輸送黏膜疫苗用的肽的製作方法

2023-04-23 06:52:01

專利名稱：輸送黏膜疫苗用的肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及疫苗和免疫治療領域。特別的是，本發明涉及一種包含佐劑 肽和抗原的鼻用製劑組合物，以及使用該組合物進行黏膜免疫的方法。
發明的背景
疫苗已經^皮證實為預防感染性疾病的成功的且易於接受的方法。其具有 經濟效益，不會誘發針對目標病原體的抗生素耐藥性，也不影響宿主體內的 正常菌群。在許多例子中，例如通過誘導抗病毒免疫，疫苗能夠預防那些無可 行的治療或緩解方式可用的疾病。
正如現有技術所熟知的，疫苗的功能在於啟動免疫系統,對免疫原性物 質或抗原(抗原物質)進行應答，典型的是具有感染性的有機體或其一部分， 以非感染性或非致病性的形式進入機體。 一旦免疫系統^^引發，或是對有機 體敏感，隨後作為感染性病原體的有機體就暴露於免疫系統中並引發快速而 強烈的免疫反應，從而在病原體在宿主機體中複製並感染相當數量的宿主細 胞進而引發病症之前破壞這些病原體。用於引發免疫系統的物質或抗原可以 是具有較小感染性的完整有機體，即已知的減毒有機體，或是在一些例子中，
為有機體的一部分,如糖類、蛋白質或代表有機體的各種結構成分的肽。
在許多例子中，為了刺激免疫系統達到使疫苗發揮作用的程度，例如致 免疫性，就必須加強針對疫苗中存在的抗原的免疫反應。許多蛋白質，絕大 部分肽以及糖類抗原在單獨給予時不會產生足夠的抗體反應形成免疫性。這 些抗原需要在免疫系統中被視為外源性時，才會引發免疫反應。因此，建議使 用佐劑來刺激免疫反應。
最為人所熟知的佐劑即弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant), 包含一種存在於油/水乳液中的分枝桿菌的混合物。弗氏佐劑以兩種方式發 揮作用第一，通過加強細胞和體液性介導的免疫性；第二，通過截斷抗原刺 激的快速分散("貯庫效應"(depot effect))。然而，由於該物質常引起的 有毒的生理性反應與免疫反應，弗氏佐劑無法應用於人體。另一種已經顯示 出具有免疫刺激性或佐劑活性的分子為內毒素，也被稱作脂多糖 (li,olysaccharide,LPS)。 LPS通過觸發一種"天然"免疫反應來刺激免 疫系統一這種反應經過演化使得有機體能夠識別內毒素(以及入侵細菌的一 部份)，而不需事先與該有機體接觸。然而LPS毒性太強以致於不能成為可用 的佐劑，與內毒素結構相關的分子，例如單磷醯基脂質A(monophosphoryl lipid A,MPL)，已經作為佐劑進行臨床試驗。然而，目前FDA核准用於人體 的佐劑只有鋁鹽(alum),其通過抗原沉澱而"貯存，，抗原。Alum也能刺激針 對抗原的免疫反應。
因此,在本領域中公認的需要這樣一種化合物，即與抗原單獨注射或與 alum共同給藥相比，它能夠與抗原共同給藥來刺激免疫系統針對抗原產生更 強的抗體反應。而且，由於黏膜疫苗的發展需要應用特殊的佐劑，用於系統性 免疫反應的佐劑，例如Alum通常對於黏膜免疫反應不起效。儘管近十年來對 於黏膜性疫苗用佐劑有了深入的研究，但到目前為止尚未發現適合用於人體 的佐劑。佐劑研究的重點在於其有效性與毒性，而候選的黏膜佐劑無法完全 滿足高效性與無毒性的要求。此外，絕大部分試驗的黏膜佐劑都是尚未了解 其作用機制的複雜分子。申請人在本發明中提供一種可選擇的針對抗原誘發 免疫反應的無毒的肽佐劑。此肽的生物活性已經被詳細說明，且其用作為佐 劑的作用機制也已得到研究。
本發明的黏膜佐劑的一個例子是一種閉合帶毒素(zonula occludens toxin, Z0T)的肽(參見例如第5， 665， 389號；第5， 908, 825號；第5， 864， 014 號；第5,912， 323號；第5， 948, 629號；第5, 945， 510號與第6， 458, 925號
美國專利)。美國專利第5,908， 825號記載了一種用於經鼻輸送的鼻用製劑
組合物，其中包含一種治療劑與一種使經鼻吸收有效量增加的純化的霍亂弧
