在同一平面。(8)細胞晶片切片的製作在輪轉式切片機上先進行粗切修片，HE染色鏡下觀察證實全部切出所有受體細胞點陣(圖4、5)後，利用石蠟膠帶轉移系統切片，5μm厚切片粘貼於載玻片上，紫外燈下交聯1min，切片浸於膠帶溶解液中30sec，剝離膠帶，常規脫蠟水化，進行各種研究，如需長期保存則快速浸入溶化石蠟中，使切片表面重新履蓋薄層石蠟，-20℃貯存。(9)細胞晶片的質量檢測和實際應用的評估隨機抽取一張切片進行HE染色，圖像分析系統在低倍鏡下採集每個完整細胞點陣的圖像，體視學分析模塊下對每一個細胞株的點陣圖像進行分析計數。原位雜交和免疫組化檢測LRRC4mRNA和P53蛋白在細胞晶片中表達。
本發明方法製作的細胞晶片為基因功能研究提供了另一種新的高通量工具，具有多個方面的用途。細胞晶片與組織晶片一樣，可用於基因原位表達的研究如原位雜交、原位PCR、免疫組化、免疫螢光等。此外，細胞晶片還具有組織晶片不可替代的如下用途。(1)可作為蛋白質微陣列的替代方法來證實藥物的作用靶；(2)作為一種克隆表達系統用於發現改變細胞生理功能的基因產物。(3)用於轉染細胞的基因構型改變的研究。(4)轉染目的基因細胞克隆的篩選。(5)用於高通量地研究藥物不同劑量和不同藥物作用下細胞中相關基因或蛋白表達的差異，試驗藥物的敏感性，有利於發現新藥物。(6)石蠟細胞混合物具有組織石蠟塊一樣能長期保存優點，為長期保存各種細胞提供一種經濟簡單的方法。
具體實施例方式實施例含20種細胞系的細胞晶片製備1.1細胞處理(1)細胞系的種類與細胞培養引進並保存的細胞系包括以下15種。COS7非洲綠猴腎細胞系；3T3鼠成纖維細胞系；CNE-1和HNE1中國人鼻咽癌細胞系；Hella人宮頸癌細胞系；U251人星形膠質瘤細胞系；C6大鼠膠質瘤細胞系；HT29和SW480人結腸癌細胞系；Soas-2和MG-63人成骨肉瘤細胞系；K562慢性骨髓性白血病細胞系；B16鼠惡性黑色素瘤細胞系；293人腎細胞系；BHK-21鼠腎細胞系。建立並鑑定穩定轉染目的基因細胞系有3種細胞系，共5個克隆。CNE-1-BRD7，CNE-1-LMP1轉染BRD7基因、LMP1基因的人鼻咽癌細胞系；HT29-NGX6-2和HT29-NGX6-10轉染NGX6基因的人結腸癌細胞系克隆2和克隆5；U251-LRRC4轉染LRRC4基因的人星形膠質瘤細胞系。按常規方法復甦上述細胞系並傳代，每種細胞用100cm2培養瓶培養5瓶。
(2)收集、固定細胞待細胞形態良好，細胞長至90％密度時，收集細胞進行如下處理D-Hanker’s液洗滌細胞4次，充分洗淨殘餘培養基，培養瓶中加入1ml D-Hanker’s液，塑料細胞刮子輕輕刮下細胞，並移入1.5ml Tube管中，離心2500轉/分，共5min，倒掉Tube管中D-Hanker’s液，濾紙吸淨殘餘液體，加1.5ml 4％多聚甲醛於Tube管中，1.0ml吸頭輕輕吹打細胞使其成為均勻細胞懸液(隨後每一步驟無特殊說明時，均在1.5mlTube管中進行，試劑為1.5ml)，4℃放置固定過夜。
(3)細胞脫水依次按以下6個步驟梯級脫水，每次脫水後，離心5000轉/分，5min/次，棄去前一步脫水劑，70％(此步驟酒精中含有0.5％伊紅使細胞染成紅色便於操作觀察細胞)酒精40min，80％酒精40min，90％酒精45min，95％酒精45min，100％酒精60min共2次。
(4)細胞透明脫水後離心5000轉/分，5min/次，濾紙吸盡殘餘酒精，松節油使細胞透明二次，每次60min。
