能夠增加表面上微生物種群的組合物及其應用的製作方法

2023-04-25 19:40:46

專利名稱：能夠增加表面上微生物種群的組合物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種組合物，該組合物能夠提高表面上微生物的生物活性或增加微生 物種群的密度。本發明的組合物可以用於保護植物免受植物病原體、有害昆蟲或雜草樣植 物的侵害，或促進植物的生長。
背景技術：
在植物的表面(包括葉、莖、枝、花或果實)、草地的土壤表面、動物(如蟑螂、蝸牛 或螞蟻)的表面(下文統稱為「表面」)上，生長有各種各樣的天然微生物。這些微生物以 腐生、共生或寄生的關係出現。在植物表面，寄生性植物病原體通過在有利環境條件下的種 群增加引發植物疾病，並且有害昆蟲也擴大種群導致植物受損。雜草樣植物也會因與植物 間營養或空間的競爭引起耕種作物或植物生長的減少。植物病原體、有害昆蟲和雜草(下 文統稱為「有害生物」)對人們為尋求人類食物的穩定產量而付出的努力形成了威脅。現 在，人們主要依賴化學農藥的使用來保護植物免受這些有害植物的傷害。迄今為止，化學農 藥已被用為保護作物免受植物病原體、昆蟲和雜草傷害的最有效辦法。現在的市場規模在 世界範圍內是約300億美元，在韓國是10億美元。但是，化學農藥存在很多負面問題，在抑 制有害生物時也抑制了其他天然的有益生物，引起生態混亂。化學農藥的殘留和代謝物也 會對化學農藥的製造者、農民或消費者產生毒性效果。此外，化學農藥的反覆使用會誘導植 物病原體、昆蟲和雜草的抗性，導致它們對化學農藥的敏感性降低。有時，化學農藥的洩漏 會導致我們環境中空氣、水或土壤的汙染。人們已經致力於對具有上述潛在危險的化學農藥進行補充和替代。另一選擇是用 特定的微生物來控制有害生物。這些微生物(以下統稱為「植物保護微生物」)具有在其生 長適宜的環境條件下抑制特定有害生物的生物活性。與化學農藥相比，這種微生物方法主 要因為它對哺乳動物和環境的安全譜而順應了社會需求。最近，許多國家，包括美國、歐洲 國家、日本和韓國已經啟動規定，鼓勵用「植物保護微生物」控制「有害生物」的工業產品的 研究、開發和註冊。「植物保護微生物」通常按照從自然界中分離、在其特定的培養基中人工 培養和在使用前配置的方法來開發。儘管它們對人類和環境是安全的，但是，這種微生物方 法也有技術局限，並且因為技術局限，與化學農藥相比，在工業角度上並不成功。該微生物 方法通常不足以保護植物免受「有害生物」的傷害，並且其功效因高度依賴於環境條件而差 異較大。其另外一個限制是微生物產品相對於化學農藥具有更高的成本。「植物保護微生 物」通常需要嚴格的條件來維持它們在生產、運輸、儲存中和被農民使用于田間後的存活或 生物活性，而這些嚴格條件的要求經常會導致相對於化學農藥更高的成本。特別地，依賴於 環境條件而不穩定或不可靠的功效通常需要栽培者承擔「有害生物」帶來的經濟風險。這 些問題被認為是微生物方法儘管被公知為對人類和環境是安全的，但是沒有在工業上被採 用的主要原因。人們將化學肥料用於農業生產已經有很長時間了。但是，化學肥料的重複使用已 經因為土壤中的鹽分積累和其他負面問題如水汙染，導致了農業用地的產量減少。為了克服這些問題，人們已經用天然有機物質替代化學肥料來試圖恢復農業用地的產量。天然有 機物質因它們的代謝物，包括小分子有機物和礦物質而表現出肥料效果。這些有機物質主 要是被天然微生物降解的。這些微生物(以下統稱為「植物生長促進微生物」)在天然界大 量存在，而且合理運用這些微生物就能替代或補充化學肥料。但是，「植物生長促進微生物」 在微生物方法上具有與「植物保護微生物」相似的技術局限，如低效、易受環境條件影響而 導致的功效不穩定和不可靠、比化學肥料更高的價格。這些技術局限也會導致微生物方法 在工業應用上的限制。上述基於「植物保護微生物」和「植物生長促進微生物」(以下統稱為「有益微生 物」)的方法效果的不穩定或不足的原因，是植物表面的植物保護微生物或生長促進微生 物的生物活性通常很大程度上依賴於它們生長的環境條件這樣一個事實引起的。更明確 地，植物表面上微生物的生物活性已知受到溼度、溫度、紫外光、營養等因素的影響(Steven Ε. Lindow和MariaT. Brandl. 2003.葉環境微生物學.應用和環境衛生學69 1875到1883)。 為植物保護和植物生長促進而應用於植物表面的有益微生物，這些環境因素通常會影響這 些微生物的生存和生物活性。特別地，在引起葉片乾燥並減少葉片營養可利用率或者直接 將葉片暴露於陽光的環境條件下，這些有益生物的種群明顯地減少，或者它們的生物活性 明顯降低。本發明聚焦於開發用於加強植物表面水分和微生物營養物的可利用率並因此導 致表面上微生物的種群和生物活性增加的組合物。植物表面的水分由天然降水或人工灌 溉提供，而且水量隨時間和空間在植物表面變動。微生物的生物活性一般比植物對水更敏 感。更明確地，植物表面的水由重力作用從葉片上降落到地表，或者因為蒸發而從植物表面 消失。而且植物表面上保留的水也因為表面結構而在葉面上分布不同。例如，植物表面上 保留的水主要位於沿著葉脈或者毛狀體周圍的部分，從而導致水的不均勻分布，進一步導 致生於葉片上的微生物的水的有限可利用率。這可能是微生物位於沿著葉脈和毛狀體周圍 存在的原因之一。對植物表面微生物來說，有限的水的可 利用率(以下統稱為「可用水」) 一般導致了微生物種群的降低或者生物活性的降低和轉入孢子類的休眠結構。因此，「可用 水」被認為對增加或維持微生物種群或它們的生物活性非常重要。更多地，「可用水」對植 物表面上的微生物可接觸到的表面上微生物營養物的可利用率也很重要。因此，有限的水 的可利用率也意味著溶解或懸浮於水的微生物營養物的有限的利用率。同樣地，「可用水」 也在向植物表面上微生物傳遞微生物營養物中起到重要作用。在微生物營養物中，碳源和氮源對微生物維持它們的種群或者表現它們的生物活 性是非常重要的。一般地，在一個特定的空間和時間點，各種各樣的天然微生物以巨大的 數量存在於植物表面。多種微生物的共存，導致了微生物之間對微生物營養物的高度競爭 (Steven Ε. Lindow和Maria Τ. Brandl. 2003.葉環境微生物學.應用和環境衛生學69 :1875 到1883)。