菌(f7^r/oc力o/ers)閉合帶毒素。這種純化的霍亂弧菌(KWr/o c力o/ers) 閉合帶毒素經SDS-PAGE分析表明具有約44kDa的分子量，然而其結構信息尚 未被了解或披露。相關美國專利第5, 864, 014號和第5, 912, 323號進一步披 露了純化的霍亂弧菌閉合帶毒素的受體。
來自於霍亂弧菌的閉合帶毒素(Z0T)已被鑑定為黏膜免疫的佐劑 (Infect. I隨n. 1999， 67: 1287; Infect. I咖un. 2003， 71:1897)。將Z0T與小 鼠的可溶性抗原通過鼻腔給藥，刺激產生了系統性的體液與細胞介導的反應, 該反應與卵白蛋白抗原誘導的特異性的黏膜反應相同 (Infect. I,n, 2003， 71: 1897) 。 Z0T是一種44. 8kDa的蛋白質，其與上皮細 胞上的受體結合，且調節閉合帶(tight junction),誘導黏膜屏障通透性的 提高。Z0T對閉合帶的作用是可逆的，不會造成組織受損(J.Clin Invest. 1995, 96: 710)。上皮細胞上的Z0T受體的已經被部分定性，近來一種 與Z0T同源的哺乳動物蛋白質已經被確認並命名為Zonulin。有趣的是,此種 由上皮細胞釋放出的蛋白質顯示出具有閉合帶內部調控子的功能，並且能夠 與ZOT所結合的同樣的受體結合(Ann.NY.Acad Sci. 2000， 915: 214) 。 Z0T作 為佐劑的機理，可能包括了其與鼻黏膜上的Z0T受體的結合，調節閉合帶以 及黏膜下層的抗原通路，隨後暴露於免疫系統的細胞中。
為了預防感染性疾病而發展黏膜性疫苗是非常需要的。黏膜性免疫與胃 腸道外免疫相比具有幾個優點。黏膜性免疫在感染部位(局部)誘發免疫反 應。另外，由於黏膜免疫系統的固有特性,在一個黏膜位置上的免疫反應能夠 誘發遠處部位(區域)發生特定反應。這種靈活性對於消除針對免疫接種形成 的文化上的和宗教上的障礙是重要的，因為保護性免疫(例如對抗性傳播疾 病)在實際操作中可以在各自分離的黏膜部位誘導產生。除了對抗在黏膜上 的抗原所需的局部反應之外，黏膜性疫苗還誘發包括體液與細胞介導的反應 的系統性免疫反應。因此，可以開發黏膜性免疫來對抗經由其它途徑(如血 液或皮膚)造成的感染。最後，黏膜性疫苗的給予不需要使用針頭,這可以提 高疫苗的順應性，消除了對血液傳播傳染的疑慮。綜上所述，黏膜性疫苗也可 以與預防性或治療性免疫一起用於對抗癌症。這些疫苗可以同時對抗感染物 (如幽門螺^走桿菌(〃e/2'co^"er ; 7/o/"/),乳突病毒(/^/7///o鵬"'r"s)，皰
滲病毒Uferi7M F/rM))所導致的癌症以及不同病原的癌症(如黑色素瘤，結
腸癌和其它癌症)。
有趣的是,絕大部分人類病原體是透過黏膜途徑獲得的，然而，目前很少 使用黏膜性疫苗。現在使用的疫苗是基於活體減毒微生物。此外，當純化的 抗原經由黏膜表面輸送時，本身並不能刺激/誘發免疫反應的發生。因此，這 樣的疫苗需要使用特殊的佐劑。然而不幸的是，如上所述，缺乏安全有效的 佐劑很大程度上阻礙了黏膜性疫苗的開發。 一種有效的黏膜性佐劑可允許抗
原(Ag)穿過黏膜屏障，並且易於誘發抗原特異性免疫反應。
本申請人揭示了佐劑肽,例如Z0T肽，以及將抗原與佐劑肽一起經黏膜輸 送,從而誘發針對抗原的特異性的系統和/或黏膜反應的方法。由於抗原透過 黏膜輸送不誘發免疫反應，申請人發現將其與ZOT肽共同給藥可以誘發針對 抗原的系統性與黏膜性反應。佐劑肽能夠促進抗原透過黏膜輸送。本發明所 述佐劑肽的優勢在於其無毒性、效果可逆、避免了內毒素損害、合成簡單以 及生產和純化便宜。
發明概要
本發明的第 一個方案是一種在哺乳動物體內誘發針對抗原的免疫反應 的方法，包括向該動物給予具有胺基酸序列FCIGRU序列號1 (SEQ ID NO. l)) 的肽或其功能性衍生物以及抗原，以增強哺乳動物對抗原的免疫反應。
本發明的第二個方案是一種通過哺乳動物的黏膜輸送抗原的方法，包 括向哺乳動物的黏膜給予抗原和具有胺基酸序列FCIGRL的肽或其功能性4汙 生物。
本發明的第三個方案是一種通過鼻組織輸送抗原的方法，包括向鼻組 織給予抗原和具有胺基酸序列FCIGRL的肽或其功能性^f汙生物。