(5)浸蠟離心5000轉/分，5min/次，吸去上層1.0ml松節油，200μl吸頭反覆吹打細胞形成細胞松節油懸液後，細胞懸液從Tube管移入底部直徑為1.0mm的透明條形塑料模具中，模具底部塞有少量棉花阻擋細胞並有利於松節油經模具底部流出，在重力作用下，細胞均勻沉積在條形模具中。依次將裝有細胞的條形模具插入模具架上，模具架依次直立浸入3個裝有低溶點石蠟溶液燒杯中(來卡公司，溶點為58℃)，分別浸蠟30min，45min，60min。浸蠟後細胞石蠟混合物的條形模具編號保存於4℃冰箱中備用。
1.2細胞微陣列受體石蠟塊和切片的製作(1)來卡公司的58℃石蠟與蜂蠟按9∶1混合製成2×2×2cm的受體石蠟塊，製作間距為2mm的網格紙貼於石蠟塊上，依次用直徑1.0mm真空的穿刺針在網格紙中穿出直徑為1.0mm，深度為10mm的受體孔。
(2)細胞石蠟混合物的條形模具置於37℃溫箱加熱30min，軟化細胞石蠟混合物。手術刀截去條形模具的下端，止血鉗夾住條形模具的上端逐步往下移動，從切端擠出直徑為1.0mm條形細胞石蠟混合物。手術刀將條形細胞石蠟混合物截斷為每段長10mm，放入相應石蠟塊受體孔中，用載玻片輕壓細胞芯條，使其進入受體蠟塊受體孔中。每一細胞系製作5個受體細胞芯條，待全部受體孔中填滿石蠟細胞混合物後，受體石蠟塊水平放置於37℃溫箱內中30min，然後用載玻片輕壓受體蠟塊表面，使所有細胞芯條在同一平面。如果石蠟細胞芯條暫不用於製作細胞微陣列，亦可放置於Tube管中，編號4℃長期保存。
(3)細胞微陣列切片的製作受體石蠟塊首先在輪轉式切片機上進行粗切，HE染色鏡下觀察證實所有受體細胞點陣都完整切出後(圖4、5)，利用石蠟膠帶轉移輔助系統進行受體石蠟塊切片，每次切片時，帶有標記的膠帶貼於石蠟塊表面，5μm厚細胞膠帶切片粘貼於特殊粘附基質的載玻片上，紫外燈下交聯90sec，玻片浸於膠帶溶解液中30sec，溶解並輕輕剝離膠帶，然後切片快速浸入溶化石蠟中，使切片表面重新履蓋薄層石蠟，便於長期保存，處理完畢的切片可在-20℃長期貯存備用。如果切片立即使用，在膠帶剝離後，即可常規脫蠟水化，進行各種研究。每20張切片後，需重新進行HE染色，鏡下觀察，如果發現有細胞點陣缺失時，需中止切片。
1.3細胞晶片的質量檢測和實際應用(1)質量檢測隨機抽取一張切片進行HE染色，圖像分析系統在低倍鏡下採集每個完整細胞點陣的圖像，體視學分析模塊下對所有細胞系的點陣圖像進行分析計數。
(2)細胞微陣列在免疫組化中的應用DAKO公司EnVision兩步法免疫組化檢測試劑盒檢測P53和P16在此細胞微陣列中的表達。按常規組織切片的免疫組化操作程序進行。切片脫蠟至水，3％的H2O2阻斷內源性過氧化物酶30min，切片置於枸椽酸鈉緩衝液(PH 6.4)中，微波爐中進行抗原修復20min；分別滴加鼠抗人單克隆抗體P53，P21，PTEN和P16(Santa Cruz公司)於切片上，4℃溫盒中過夜，PBS洗3×5min，二抗室溫孵育45分鐘，PBS洗3×5min，DAB顯色，鏡下控制顯色反應；蘇木素復染，膠帶轉移系統專用封片劑封片。