特別地，由人們人工引入的用於植物保護或植物生長促進的「有益微生物」通常 位於不利於它們生存和生物活性的、已被具有更強的生態適應性的天然微生物佔據了的葉 表面。大多數「有益微生物」先人工生長於培養基，以優化它們的最大種群生長，然後引入 天然的田間環境。由於這個原因，這些「有益微生物」不能認為是有競爭性地安置於自然生 態條件下的。此外，產生的這些「有益微生物」經常以孢子樣的休眠結構存在的，與營養體 結構相比，休眠結構的生物活性更低。這些在人工培養基中生長，然後以休眠結構儲存的生產過程，是植物表面的「有益微生物」與已在生態上適應生存的天然微生物相比競爭力低的 原因。生於植物表面的天然微生物與植物病原微生物競爭水、微生物營養物或空間，而 這種競爭會減少植物疾病的發生。因此，在天然腐生微生物和植物病原微生物之間的競爭， 被認為在保護植物免受植物病原體侵害方面是理想的。此外，為了保護特定植物免受特定 植物病原體的傷害，使用選自用於競爭的、並經過在培養基上人工培養而擴大了的種群的 特定微生物，比簡單地增加天然腐生微生物更為理想。另一方面，用天然微生物保護植物免 受有害昆蟲或雜草樣植物的侵害非常困難，因為它們的種群密度或者生物活性不夠高，不 能抑制有害昆蟲或減少雜草樣植物。在這種情況下，人工生長於培養基的有益微生物就更 加理想。因此，需要將能夠特異性地抑制特定有害昆蟲或特定有害雜草的特定有益微生物 引入到植物表面。為了通過應用有益微生物來提高植物的生長，人工引入比用天然腐生物 要更理想。目前還沒有很好地建立技術，以提供能選擇性地被有益微生物使用而不被天然微 生物種群使用的微生物營養物。實際上，植物表面的微生物在特定的時間和空間裡持續地 改變著它們的種類和數量。在植物表面，已知同時存在著許多不同的微生物。例如在燕 麥、橄欖、甘蔗和小麥的葉環境中報導有37個屬和85種微生物(Ching-Hong Yang, David Ε. Crowley, JamesBorneman和Noel Τ. Keen. 2001.微生物葉環境種群比先前認識的要複雜 的多.美國科學院院刊.卷98:3889到3894)。這種微生物的多樣性也能相似地適用於它 植物。因此，當在植物表面人工引入有益微生物時，它們必須在多種環境條件下，在同樣的 空間中與其它天然微生物競爭。這種動態競爭使有益微生物難以在特定空間中長期佔據顯 著位置。一種克服這種局限的方法是使用可以選擇性地被特定有益微生物使用的微生物營 養物。例如，特定有益微生物可以使用油作為它們的碳源，然而大多數天然微生物不能使用 油作為營養。另外一種方法是使用不能抑制一種或一些有益微生物但能抑大多數天然微生 物的抗微生物藥劑。用這種方法，有益微生物可以在它們的早期應用階段，即天然微生物被 選擇性控制的時候，安全地建立它們的種群。如果需要，可以使用在實驗室被誘導產生對特 定抗微生物藥劑具有抗性的有益微生物。一些化學殺細菌劑或殺真菌劑可作為抗微生物藥 劑使用。但是，即使在這種情況下，因為它們使用的不同目的和低濃度，這些抗微生物藥劑 的應用率比較低。本發明的關鍵點是使用超吸收聚合物(以下統稱為「SAP」)來增加植物表面微生 物的種群密度和生物活性。本發明中的SAP被定義為具有親水功能並能保持至少數十倍 於自身重量的自來水達到一段特定時間的所有聚合物。SAP在20世紀70年代被美國農業 部(USDA)引進，從80年代開始工業使用。SAP的主要應用是衛生目的，包括免洗尿布和女 用衛生巾。在農業和林業中，SAP也被用於乾旱地區的土壤中，以向植物根部長期提供水分 或者增加土壤的透氣性(Sang-Bum Park. 1994.超吸收聚合物的特徵和應用現狀.Mokchae Konghak 22(1) :91到112)。儘管SAP可以基於它的粗骨架材料被分為天然SAP和合成SAP， 但它們都是通過把可溶的粗聚合物交聯為不可溶的形式而得到的，因此，它們可以以一種 凝膠形式保持自身重量數十倍的水(Sang-Bum Park. 1994.超吸收聚合物的特徵和應用現 狀· Mokchae Konghak 22(1) 91 到 112)。美國專利No. 9009020描述了農業 途的SAP的製作過程。該專利公開了 SAP可以被用於土壤中、種子上或根上，以增加土壤的透氣性，從而提高種子的萌發和出土，以及 減少水灌溉的成本。為該目的，發明者描述了通過製造5-24目大小範圍的SAP的方便用 法。韓國專利申請公開No. 2002-0002852描述了 SAP與外生菌根一起在制粒的種子上的用 途，該用途可以增加貯存期、幫助發芽的根長出制粒的種子表皮外和減少植物幼苗的水壓 力。在韓國進行的另一項研究中，在盆栽土壤中用佔土壤重量2 %的SAP來提高能有效抗土 生植物疾病的沙雷氏菌(Serratia plymuthica)A21-4的抑制活性。已有報導，通過這種應 用，辣椒苗的出苗和生長促進明顯地增強了(Shun-Shan Shen, ffon-il Kim和Chang-Seuk Park, 2006.水凝膠對沙雷氏菌A21_4在土壤中的存活和植物疾病抑制上的效果.植物病理 雜誌卷.22 364-368)。此外，已有報導，沙雷氏菌A21-4的種群密度在根和根環境中顯著 地增加了，而辣椒疫黴(Phytophthora capsici)(—種辣椒枯萎病的致病病原體)的種群 密度呈現出了減少。但是，所有這些報導被定向到SAP在土壤中的使用，SAP在土壤表面下發揮作用。 沒有關於SAP在植物表面上應用，以增加天然微生物或有益微生物的種群密度或生物活性 的報導。此外，也沒有使用SAP來增加植物表面微生物的種群密度或生物活性、保護植物免 受有害微生物的傷害或促進植物生長的報導。

發明內容