本發明的第四個方案是一種誘發針對抗原的系統性反應的方法，包括 通過哺乳動物的黏膜給予抗原和具有胺基酸序列FCIGRL的肽或其功能性衍 生物。
本發明的第五個方案是一種誘發針對抗原的黏膜反應的方法，包括通 過哺乳動物的黏膜給予抗原和具有胺基酸序列FCIGRL的肽或其功能性衍生 物。
本發明的第六個方案是一種用於誘發免疫反應的疫苗組合物。該疫苗 包含用於誘發免疫反應的抗原，以及具有胺基酸序列FCIGRL(序列號l(SEQ ID NO. l))的肽或其功能性衍生物。該疫苗為黏膜性疫苗並且被輸送至哺乳
動物的黏膜。
本發明的第七個方案是一種將抗原輸送至哺乳動物的黏膜的方法，包括
向哺乳動物給予抗原和具有胺基酸序列FCIGRL(序列號i(SEQ ID NO. l))的 肽或其功能性^f生物。
在某些方案中，給予方式是鼻內給藥、陰道內給藥、口服給藥或經腸道 給藥。給藥劑型可以是氣霧劑、吸入劑、滴劑、乳劑或類似劑型。
在某些方案中，肽包^"選自由下列序列組成的組中的序列Xaa^ys lie Giy Arg Leu卿ID NO: 2) ， Phe Xaa2 lie Giy Arg Leu, ID NO: 3) ， Phe Cys Xaa3 Gly Arg Leu (SEQ ID NO: 4) ， Phe Cys lie Xaa4 Arg Leu (SBQ ID NO: 5)， Phe Cys lie Gly Xaa5 Leu (SEQ ID NO: 6)，以及Phe Cys lie Gly Arg Xaau(SEQ ID NO: 7)。多肽的長度少於IO個胺基酸殘基，Xaa;選自由Aia、 Va}、 Leu、 Ile、 Pro、 Trp、 Tyr和Met組成的組。Xaa2選自由Gly、 Ser、 Thr、 Tyr、 Asn和Gln組成的組。Xaa;逸自由Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Trp和Met組 成的組。Xaa4選自由Giy、 Ser、 Thr、 Tyr、 Asn、 Ala和Gin組成的組。Xaa5 選自由Lys和His組成的組。Xaa6選自由Aia、 Val、 Leu、 Iie、 Pro、 Trp 和Met組成的組。
在其他方案中，肽包括選自由下列序列組成的組中的序列XaaiXaa2Iie Gly Arg Leu (SEQ ID NO: 8) ， Xaas Cys Xaa3 Giy Arg Leu (SEQ ID船9)， Xaa) Cys Ile Xaa4 Arg Leu (SEQ ID NO: 10), Xaa! Cys Ile Giy Xaa5 Leu(S蹄ID NO: n), Xaa! Cys lie Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO: 12) ， Phe Xaa2 Xaa3 Gly Arg Leu (SEQ ID NO: 13)， Phe Xaa2 lie Xaa4 Arg Leu (SEQ ID NO: 14)， Phe Xaa2 lie (Uy Xaa5 Leu (SEQ ID恥i5), Phe Xaa2 Ile Gly Arg XaaJSEQ ID NO: 16)， Phe Cys Xaa3 X, Arg Leu (SEQ ID恥17), Phe Cys Xaa3Gly Xaa5 Leu (SEQ ID NO: ， Phe Cys Xaas Giy Arg XaaJSEQ ID NO: 19), Phe Cys lie Xaa4 XaasLeu(SEQ 10恥20), Phe Cys Ile Xaa4 Arg Xaa6(SEQ ID NO: 21),以 及Phe Cys lie Gly Xaa5 Xaa"SEQ ID NO', 22)。多肽的長度少於10個氨基 酸殘基。Xaa!選自由Aia、 Val、 Leu、 Iie、 Pro、 Trp、 Tyr和Met組成的組。 Xaa2選自由Gly、 Ser、 Thi:、 Tyr、 Asn和Gin組成的組。Xaa3逸自由iUa、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Trp和Met組成的組。Xa^選自由(Uy、 Ser、 Thr、 Tyr、 Asn、 Ala和Gin組成的組。Xaa;選自由Lys和His組成的組。Xaas選 自由Aia、 Vai、 Leu、 Iie、 Pro、 Trp、 Tyr和Met組成的組。
