用於擴增免疫球蛋白重鏈cdr3編碼序列的引物組合物及其用途的製作方法

2023-05-11 01:28:01 1

專利名稱：用於擴增免疫球蛋白重鏈cdr3編碼序列的引物組合物及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域。具體地，本發明涉及用於擴增免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列的引物組合物及其用途。更具體地，本發明涉及用於擴增免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列的引物組合物，富集免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列的方法，構建免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列的測序文庫的方法，確定免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的序列信息的方法，確定個體免疫狀態的方法，確定個體免疫狀態的系統。
背景技術：
免疫球蛋白、T細胞受體和HLA(人類白細胞抗原)是人類基因組中最活躍的分子，決定和反映了人和環境的相互作用。免疫大分子的多樣性使得機體能識別無數的外來物質和清除體內產生的部分代謝物。免疫大分子多樣性產生的機制主要有基因重排、體細胞突變、非模板核苷酸的插入與缺失等。免疫球蛋白重鏈重排指V、D、J三種基因片段重排形成多種CDR3編碼序列，首先是DJ基因片段重排，重排後的基因片段再與V基因進行組合，得到編碼CDR3的基因；在免疫球蛋白輕鏈中，先進行K鏈基因重排，若重排失敗，則λ鏈基因開始重排，由重排、非模板核苷酸的插入與缺失等機制產生多種多樣特異性的基因片段。由此，一個個體內可能產生1011個特異性的分子。免疫系統是機體抵禦病原菌入侵與免疫調節的重要系統，對其研究有很重要的意義。然而，目前對於⑶R3的研究仍有待改進。

發明內容
本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在於提出一種能夠有效地對免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列進行富集的手段。

根據本發明的一個方面，本發明提出了一種用於擴增免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的引物組合物。根據本發明的實施例，該引物組合物包括第一引物組，所述第一引物組由至少一種V區引物組成，所述至少一種V區引物的每一種均包含與至少一個V基因片段互補的序列；以及第二引物組，所述第二引物組由至少一種J區引物組成，所述至少一種J區引物的每一種均包含與至少一個J基因片段互補的序列。利用該引物組合物，能夠有效地對免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列進行富集，從而為對CDR3進行深入研究提供了便利的工具。在本發明的又一方面，本發明提出了一種構建免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的測序文庫的方法。包括以下步驟:根據前面所述的方法，獲得富集所述免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的擴增產物；以及針對所述擴增產物，構建DNA測序文庫，所述DNA測序文庫構成所述免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的測序文庫。由此，可以在對重鏈CDR3編碼序列進行富集的基礎上，構建可以用於測序的測序文庫。根據本發明的再一方面，本發明提出了一種確定免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的序列信息的方法。根據本發明的實施例，該確定免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的序列信息的方法包括以下步驟:根據前面所述的方法，構建免疫球蛋白重鏈CDR3測序文庫；以及對所述免疫球蛋白重鏈CDR3測序文庫進行測序，以便確定所述免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的序列信息。本發明再一方面提出了一種確定個體免疫狀態的方法。根據本發明的實施例，該確定個體免疫狀態的方法包括以下步驟:根據前面所述的方法，對所述個體的免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果；以及基於所述測序結果，確定所述個體的免疫狀態。通過該方法，能夠有效地獲得個體的免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的序列信息，從而可以有效地確定個體免疫狀態。本發明的又一方面提出了一種確定個體免疫狀態的系統。