本發明基於結合用SAP增加表面上微生物的水可利用率，通過增加植物上腐生微 生物或有益微生物的種群密度或生物活性來保護植物免受有害生物的傷害或促進植物生 長的想法。因此，本發明提供了含有SAP的組合物(以下統稱為「SAP組合物」)，可以用於 增加表面上微生物的種群密度或生物活性，還可用於保護植物免受有害生物的傷害，促進 植物生長等。本發明提供了 SAP組合物來增加植物表面的微生物種群或生物活性。本發明也描 述了 SAP組合物在植物表面(包括葉、莖、枝、花和果)、草本生長的土壤表面，或者蝸牛、蟑 螂或螞蟻的動物表面上的應用。使用SAP組合物，本發明描述了有效的SAP組合物能夠保 護植物免受有害生物傷害或促進植物生長。本發明所述的SAP組合物可以為生長在植物、土壤和動物表面天然微生物或有益 微生物額外地提供水或微生物營養物。這種額外的水或微生物營養物可以增加表面上的微 生物種群並提高微生物的生物活性。更詳細地，本發明的SAP組合物能夠提供額外的水或 微生物營養物，延長了水和微生物營養物的供應時間，從而增加了表面上的微生物種群。添 加了微生物營養物的SAP組合物對增加表面上微生物種群更加有效。製備了含有SAP、微生 物營養物和特定的有益微生物的本發明SAP組合物，以用於增加人工引入的有益微生物的 種群，而不是天然腐生有益微生物的種群。當SAP組合物含有抑制天然腐生微生物的有益 微生物時，該SAP組合物可以抑制天然微生物，從而導致天然微生物的種群密度的減少。此 外，通過在SAP組合物中加入能夠在特定的微生物營養物中選擇性生長的一些特定的有益 微生物，或對特定抗微生物藥劑具有抗性的有益微生物，本發明所述的SAP組合物可以用 於增加特定有益微生物而不是天然有益微生物。綜上所述，通過在所述SAP組合物中加入的有益微生物或選擇性加入的抗微生物 製劑抑制了次級代謝產物的活性，本發明的SAP組合物可以用於增加天然腐生微生物或加入的有益微生物，以減少天然微生物種群的密度。通過本發明所述的SAP組合物的使用，在 種群上增加了的天然腐生微生物或加入的有益微生物，能夠更有效地與植物病原體微生物 競爭微生物營養物和空間，從而減少疾病的發生。當SAP組合物中加入有具有殺蟲活性的 特定微生物時，該殺蟲微生物在植物表面合理使用的情況下，可以以更高的機率來抑制表 面上的有害昆蟲。當該SAP組合物中加入有除草微生物時，該除草微生物在雜草樣植物的 表面合理使用的情況下，可以以更高的機率通過選擇性的方式來抑制雜草樣植物。當SAP 組合物中加入有能抑制蝸牛、蟑螂或螞蟻的生長的特定有益微生物時，該有益微生物在動 物表面合理使用的情況下，也可以以更高的機率來抑制或消滅有害動物。
具體實施例方式為實現上述發明目的，本發明提供了含有SAP的組合物，以增加植物、土壤或動物 表面的有益微生物的微生物種群或生物活性。本發明所述的SAP組合物還可以含有至少一種營養物，該營養物可被天然腐生微 生物或加入的有益微生物利用。本發明所述的SAP組合物還可以含有至少一種有益微生物，該有益微生物能夠抑 制植物病原體、有害昆蟲或雜草樣植物，或者能夠促進植物的生長。本發明所述的SAP組合物還可以含有至少一種有益微生物，該有益微生物能夠抑 制有害動物。本發明所述的SAP組合物還可以含有至少一種表面活性劑，以使所述組合物能夠 在表面均勻分布。本發明所述的SAP組合物還可以含有至少一種簡單的或複合的礦物鹽，以提高所 述組合物在水中的潤溼性。本發明所述的SAP組合物的特徵在於，所述SAP為澱粉基的SAP。本發明所述的SAP組合物的特徵在於，所述SAP的含量為20_95重量％。本發明所述的SAP組合物的特徵在於，當用水稀釋所述SAP組合物時，SAP的含量 為給定水量的0. 02-1. 0重量％。本發明所述的SAP組合物的特徵在於，所述表面為包括葉、莖、枝、花或果實的表 面在內的植物表面，土壤表面或者動物表面。本發明所述的SAP組合物的特徵在於，所述微生物營養物為肉湯培養基的PLNT粉 末，所述肉湯培養基由等重量的馬鈴薯葡萄糖肉湯、Luria肉湯基礎、營養肉湯和胰酶大豆 肉湯組成。本發明所述的SAP組合物的特徵在於，所述植物為黃瓜、辣椒、馬鈴薯、水稻、番 茄、大麥、小麥、梨或玫瑰。本發明所述的SAP組合物的特徵在於，所述微生物為選自芽孢桿菌屬(Genus Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Genus Paenibacillus)或鏈黴菌屬(GenusStreptomyces)的細 菌菌屬，選自木黴屬(Genus Trichoderma)、白粉菌寄生菌屬(Genus Ampelomyces)或支頂 抱屬(Genus Acremonium)中的真菌菌屬。本發明所述的SAP組合物的特徵在於，所述植物病原體選自稻瘟病 胃(Magnaporthe grisea)、/R t 胃胃(Thanatephorus cucumeris) > M β lif(Phytophthora capsici) ^MMM (Botrytis cinerea)、禾柄f秀菌(Pucciniagraminis)、白 粉菌(Blumeria graminis 艮口 Erysiphe graminis)或掠絲單囊殼(Sphaerotheca fusca)。本發明所述的SAP組合物的特徵在於，所述有害昆蟲為菜蛾屬(Plutella)。本發明所述的SAP組合物的特徵在於，所述雜草是指種植者不期望的、在特定時 間及空間內生長于田間的植物。本發明所述的SAP組合物的特徵在於，所述有害動物為蟑螂、螞蟻或蝸牛。本發明提供了 SAP組合物在抑制表面上的有害生物或促進植物生長中的應用。下面，對本發明進行進一步詳細的描述。本發明涉及能夠增加表面上天然腐生微生物或加入的有益微生物的生物活性或 種群密度的組合物及其應用。本發明所述的組合物含有作為水的超吸收聚合物的SAP。根 據應用和需要，本發明所述的組合物可以含有微生物營養物或有益微生物。此外，可分別加入潤溼劑或表面活性劑來提高水中的潤溼性和表面上的鋪展性 (spreadability)。在本發明中，所用的用於增加微生物可用水的量和延長水供給時間餓關 鍵材料是超吸收聚合物(以下統稱為「SAP」)。微生物營養物由微生物學家在實驗室廣泛 用於研究的液體培養基組成。有益微生物來自商業提供者或者研究相應微生物的研究者。 本發明所述的組合物中，分別選擇和合理使用礦物鹽和表面活性劑，以提高水中的潤溼性 和表面上的鋪展性。1.SAP (超吸收聚合物)本發明中主要用到的SAP是澱粉基的，特別是Zeba(產品商標名)，含有吸收 技術有限公司(Absorbent Technologies, Inc)生產的澱粉-接枝-多聚(2_丙烯醯 胺-共-2-丙烯酸)鉀鹽(CAS註冊號No. 107830-79-5)。