(3)細胞微陣列在原位雜交中的應用檢測BRD7(GenbankAF179285)，NGX6(GenbankAF188239)基因在細胞微陣列中的表達；BRD7和NGX6基因閱讀框內設計引物，PCR分別擴增350bp，400bp目的片段，膠回收，生物素隨機引物標識試劑盒(KPL公司)進行探針標識。原位雜交檢測試劑盒(PE公司，有TSA信號放大系統)對雜交信號進行檢測。切片脫蠟，入梯級酒精，DEPC水洗，3％雙氧水滅活內源性的過氧化物酶。蛋白酶K進行細胞通透性處理暴露細胞中的mRNA，37℃15-20分鐘。預雜交，每一切片預雜交液100μl/片，封口膜覆蓋，42℃預雜交3小時。不洗，含探針的雜交液95℃變性10min，訊速冰上冷卻，滴加雜交液100μl/片，封口膜覆蓋，42-45雜交15小時。雜交後2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC洗滌15分鐘/次。TNB緩衝液阻斷非特異性染色。滴加SA-HRP(鏈黴卵白素-辣根過氧化物酶)，室溫30分鐘。TNT緩衝液洗，5分鐘/次，加信號放大試劑(Biotinyl Tyamid)，室溫10分鐘。TNT緩衝液洗，5分鐘/次，滴加SA-HRP(鏈黴卵白素-辣根過氧化物酶)，室溫30分鐘。TNT緩衝液洗5分鐘/次，DAB顯色，鏡下控制顯色反應；蘇木素復染，膠帶轉移系統專用封片劑封片2、結果(1)成功地製作100個點陣的細胞微陣列，每種細胞包含5個點陣，所有細胞系點陣的HE染色，鏡下觀察細胞結構清晰，形態整齊；對所有細胞系點陣圖像進行計數分析，細胞數為1150～1324個/細胞點。使用細胞微陣列進行原位雜交和免疫組化檢測，結果表明細胞微陣列無完全掉片現象，且檢測結果與細胞塗片一致(圖6-10)。
權利要求
1.一種細胞晶片製作方法，包括細胞培養、收集固定細胞、細胞脫水、細胞透明，浸蠟、細胞晶片受體石蠟塊和受體孔的製作、受體細胞晶片石蠟塊的製作及細胞晶片切片的製作，其特徵在於(1)浸蠟是將細胞懸液從Tube管移入透明條形模具(1)中，將在條形模具中均勻沉積的細胞與模具直立浸入溶點為58℃的低溶點石蠟溶液中浸蠟三次，(2)受體石蠟塊和受體孔的製作製作間距為2mm的點陣列模具紙貼於按細胞晶片的密度製作的相應規格大小的受體石蠟塊上，依次用真空穿刺針在網格紙中穿出受體孔，(3)受體細胞晶片石蠟塊的製作經置於37℃溫箱內軟化的細胞石蠟混合物截去條形模具的下端，從切端擠出條形細胞石蠟混合物，並截斷成段，放入相應石蠟塊受體孔中。
2.一種如權利要求1所述的細胞晶片製作方法專用的器具，其特徵在於浸蠟用一種透明條形模具(1)，該模具底部直徑為1.0mm，底部塞有阻擋細胞並有利於松節油經模具底部流出的少量棉花(2)。
全文摘要
本發明涉及一種細胞晶片。細胞晶片的製作方法為細胞固定、脫水、透明後，將經透明處理後的細胞置於一定規格的條形模具中浸蠟製成條狀石蠟細胞芯條，然後直接將一定長度的條狀石蠟細胞芯條按序放置於受體石蠟塊中，利用膠帶轉移輔助系統進行切片，製成不同密度的細胞晶片。細胞晶片為基因功能研究提供一種高通量工具，除有組織晶片的用途外，還有組織晶片不可替代的用途。如作蛋白質晶片的替代方法用於證實藥物作用的靶；作為一種克隆表達系統用於發現改變細胞生理功能的基因產物；用於轉染細胞的基因構型改變的研究；用於高通量地研究藥物不同劑量和不同藥物作用下細胞中相關基因或蛋白表達的差異，試驗藥物的敏感性，利於發現新藥物。用於轉染目的基因克隆的篩選；為長期保存各種細胞提供一種經濟簡單的方法。
文檔編號G01N33/50GK1556407SQ200410022819
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月8日 優先權日2004年1月8日
發明者李桂源, 範松青, 周潔, 肖炳燚, 熊煒, 曹利, 歐陽珏, 李偉芳, 唐珂 申請人:中南大學湘雅醫學院腫瘤研究所