根據本發明的實施例，該確定個體免疫狀態的系統包括:免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列富集裝置，所述免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列富集裝置中設置有前面所述的引物組合物，以便對所述個體的核酸樣本富集免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列；文庫構建裝置，所述文庫構建裝置與所述免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列富集裝置相連，以便針對所述經過富集的免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列構建免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列測序文庫；測序裝置，所述測序裝置與所述文庫構建裝置相連，用於對所述免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果；以及分析裝置，所述分析裝置與所述測序裝置相連，用於對基於所述測序結果，確定所述個體的免疫狀態。由此，利用該系統，能夠有效地實施前述確定個體免疫狀態的方法，從而能夠有效地確定個體的免疫狀態。本發明的又一方面提出了一種試劑盒。根據本發明的實施例，該所述試劑盒中設置有前面所述的引物組合物。由此，利用該試劑盒能夠用於檢測免疫球蛋白重鏈的V-J重排，或者用於檢測免疫球蛋白重鏈CDR3的編碼序列。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明 的實踐了解到。


本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1是免疫球蛋白重鏈中包含VH、Dh和Jh構成的⑶R3的結構示意圖；圖2是根據本發明一個實施例的對免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列進行富集和測序的流程不意圖；圖3是根據本發明一個實施例的用於確定個體的免疫狀態的系統結構示意圖；圖4是根據本發明一個實施例的多重PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果；圖5是根據本發明一個實施例的對免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列測序後，所得到的V-J基因片段配對分布及風度的結果示意圖。
具體實施例方式下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。需要說明的是在本文中所使用的術語「第一」、「第二」等僅用於方便描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性。在本發明的描述中，除非另有說明，「多個」的含義是兩個或兩個以上。
根據本發明的一個方面，本發明提出了一種用於擴增免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的弓I物組合物。根據本發明的實施例，該引物組合物包括第一弓I物組和第二引物組。其中，第一引物組由至少一種V區引物組成，所述第二引物組由至少一種J區引物組成。在本文中所使用的術語「V區引物」指的是這樣的一種引物，其能夠特異性地識別免疫球蛋白重鏈家族中的V基因片段，從而可以引導進行聚合酶鏈式反應，由此第一引物組中所包含的V區引物的每一種均包含與至少一個V基因片段互補的序列。類似的，在本文中所使用的術語「J區引物」指的是這樣的一種引物，其能夠特異性地識別免疫球蛋白重鏈家族中的J基因片段，從而可以引導進行聚合酶鏈式反應，由此第一引物組中所包含的J區引物的每一種均包含與至少一個J基因片段互補的序列。進而，在V區引物和j區引物的引導下，可以通過擴增反應例如PCR擴增，從含有重鏈編碼基因的核酸樣本中特異性地擴增包含V基因片段和J基因片段的編碼序列。由於免疫球蛋白重鏈的CDR3是由V、D、J基因片段重排產物所編碼的，因而通過特異性識別V和J基因片段引物，即第一引物組和第二引物組，能夠有效地從包含CDR3編碼序列的核酸樣本中擴增獲得CDR3編碼序列的擴增產物，另外，基於CDR1、⑶R2屬於V基因，並沒有參與重排過程；在重鏈中，⑶R3是V-D-J重排的產物，因而通過採用根據本發明實施例的引物組合物，能夠高特異性地從樣本中擴增富集獲得CDR3的編碼序列，而不會存在其他的幹擾序列。從而能夠實現對重鏈CDR3編碼序列的有效富集，進而為針對CDR3進行深入研究提供了便利的工具。根據本發明的實施例，V區引物和J區引物在PCR擴增過程中的作用，並不受特別限制。根據本發明的一個具體示例，V區引物可以作為正義鏈引物，J區引物可以作為反義鏈引物。發明人發現，通過如此設置V區引物和J區引物，能夠進一步提高將引物組合物用於富集免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列時的富集效率。根據本發明的實施例，上述引物組合物能夠適用的免疫球蛋白類型，不受特別限制，本領域技術人員可以根據研究需要，選擇適當的免疫球蛋白作為研究對象。根據本發明的一個實施例，所述免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。