在用水稀釋前，組合物中的SAP 含量是50重量％，用水稀釋時，在給定量水中的SAP含量是0. 02-1. O重量％。在所述SAP 組合物和實施例中的SAP含量，SAP的含量是給定量水的0.5重量％。作為對照，用產自 Kolon工業有限公司(Kolon Industries Inc.)的丙烯醯胺基的SAP (GS-3000)替代Zeba， 在黃瓜葉上測試時，該物質表現出相似的增加微生物種群的效果。在本發明中，SAP被碾磨 為直徑0. 1毫米及以下的精細粉末。SAP顆粒越小，溶解後懸浮的SAP在寬範圍植物表面散 布地越好。但是，上述SAP的種類、含量和直徑僅用於舉例說明本發明，而不限制製備本發 明所述組合物中所含SAP的種類和方法。2.微生物營養物在本發明中，使用了一種名為PLNT粉末培養基的微生物營養物。PLNT粉末培養 基由全部產自美國Difco實驗室的馬鈴薯葡萄糖肉湯、Luria肉湯基礎、營養肉湯和胰酶大 豆肉湯組成。推薦等量地合併使用四種培養基，以製得PLNT培養基。已確認多種微生物在 PLNT瓊脂培養基上生長良好。使用的PLNT粉末培養基的量為本發明組合物的5重量％。 但是，PLNT粉末培養基只作為本發明中的例子，微生物營養物的種類和含量不受另外限制。 更確切地說，也可以使用其它能夠提供微生物生長所需的碳、氮、胺基酸、礦物質或維生素 的微生物營養物。3.有益微生物本發明中用到的所有有益微生物都來自商業提供者或研究人員。用於保護 植物免受植物病原體傷害的有益微生物屬於芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)或鏈黴菌屬(Sti^ptomyces)中的細菌菌屬,或者木黴屬(Trichoderma)、 白粉菌寄生菌屬(Ampelomyces)或支頂孢屬(Acremonium)中的真菌菌屬。用於保護植物免 受有害昆蟲傷害的有益微生物屬於蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)中的細菌 菌屬，用於保護植物免受雜草樣植物傷害的有益微生物屬於灰黴菌(Botrytis cinerea)中 的細菌菌屬。用於促進植物生長的有益微生物屬於花域芽孢桿菌(Bacillusvallismortis) 中的細菌菌屬。每種有益微生物的參考文獻如下〈有益微生物的參考文獻〉1.用於保護植物免受植物病原體傷害的有益微生物(1)類芽孢桿菌(Paenibacillus elgii) (SD17)A. Kim, D. S.，Bae, C. Y.，Jeon, J. J.，Chun, S. J.，Oh, H. W.，Hong, S. G.，Baek, K. S.， Moon, Ε. Y. , and Bae, K. S. 2004. Paenibacillus elgii sp.nov., a novel species with broad antimicrobial activity. International Journal of Systemic and Evolutionary Microbiology54 :2031-2035.B. Kim, D. S.，Bae, C. Y.，Kim, D. H, Chun, S. J.，Choi, S. W.，and Choi, K. H. 2005. Paenibacillus elgii SD17 as a biocontrol agent against soil一borne turf diseases. Plant Pathology Journal 21 :328-333.C.韓國專利 No. 0457025(2)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) (QST713)Α.美國專利 No. 6060051(3)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) (GB-0365)Α·韓國專利 No. 294023(4)鏈黴菌(Str印tomyces sp. ) (A020645)A. Lee, H. B.，Cho, J. W.，Park, D. J. , Li，C. Τ.，Ko, Y. H.，Song, J. H.，Koh, J. S.， Kim, B. J. Kim, C. J. 2004. In vivo screening for biocontrol agents (BCAs) against Streptomyces scabiei causing potato common scab. Plant Pathology Journal 20 110-114.B.韓國專利 No. 0563298(5)哈棲木黴(Trichoderma harzianum) (YC459)A. Lee, S. K.，Sohn, H. B.，Kim, G.G.and Chung, Y. R. 2006.Enhancement of biological control of Botrytis cinerea on cucumber by foliar sprays and bed potting mixes of Trichoderma harzianum YC459 and its application on tomato in the greenhouse. Plant Pathology Journal 22 :283-288.B.韓國專利 No. 0417632(6)白粉菌寄生菌(Ampelomyces quisqualis) (AQ94013)B.韓國專利 No. 0332480(7)直立頂孢黴(Acremonium s trie turn) (BCP)A. Kim, J. C.，Choi, G. J.，Kim, H. J.，Kim, H. T.，Ahn, J. W. and Cho, K. Y. 2002. Verlamelin, an antifungal compound produced by a mycoparasite, Acremonium strictum. Plant Pathology Journal 18:102—105.