在其它方案中，舦佐劑是SLIGRL (SEQ ID NO: 23)。在其它方案中，肽佐
劑是SLIGKV (SEQ ID NO: 24 )。
在某些方案中，本發明是一種誘發針對抗原的系統性與黏膜性反應的方 法，包括給予抗原和具有選自由SEQ ID NO:"和SEQ ID NO: 24組成的組中 的胺基酸序列的肽。
在某些方案中，本發明是一種誘發針對抗原的免疫反應的方法，包括給 予抗原與具有選自由SEQ ID NO:"和SEQ ID NO: 24組成的組中的氨基, 列的肽。
在一種方案中，本發明提供了誘發動物體內免疫反應的方法。該方法可 以包括給予動物黏膜一種或多種抗原以及一種或多種肽佐劑。在某些方案中， 至少一種抗原與至少 一種肽佐劑是以組合物的方式給予的，例如，抗原和佐 劑可以存在於溶液中(例如水溶液，如鹽水溶液)。組合物可以進一步包括一 種或多種藥學上可接受的賦形劑(如，鹽、緩衝液、緩衝鹽、糖、清潔劑和滑 石粉等)。該方法可以在任何類型的動物上實施，例如在哺乳動物上，如人類。 用於本發明的肽佐劑可以包含序列FCIGRL，其長度可以為約6到約50個氨基 酸、約6到約25個胺基酸、約6到約15個胺基酸。任何期望的抗原都可以 使用，例如，麻療病毒抗原(measles virus antigens)、腮腺炎病毒抗原 (咖，vims antigens)、風滲病毒抗原(rubella virus antigens)、 白喉 棒狀桿菌抗原(Cor/"e&"er/咖^ 》力/力er/ae antigens)、百日咳博德特氏 菌抗原(》o_n^e"a per■s/s antigens)、破傷風桿菌抗原(67oW"W咖 fefa"/ antigens)、炭症才幹菌4元y^、 ("ac/7/ws a/ f力rac/i" antigens) 、 i充感 病毒抗原(influenza virus antigens)及其組合。在一個具體的方案中，本
發明是提供一種在動物(例如，哺乳動物如人類)體內誘發免疫反應的方法， 其中至少一種肽佐劑包含序列FCIGRL，組合物是水溶液，組合物中包含一種 或多種選自由麻滲病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、風滲病毒抗原、白喉棒狀杆 菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破傷風桿菌抗原、炭疽桿菌抗原和流感病 毒抗原組成的組中的抗原。
在另 一方案中，本發明提供了用於黏膜給藥的免疫原性組合物。該組合 物可以包含一種或多種抗原以及一種或多種肽佐劑。該組合物可以進一步包 含一種或多種藥學上可接受的賦形劑(如鹽、緩衝液、緩沖鹽、糖、清潔劑 和滑石粉等)。在某些本發明的組合物中，至少一種抗原選自由麻疹病毒抗 原、腮腺炎病毒抗原、風療病毒抗原、白喉棒狀桿菌抗原、百日咳博德特氏 菌抗原、破傷風桿菌抗原、炭疽桿菌抗原和流感病毒抗原組成的組。在本發
明的某些組合物中，至少一種肽佐劑包含序列FCIGRL。肽佐劑的長度可以是 約6到約50個胺基酸、約6到約25個胺基酸或約6到約15個胺基酸。在 某些方案中，本發明的組合物可以存在於水溶液(例如鹽水溶液)中，並且可 以進一步包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑。在一個具體方案中，用於 黏膜給藥的免疫原性組合物可以包含至少一種含有序列FCIGRL的肽佐劑，組 合物可以存在水溶液中，組合物可以包含至少一種選自由麻瘮病毒抗原、腮 腺炎病毒抗原、風疹病毒抗原、白喉棒狀桿菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、 破傷風桿菌抗原、炭疽桿菌抗原和流感病毒抗原組成的組中的抗原。