由此，可以有效地將引物組合物用於對人類免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列進行富集，從而可以有效地用於對人體免疫狀況進行研究。另外，根據本發明的實施例，可以通過對V區引物和J區引物的序列進行選擇，實現一條引物可以識別多種V基因片段，從而可以進一步提高擴增的效率，減少引物的數目，降低成本。根據本發明的一個實施例，第一引物組的至少一種引物包含與多個V基因片段的保守區互補的序列。由此，可以在減少引物的數量的同時，提高對免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列進行富集的效率，發明人還發現，這樣操作能夠提高各CDR3編碼序列擴增的均一性，從而能夠真實地反映CDR3編碼序列在宿主中的分布比例。類似的，根據本發明的一個實施例，第二引物組的至少一種包含與多個J基因片段的保守區互補的序列。由此，可以在減少引物的數量的同時，提高對免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列進行富集的效率，發明人還發現，這樣操作能夠提高各CDR3編碼序列擴增的均一性，從而能夠真實地反映CDR3編碼序列在宿主中的分布比例。另外，根據J基因片段的序列特點，第二引物組可以僅由一條引物構成。因而根據本發明的一個實施例，第二引物組由一種簡併引物構成，該引物包含與多個J基因片段的保守區互補的序列。由此，可以在減少引物的數量的同時，提高對免疫球蛋白
重鏈CDR3編碼序列進行富集的效率，發明人還發現，這樣操作能夠提高各CDR3編碼序列擴
增的均一性，從而能夠真實地反映CDR3編碼序列在宿主中的分布比例。具體地，根據本發明的實施例，針對人類免疫球蛋白重鏈CDR3的序列特徵，本發
明提出了一組V區引物，和一種J區引物，其序列和名稱分別總結如下:
權利要求
1.一種用於擴增免疫球蛋白重鏈⑶R3序列的引物組合物，其特徵在於，包括: 第一引物組，所述第一引物組由至少一種V區引物組成，所述至少一種V區引物的每一種均包含與至少一個V基因片段互補的序列；以及 第二引物組，所述第二引物組由至少一種J區引物組成，所述至少一種J區引物的每一種均包含與至少一個J基因片段互補的序列， 任選地，所述V區引物是正義鏈引物，所述J區引物是反義鏈引物， 任選地，所述免疫球蛋白為人類免疫球蛋白 ， 任選地，所述第一引物組的至少一種引物包含與多個V基因片段的保守區互補的序列， 任選地，所述V區引物具有選自SEQ ID NO:1-20所示的核苷酸序列， 任選地，所述第二引物組的至少一種包含與多個J基因片段的保守區互補的序列，任選地，所述第二引物組由一種引物構成，該引物包含與多個J基因片段的保守區互補的序列， 任選地，所述J區引物具有如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列。
2.一種富集免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 提供核酸樣本，所述核酸樣本中包含編碼免疫球蛋白重鏈CDR3的核酸序列；以及 利用權利要求1所述的引物組合物，以所述核酸樣本作為模板，進行PCR擴增，以便獲得富集所述免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的擴增產物， 任選地，進一步包括: 從人外周血分離外周血單個核細胞；以及 從所述外周血單個核細胞提取所述核酸樣本， 任選地，通過密度梯度離心分離所述外周血單個核細胞， 任選地，所述PCR擴增為多重引物PCR擴增， 任選地，所述多重引物PCR擴增的退火溫度為60攝氏度， 任選地，進一步包括通過選自瓊脂糖凝膠電泳、磁珠純化和純化柱純化的至少一種分離純化所述擴增產物， 任選地，所述擴增產物的長度為140-280bp。
3.一種構建免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的測序文庫的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 根據權利要求2所述的方法，獲得富集所述免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的擴增產物；以及 針對所述擴增產物,構建DNA測序文庫，所述DNA測序文庫構成所述免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列的測序文庫， 任選地，針對所述擴增產物，構建DNA測序文庫進一步包括: 對所述擴增產物進行末端修復，以便獲得經過末端修復的擴增產物； 對所述經過末端修復的擴增產物進行3』端添加鹼基A，以便獲得3』末端添加鹼基A的擴增產物； 將所述3』末端添加鹼基A的擴增產物與接頭相連，以便獲得連接產物； 對所述連接產物進行PCR擴增，以便獲得第二擴增產物；以及將所述第二擴增產物進行純化回收，以便獲得回收產物，所述回收產物構成所述DNA測序文庫， 任選地，所述末端修復是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶進行的，所述Klenow片段具有5』 一 3』聚合酶活性和3』 一 5』外切酶活性，但缺少5』 一 3』外切酶活性， 任選地，利用Klenow(3』 -5』 exo-)對所述經過末端修復的擴增產物進行3』端添加鹼基A， 任選地，將所述具有粘性末端A的擴增產物與接頭相連是利用T4DNA連接酶進行的， 任選地，通過選自瓊脂糖凝膠電泳、磁珠純化和純化柱純化的至少一種分離純化所述第二擴增產物。