B.韓國專利 No. 02997682.用於保護植物免受有害昆蟲傷害的有益微生物(8)蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai) (NT0423)Α.韓國專利 No. 02803803.用於促進植物生長的有益微生物(9)花域芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) (EXTN-I)A. Park, K. S. , Paul, D. and Yeh, W. H. 2006a. Bacillus vallismortis EXTN-l-mediatedgrowth promotion and disease suppression in rice(Oryza sativa L·)· Plant Pathology Journal 22:278-282.B. Park, K. S. ， Paul, D. ， Ryu, K. R. ， Kim, E. Y, and Kim, Y. K. 2006b. Bacillus vallismortis strain EXTN-Imediated systemicresistance against Potato Virus X and Y(PVX & PVY)in the field. Plant Pathology Journal 22 :360-363.C. Park, K. S.，Paul, D.，Kim, Y. K.，Nam, K. W.，Lee, Y. K.，Choi, H. W. and Sang Y. L. 2007. Induced systemic resistance by Bacillus vallismortis EXTN-I suppressed bacterial wilt in tomato caused by Ralstonia solanacearum. Plant Pathology Journal 23 :22_25.D.韓國專利 No. 0379022本發明中，為了實驗目的，微生物按如下方法獲得在250毫升的錐形瓶中使100 克取自成體黃瓜植株的黃瓜葉片與1升水劇烈震蕩，靜置30分鐘後，再劇烈震蕩後，用消過 毒的雙層粗濾布過濾(以下統稱為「葉片洗脫水」)。在本發明中，植物病原體為人工收集 的。由於植物病原體因其固有的專有寄生狀態而不可培養，種菌是從感染病原體並表現出 典型感染症狀的植株上取得的。在本發明中，所涉及的有害昆蟲是菜蛾的幼蟲。理論上， BCPC於2004年出版的《生物防治藥劑手冊》(The manual of biocontrol agent)中列出 的大部分細菌和真菌都可考慮作為有益微生物。在該手冊中，在植物病原體到達前，定植於 植物表面或土壤表面的有益微生物與病原體競爭營養物或空間，從而進行植物保護。在保 護植物免受有害昆蟲傷害的情形中，有益微生物被攝入有害昆蟲的內部，進而導致有害昆 蟲的死亡或失活。在保護植物免受雜草樣植物傷害的情形中，特異致病的有益微生物只對 雜草樣植物引發疾病。因此，本發明中的實驗只是為了闡明本發明，並不限制有益微生物或 有害生物的種類。4.微生物組合物的製備本發明所述的微生物組合物是將各種成分研磨和混合為平均顆粒大小等於或小 於0.1毫米的粉末來製備的。在本發明所述的成分中，SAP是澱粉基的SAP。微生物營養物 是PLNT。有益微生物通過商業購買或者在實驗室分離並純化培養得到後，經過培養，再通過 凍幹技術製成粉末。此外，用5%的粉末形式的表面活性劑來實現該組合物在植物表面的 均勻分布。在本發明中，表面活性劑為產自英國Ineos Oxide有限公司的Softanol (CAS注 冊號No. 68131-40-8)。用由韓國Jimgwoo化學公司提供的白碳墨，以1 1的重量比吸收 Softanol。更詳細地說，Softanol是在具有12-14烷基碳的線形仲醇上加上環氧乙烷得到 的非離子表面活性劑。在微生物組合物中，用複合礦物鹽來提高該組合物在水中的潤溼性。 Mirigun粉末，產自韓國Daeyoo，以30重量％作為溼潤劑加入到微生物組合物。Mirigun是提供植物生長所需礦物質的肥料。在本發明中，Mirigim被用作載體，基於它在水中的高可 溶性和高比重可以提高水中的潤溼性。簡單礦物鹽，比如氯化鈣也可用於本發明所述的微 生物組合物。對不含有益微生物的組合物，Mirigim粉末以40重量％使用。表1描述了在 100克組合物中各成分的含量。表 1組合物 A)以每克粉末集落形成單位的對數值(即log集落形成單位)表示微生物種群密 度β)表面活性劑以1 1重量比吸收Softanol的白碳墨粉末
。)載體Mirigun粉末這些組合物只是例子，並不限制可用於本發明所述組合物的SAP、有益微生物、微 生物營養物、表面活性劑或載體的種類。現參照以下實施例更詳細地描述本發明。但是，這只是舉例地詳細說明本發明，絕 不是用這些實施例來限制本發明的範圍。實施例1 微生物種群的動態在本實施例中，監測了每種組合物對出現於植物表面的、天然微生物或加入的有 益微生物的種群密度的效果。為了實驗的目的，天然微生物被定義為按如下步驟獲得的微 生物在250毫升的錐形瓶中使100克取自成體黃瓜植株的黃瓜葉片與1升水劇烈震蕩， 靜置30分鐘後，再劇烈震蕩後，用消過毒的雙層粗濾布過濾(以下統稱為「葉片洗脫水」)。 當在LB瓊脂培養基上培養時，檢測到了大約2X IO5集落形成單位/毫升(cfu/ml)(等於 5.31og集落形成單位/毫升)的天然微生物。這其中，細菌在總種群中佔到了 90%的優勢 數量。本發明中的各個組合物以0. 5重量％的量加入葉片洗脫水，使總體積達到10毫升。 將7個直徑3釐米的黃瓜葉圓片在浸泡30分鐘後，在室溫下置於有蓋培養皿中。此外，作為 對照，以如上相同的比例和方法，分別將每一種有益微生物加入10毫升葉片洗脫水中。