在本發明的另一個方案中，本發明提供用於黏膜給藥的疫苗。該疫苗可以 包含一種或多種抗原以及一種或多種肽佐劑。任何合適的抗原都可以使用， 例如，選自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、風瘮病毒抗原、白喉棒狀杆 菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破傷風桿菌抗原、炭疽桿菌抗原和流感病 毒抗原組成的組中的抗原及其組合。在某些方案中，用於黏膜給藥的疫苗可 以包括至少一種含有序列FCIGRL的肽佐劑。適合的肽佐劑的長度可以是約6 到約50個胺基酸、約6到約25個胺基酸、或約6到約15個胺基酸。用於 黏膜給藥的疫苗可以存在於水溶液(例如鹽水溶液)中，並且可以進一步包含 一種或多種藥學上可接受的賦形劑。在一個具體的方案中，用於黏膜給藥的 疫苗可以包含至少一種含有序列FCIGRL的肽佐劑，且該疫苗可以存在於水溶 液中，疫苗可以包含至少一種選自由麻滲病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、風滲 病毒抗原、白喉棒狀桿菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破傷風桿菌抗原、 炭疽桿菌抗原和流感病毒抗原組成的組中的抗原。
在另一個方案中，本發明提供一種刺激抗原呈遞細胞的方法。該方法可 以包括將抗原呈遞細胞與肽佐劑接觸。任何抗原呈遞細胞均可以使用本發明 的方法進行刺激，例如，單核細胞和/或巨噬細胞都可以被刺激。當抗原呈遞 細胞為人類細胞時，刺激抗原呈遞細胞可以導致抗原呈遞細胞的人類主要組 織相容性I類和II類分子和/或CD40的表達量升高。適於刺激抗原呈遞細 胞的佐劑肽包括^旦不限於，含有序列FCIGRL的肽。典型地，佐劑肽可以以刺 激抗原呈遞細胞的有效濃度存在。有效濃度可以自約0. 01jag/ml到約500 jig/ml，自約0. 1 jng/ml到約250|ag/ml，自約1 )ii g/ml到約100 |i g/ml，自 約l|ig/ml到約75 jag/ml,自約1 ja g/ml到約50|iig/ml，自約1 p g/ml到 約40pg/ml，自約1 |ig/ml到約30|iig/ml，自約1 |u g/ml到約20jag/ml。
這些方案以及其它方案對於閱讀了本說明書的本領域技術人員而言將
是顯而易見的，其為本領域提供了治療和/或預防疾病的試劑與方法。


圖1在四種劑量下，佐劑AT1002的劑量反應曲線(AT1002具有序列FCIGRL， SEQ ID: 1)圖2在五種劑量下，佐劑AT1002的劑量反應曲線。圖3經四次與五次免疫反應後，佐劑AT1002的劑量反應曲線的對比。圖4以TT和不同劑量的佐劑AT1002進行六次免疫後i秀髮的血清抗TT的IgA反應。圖5以TT和不同劑量的佐劑AT100:2進行六次免疫後，在陰道分泌物中 誘發的抗TT的IgA反應。圖6為一條狀圖，其顯示了接受單獨(白色條帶)將破傷風類毒素(TT; 1 jiig/劑)或者共同將TT+AT1002 (22.5 yg/劑;斜紋條帶)經鼻內給藥四周 後，經過破傷風類毒素刺激的小鼠(C57BL/6)的脾臟細胞的增殖反應。圖7顯示了以AT1002 (SEQ ID: 1)在所示濃度下刺激人類單核細胞時流式 細胞儀(FACS)的分析結果。在18小時後收集細胞，以所示單克隆抗體染 色並以流式細胞儀進行分析。圖8顯示了以AT1002 (SEQ ID: 1)在所示濃度下刺激人類巨噬細胞時流式 細胞儀(FACS)的分析結果。在18小時後收集細胞，以所示單克隆抗體染 色並以流式細胞儀進行分析。發明詳述定義說明書中所述的"一"可以指一個或多個。其用於在本申請的權利要求 書中，當其與"包含，， 一起使用時，"一"是指一個或一個以上。在此所使用的"另一個，，可以指至少第二個或更多。在此所使用的"肽佐劑"或"佐劑肽"，是指一種通過誘發、加強和/或 促進針對抗原的免疫反應來促進或調節抗原功能而作為功能性組分(組合物 中)的肽。在此所使用的"抗原，，是指任何可以引起免疫反應的抗原性物質(免疫 原)，其可以由，例如，特異性結合抗原的抗體的產生來決定。在此所使用的"黏膜，，是指一種直接或間接地與外界(例如消化道、呼