4.一種確定免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列信息的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 根據權利要求3所述的方法，構建免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列測序文庫；以及 對所述免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列測序文庫進行測序。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，利用選自Hiseq2000、S0LiD、454、和單分子測序裝置的至少一種進行所述測序。
6.一種確定個體免疫狀態的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 根據權利要求4或5所述的方法，對所述個體的免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果；以及基於所述測序結果，確定所述個體的免疫狀態。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，基於所述測序結果，確定所述個體的免疫狀態進一步包括: 將所述測序結果與對照序列進行比對，以便確定所述個體中所包含的免疫球蛋白重鏈⑶R3的亞家族類型，以及各亞家族類型的相對比例。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，在多個不同的時間點，從相同的個體提取樣品，並分別根據權利要求4或5所述的方法，獲得多個測序結果；以及 將所述多個測序結果進行比對，以便確定所述個體中免疫球蛋白重鏈CDR3亞家族類型以及相對比例的變化。
9.一種確定個體免疫狀態的系統，其特徵在於，包括: 免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列富集裝置，所述免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列富集裝置中設置有權利要求1所述的引物組合物，以便對所述個體的核酸樣本富集免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列； 文庫構建裝置，所述文庫構建裝置與所述免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列富集裝置相連，以便針對所述經過富集的免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列構建免疫球蛋白重鏈⑶R3編碼序列測序文庫； 測序裝置，所述測序裝置與所述文庫構建裝置相連，用於對所述免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果；以及 分析裝置，所述分析裝置與所述測序裝置相連，用於基於所述測序結果，確定所述個體的免疫狀態， 任選地，所述分析裝置進一步包括比對單元，所述比對單元中存儲有對照序列，用於將所述測序結果與對照序列進行比對，以便確定所述個體中所包含的免疫球蛋白重鏈CDR3的亞家族類型，以及各亞家族類型的相對比例。
10.一種試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中設置有權利要求1所述的引物組合物， 任選地，所述試劑盒用於檢測免疫球蛋白重鏈的V-J重排； 任選地，所述試劑盒用 於檢測免疫球蛋白重鏈⑶R3的編碼序列。
全文摘要
本發明涉及用於擴增免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的引物組合物，富集免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的方法，構建免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的測序文庫的方法，確定免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列的序列信息的方法，確定個體免疫狀態的方法，確定個體免疫狀態的系統。該引物組合物包括第一引物組，所述第一引物組由至少一種V區引物組成，所述至少一種V區引物的每一種均包含與至少一個V基因片段互補的序列；以及第二引物組，所述第二引物組由至少一種J區引物組成，所述至少一種J區引物的每一種均包含與至少一個J基因片段互補的序列。利用該引物組合物，能夠有效地對免疫球蛋白重鏈CDR3編碼序列進行富集，從而為對CDR3進行深入研究提供了便利的工具。
文檔編號C40B40/08GK103184216SQ201110444740
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者洪雪玉, 劉曉, 曾曉靜, 蘇政, 張俊傑, 王俊 申請人:深圳華大基因科技有限公司, 深圳華大基因研究院