還 製備了不含微生物營養物或有益微生物的組合物作為對照。每種製備物在LB瓊脂培養基 上處理後，在室溫下培養0、1、2、3、5和7天。培養後的3-7天內，用稀釋鋪板方法合理計數 微生物種群。有益微生物通過它們在培養基上特有的集落形式區分，而其它都被認為是土 壤微生物。這些結果匯總在表2中。表 2黃瓜葉圓片上有益微生物或天然微生物的種群動態 a)在集落形成單位的基礎上轉化為對數值來計數微生物種群密度b)匪表示天然微生物c0BM表示有益微生物d)WLW 表示葉洗脫水(leafwash water)如表2所示，大多數有益微生物或天然微生物的種群都在合理使用本發明所述組 合物的時候增加了。對一些組合物，天然微生物的種群密度在特定時間點增加了近100倍。 但是，在含有有益微生物ι的組合物3情況下,或在含有有益微生物2的組合物4情況下，天 然微生物的密度降低了，或其增長速率減小了。這種現象的可能原因是通過產生次級代謝 物而具有抗微生物活性的有益微生物3和4的抗菌作用。例如有報導的類芽孢桿菌SD17的 廣譜抗菌活性(Kim, D. S.，Bae，C. Y.，Kim, D. H，Chun, S. J.，Choi, S. W.，和 Choi, K. H. 2005. 類芽孢桿菌SD17作為抗土傳草皮病的生物防治劑·植物病理學雜誌21 =328-333)。基於表 1的結果，可以發現，本發明所述的組合物向黃瓜葉片上的微生物種群提供了更多的水和微 生物營養物，從而導致天然微生物或有益微生物種群密度的增加。此外，在使用具有抗微生 物活性的有益微生物情況下，應用本發明所述的組合物，通過減少天然微生物的種群密度， 或者通過減小天然微生物種群密度的增加，使得有益微生物能夠良好地定植。實施例2 組合物保護植物幼苗免受植物病原體傷害的活性
在本實施例中，在生長間測試本發明所述組合物抗植物病原體(稻瘟病 胃(Magnaporthe grisea)、/R t 胃胃(Thanatephorus cucumeris) > M β lif (Phytophthora capsici) > MMM (Botrytis cinerea)、禾柄f秀菌(Pucciniagraminis) > 白粉菌(Blumeria graminis 即 Erysiphe graminis)的保護活性(Choi, G. j, Kim, J. -C.， Lee, S. -W.，Jang, K. S.，Kim, J. -S.，和Cho，K. Y. 2002.幾種植物提取物抗小麥銹病的抗真 菌活性.韓國殺蟲科學雜誌6(2) =87-95.韓語)。主要區別是在用每種組合物200倍稀 釋噴霧於植物表面處理植物3天後，接種分別接種植物病原體。處理後的植物按常規操作 維持，通過對照值來估計植物保護活性。對照值(Control value, CV)用下列計算式估計 CV(% ) = {1_(處理組疾病面積比/非處理組疾病面積比)} X 100表 3.各個組合物和有益微生物抗植物疾病的保護活性 RLBa)稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的水稻枯萎病RSBb)瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)引起的水稻葉鞘枯萎病TGM0灰黴菌(Botrytis cinerea)引起的番茄灰黴TLBd)致病疫黴菌(Phytophthora infestans)引起的番茄晚疫WLRe)小麥葉鏽菌(Puccinia recondita)引起的小麥葉片銹病BPMf)白粉菌(Blumeria graminis f. sp. Hordei)引起的大麥白粉病
在表3中，增加的對照值顯示，本發明所述的SAP組合物總體上表現出抗植物疾病 的保護活性。詳細地說，組合物1對所有疾病的對照值都有總體增加。組合物2顯示出比 組合物1略高的對照值。從組合物3到組合物11的對照值總體上均有增加。特別是，表現 出抗植物疾病保護活性的組合物只有與各種有益微生物結合，才能提高對照值。有益微生 物1單獨表現出抗番茄晚疫(TLB)和番茄灰黴(TGM)的保護活性，然而，含有有益微生物1 的組合物3表現出增強了的抗相同疾病的保護活性，並且進一步地表現出一定的抗水稻枯 萎病(RCB)、水稻葉鞘枯萎病(RSB)、小麥葉片銹病(WLR)和大麥白粉病(BPM)的保護活性。 有益微生物2單獨表現出抗TLB和BPM的保護活性，然而，含有有益微生物2的組合物4表 現出增強了的抗TLB和BPM的保護活性，並且進一步地表現出一定的抗其它疾病的保護活 性。有益微生物3單獨表現出抗RCB、RSB、TGM和TLB的保護活性，然而，含有有益微生物3 的組合物5表現出增強了的抗RCB、RSB、TGM和TLB的保護活性，並且進一步地表現出一定 的抗其它疾病的保護活性。有益微生物4單獨表現出抗WLR和BPM的保護活性，然而，含有 有益微生物4的組合物6表現出增強了的抗WLR和BPM的保護活性，並且進一步地表現出 一定的抗其它疾病的保護活性。有益微生物5單獨表現出抗TGM和RSB的保護活性，然而， 含有有益微生物5的組合物7表現出增強了的抗TGM和RSB的保護活性，並且進一步地表 現出一定的抗其它疾病的保護活性。有益微生物6單獨表現出抗BPM和WLR的保護活性， 然而，含有有益微生物6的組合物8表現出增強了的抗BPM和WLR的保護活性，並且進一步 地表現出一定的抗其它疾病的保護活性。有益微生物7單獨表現出抗TLB和RSB的保護活 性，然而，含有有益微生物7的組合物9表現出增強了的抗TLB和RSB的保護活性，並且進 一步地表現出一定的抗其它疾病的保護活性。有益微生物8單獨表現出抗菜蛾類幼蟲的保 護活性但沒有抗其它抗植物疾病的保護活性，然而，含有有益微生物8的組合物10表現出 一定的與組合物2相似的抗其它疾病的保護活性。有益微生物9單獨表現出抗BPM和WLR 的保護活性，然而，含有有益微生物9的組合物11表現出增強了的抗BPM和WLR的保護活 性，並且進一步地表現出一定的抗其它疾病的保護活性。如上所述本發明所述的各種組合 物總體上表現出比每個微生物更高的對照值。不含有益微生物的組合物1或組合物2也表 現出一定水平的增加的對照值。但是，考慮到實施例2是在一個具有適合疾病發展或昆蟲生長的包括溫度、溼度 和光線在內的穩定條件的、通常用於短期內評價化學殺蟲劑的生長室系統中進行的，在確 定保護活性上有一定的局限。因此，為了確定本發明所述的組合物的抗植物疾病的保護活 性，由於植物表面暴露於變化的溼度、溫度和晝夜光照下，因此還需要考慮自然條件。植物 也可以生長更長的時間。因此，為了更好的確定本發明的效果，通過使用在一般種植條件或 相似條件下的成體植物(adult plants)，進一步重複進行了一項實驗，以確定本發明所述 組合物的功效。實施例3 抗黃瓜白粉病的保護活性和微生物種群的動態在本發明所述的組合物中，一些組合物被用於確定其抗黃瓜白粉病的保護活性， 抗黃瓜白粉病由棕絲單囊殼(Sphaerotheca fusca)引起，自然發生於溫室中的成體植物 上。將播種1個月後的黃瓜幼苗移植到裝有產自韓國Biomedia的培養土(Bimong Sangto 5號)的罐(直徑15釐米，深20釐米)中，在溫室中按常規操作，使其進一步生長，到黃瓜植 株長至第5或第6葉期。然後分別以7天的應用間隔，將組合物1、2、3和4、有益微生物1和2、以及含有活性成分嘧菌酯(azoxystrobin)的化學殺真菌劑的懸浮液噴霧到黃瓜表面和 葉片上，作對比研究。實驗按照3次重複的隨機完全區組設計(randomized complete block design) 0每個重複包含4個黃瓜植株。噴霧懸浮液含有200倍稀釋的本發明所述的各種 組合物或有益微生物。在用等量的水稀釋時，每種有益微生物具有相似的有益微生物數量。 用手動噴霧器在黃瓜葉片和表面施用足夠的噴霧懸液直到懸浮液滴下為止。引入黃瓜白粉 病，以在溫室中的一些黃瓜植株上自然發病。事實上，在黃瓜長至第5或第6葉期時可以觀 察到該疾病的發生。按照韓國《農村發展管理指南》(RuralDevelopment Administration)， 在每次施用當天評估保護活性。在處理3後的第七和第十四天(7DAT 3和14DAT 3)進行 進一步評估。表4顯示抗黃瓜白粉病的保護活性。表 4抗黃瓜白粉病的保護活性 A)以嘧菌酯(azoxystrobin)為活性成分的化學殺真菌劑β)每列中字母相同的兩個值之間的差異不明顯(P = 0.05時Ducan』 s多範圍檢 驗)如表4所示，組合物1和2表現出一定水平的保護活性。組合物3和4與每個有 益微生物相比有提高了的保護活性。化學殺真菌劑，嘧菌酯(azoxystrobin)，在本測試中沒 有表現出良好的保護功能。這被認為是由於病原體對化學殺真菌劑嘧菌酯(azoxystrobin) 的抗性所致。平行地，也監測了黃瓜葉片上的微生物種群。在每次施用前的當天，每次處理用穿 孔器在黃瓜第三葉上取得3個葉圓片(直徑3釐米)。將收集的黃瓜葉圓片放入10毫升無 菌水中30分鐘，用手劇烈震蕩，製得葉片衝洗水。用10倍稀釋塗板法或用LB瓊脂培養基 測量微生物種群。基於它們在LB瓊脂培養基上的獨有集落形式，計數有益微生物。結果見 表5。表5黃瓜葉表面的微生物群落動態 A)在集落形成單位的基礎上轉化為對數值來計數微生物種群密度β)匪表示天然微生物G)BM表示有益微生物在表5中，當用組合物處理時，微生物種群密度與單獨用每種有益微生物相比，有 明顯的增加。詳細地說，組合物2與未處理的相比，天然微生物種群密度增加了 100倍。組 合物2的微生物種群也總體上高於組合物1。此外，含有有益微生物1的組合物3和含有有 益微生物2的組合物4表現出一定的減少天然微生物種群密度的活性。這種趨勢表明表4 中的保護活性是由每種有益微生物的種群增加而造成的。該實驗也確定了表5中所示的微 生物種群動態在溫室中的成體黃瓜植株上具有相似的重現。實施例4 針對有害昆蟲的防治在實驗室中評價了本發明所述的組合物10對危害十字花科植物的菱斑蛾 (Plutella xylostella)的殺蟲活性。捲心菜幼苗生長於溫室中，製備其葉圓片(直徑5釐 米)樣品，並在2000倍稀釋的組合物10的懸浮液中浸泡30秒。取出這些葉片，在通風罩 下乾燥。將10條長至第3幼蟲階段的菱斑蛾幼蟲置於葉圓片上，在放置後的24、48、72、96 和120小時檢測殺蟲活性。該實驗按照3次重複的隨機完全區組設計。按照韓國《農村發 展管理指南》(Rural Development Administration)評估殺蟲活性。結果在表6中給出。表6抗菱斑蛾(Plutella xylostella)的殺蟲活性 A)殺蟲活性(％ )為每次死亡幼蟲的百分率β)放置於葉圓片上以後的小時數c)每列中字母相同的兩個值之間的差異不明顯(P = 0.05時Ducan』 s多範圍檢驗)如表6所示，本發明所述的組合物10在處理後72小時具有100%的殺蟲活性。該 殺蟲活性顯著高於單獨使用有益微生物8的情況，使用組合物8達到100%殺蟲活性的時間 也比單獨使用有益微生物8的時間短。該實施例表明，本發明所述的組合物不僅可用於抗植物病原體的植物保護，也可 以用於抗有害昆蟲的植物保護。通過相似的方法，可以認為，本發明所述的組合物通過增加 有益微生物的種群來抑制有害生物如蟑螂、螞蟻、蝸牛等的拓展用途。實施例5:除草活性當一些植物病原體特異地感染限定數量的雜草樣植物時，含有這些植物病原體的 本發明所述的組合物可用於抑制或控制雜草樣植物。在本實施例中，以番茄作為雜草樣植 物的實例。含有8. OOlog集落形成單位/毫升的灰黴菌(Botrytis cinerea)孢子的本發明 所述的組合物1和2分別被稀釋200倍後，用50毫升足量噴霧於每個番茄幼苗直到滴下。 用類似於實施例2中所用的方法評估除草活性。基於感染葉片的面積百分比，在接種後的 3天和7天(3DAI和7DAI)評估除草活性。結果在表7中給出。表7抗番茄幼苗的除草活性 如表7所示，本發明所述的組合物可用於抑制雜草樣植物。更詳細地說，組合物 1和2的處理，與單獨用灰黴菌(Botrytis cinerea)處理相比，導致了番茄幼苗的更嚴重 的疾病發生。但是，在使用雜草病原體的情況下，雜草樣植物需要特別地定義，雜草病原 體需要具有致病上的高度選擇性。否則，因為雜草也是植物，雜草的病原體可能會導致作 物或植物的疾病。Lee等人報導了相似的結果(Boyoung Lee, Dalsoo Kim，和Choong-Min Ryu. 2008.不依賴附植群落促進細菌攻擊性的一種超吸收聚合物.植物病理學雜誌24 283-288)。本發明的發明者展示了本發明所述的組合物可以提高針對番茄幼苗一種細菌植 物病原體的攻擊性。工業適用性本發明具有工業價值，因為它提供了一種能夠補充或替代化學殺蟲劑或化學肥料 的組合物及其應用。
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權利要求
一種組合物，其中，該組合物含有超吸收聚合物，以提高存在於表面的微生物的生物活性或增加所述微生物的種群。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於，該組合物還含有至少一種能夠被所述 微生物利用的微生物營養物。
3.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於，該組合物還含有至少一種能夠抑制植 物病原體、有害昆蟲或雜草樣植物生長的或者能促進植物生長的有益微生物。
4.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於，該組合物還含有至少一種能抑制有害 動物生長的有益微生物。
5.根據權利要求1-4中的任意一項所述的組合物，其特徵在於，該組合物還含有至少 一種表面活性劑，以增加所述組合物在表面上的鋪展性。
6.根據權利要求1-4中的任意一項所述的組合物，其特徵在於，該組合物還含有至少 一種單一的或複合的礦物鹽，以增加所述組合物在水中的潤溼性。
7.根據權利要求1-4中的任意一項所述的組合物，其特徵在於，所述超吸收聚合物為 由澱粉製備的超吸收聚合物。
8.根據權利要求1-4中的任意一項所述的組合物，其特徵在於，所述超吸收聚合物的 含量為所述組合物的20-95重量％。
9.根據權利要求1-4中的任意一項所述的組合物，其特徵在於，在用水稀釋所述組合 物時，所述超吸收聚合物的含量為單位水量的0. 02-1. 0重量％。
10.根據權利要求1-4中的任意一項所述的組合物，其特徵在於，所述表面選自植物表 面、土壤表面或者動物皮膚表面，所述植物表面例如葉、莖、枝、花或果實的表面。
11.根據權利要求2所述的組合物，其特徵在於，所述微生物營養物含有PLNT培養基， 所述PLNT培養基包括以標準使用量為基準，各佔25重量％的馬鈴薯葡萄糖肉湯、Luria 肉湯基礎、營養肉湯和胰酶大豆肉湯。
12.根據權利要求3所述的組合物，其特徵在於，所述植物選自由黃瓜、辣椒、馬鈴薯、 水稻、番茄、大麥、小麥、梨和玫瑰所組成的組中。
13.根據權利要求3所述的組合物，其特徵在於，所述有益微生物選自由芽孢杆 菌屬(Genus Bacillus)、類芽抱桿菌屬(Genus Paenibacillus)、鏈黴菌屬(Genus Streptomyces)、木黴屬(Genus Trichoderma)、白粉菌寄生菌屬(Genus Ampelomyces)禾口支 頂孢屬(Genus Acremonium)所組成的組中。
14.根據權利要求3所述的組合物，其特徵在於，所述植物病原體選自由稻瘟 病菌(Magnaporthe grisea)、瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)、辣椒疫黴菌 (Phytophthora capsici)、灰毒菌(Botrytis cinerea)、禾柄f秀菌(Puccinia graminis)、 白粉菌(Blumeria graminis 艮口 Erysiphe gramini s)禾口 ■冑(Sphaerotheca fusca) 所組成的組中。
15.根據權利要求3所述的組合物，其特徵在於，所述有害昆蟲選自菜蛾屬 (Plutella)。
16.根據權利要求3所述的組合物，其特徵在於，所述雜草樣植物是指在種植者不期望 的時間及空間生長的植物。
17.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於，所述有害動物選自由蟑螂、螞蟻和蝸牛所組成的組中。
18.權利要求1-4中的任意一項所述的組合物在包括葉、莖、枝、花或果實在內的植物 表面或生長有草坪草的土壤表面上的應用。
19.權利要求1-4中的任意一項所述的組合物在抑制表面上的有害生物或促進植物生 長中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種組合物，該組合物能夠提高表面上天然微生物或有益微生物的生物活性或能夠增加微生物種群的密度。通過適當使用所述組合物，本發明提供了保護植物免受植物病原體、有害昆蟲或雜草樣植物侵害或促進植物生長的應用。通過適當使用本發明的組合物，可以增加天然微生物或有益微生物的生物活性或種群密度，並且提高後的微生物生物活性或種群密度可以保護植物免受有害生物(如植物病原體、有害昆蟲或雜草樣植物)的侵害，或者可以促進植物的生長。
文檔編號C12N11/00GK101883849SQ200880118881
公開日2010年11月10日 申請日期2008年9月26日 優先權日2007年10月5日
發明者金達洙 申請人:金達洙