吸道與泌尿生殖道)相聯繫的形成人體的通道或空腔的分泌粘液的膜(充滿 粘液腺體)，其功能在於保護、支持、吸收營養或分泌粘液、酶和鹽類。它 是由深部血管結締組織基質和表面上皮組織組成，所述基質在消化道導管的 多個部分中包含薄且明確的無橫紋肌肉層，所述上皮組織下面具有基底膜， 其種類和厚度有所變化，但總是通過嵌於膜中的細胞和眾多腺體的分泌保持 溼潤和柔軟光滑。在實施例中，"黏膜，，是指鼻、陰道、直腸、口腔或小腸 的黏膜。在此所使用的"肽，，是指具有胺基酸序列SEQ ID: 1 (FCIGRL)的Z0T肽及 其功能性衍生物，包含但不限於SEQ ID N0S: 2到24。在某些方案中，本發明 的肽是指AT1002 (FCIGRL, SEQ ID: 1)。在此所使用的"疫苗，，是指一種給予受試者以產生或人為地提高對特定 疾病的免疫性的製劑。該製劑包括抗原，例如滅活的微生物、活的減毒有機 體、活的完全致病有機體、重組生物分子、來自病原體的免疫原性蛋白、抗 體、脂質、多糖、糖以及類似物，和肽佐劑。本發明本申請人開發了一種來自霍亂孤菌噬菌體CTXO的ZOT蛋白質的肽，如 本發明所揭示的，其具有新型佐劑肽的功能。該佐劑肽包括胺基酸序列 FCIGRL(SEQ ID: l)及其功能性衍生物。佐劑肽具有少於10個的胺基酸殘基。 佐劑肽可以包含僅6個胺基酸FCIGRL (SEQ ID: 1)，也可以包含其它胺基酸。 其它胺基酸可以提供其它的功能，例如，利於純化的抗原標記。肽FCIGRL的功能性衍生物包括,例如，Xaal Cys lie Gly Arg Leu卿ID NO: 2)， Phe Xaa2Ile Gly Arg Leu(SEQ ID NO: 3), Phe Cys Xaa3 Gly Arg Leu (SEQ ID NO: 4)， Phe Cys lie Xaa4 Arg Leu (SEQ ID NO: 5), Phe Cys lie Gly Xaa5 Leu (SEQ ID NO: 6)，以及Phe Cys lie Gly Arg Xaa6 (SEQ ID NO: 7) 。 Xaal選 自由Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Trp、 Tyr和Met組成的組。X^選自由Gly、 Ser、 Thr、 Tyr、 Asn和Gln組成的組。X^選自由Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Trp和Met組成的組。X,"選自由Gly、 Ser、 Thr、 Tyr、 Asn、 Aia和Gln組 成的組。Xaa5選自由Lys和His組成的組。X^選自由Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Trp和Met組成的組。肽FCIGRL的功能性衍生物進一步包括Xaal Xaa2 Ile Gly Arg Leu (SEQ ID NO: 8)， XaalCys Xaa; Gly Arg Leu (SEQ ID NO: 9), Xa" Cys lie Xaa4 Arg Leu (SEQ ID NO: 10)， Xaal Cys Ile Gly Xaa5 Leu (SEQ ID NO: 11), Xaal Cys lie Gly ArgXaa6 (SEQ ID NO: 12), Phe Xaa2 Xaa3 Gly Arg Leu (SEQ ID NO: 13)， Phe Xaa2 Ile Xaa4 Arg Leu (SEQ ID NO: 14)， Phe Xaa2 Ile Cly Xaa5 Leu (SEQ ID NO: 15), Phe Xaa2 I le Gly Arg Xaa6 (SEQ ID NO: 16), Phe Cys Xaa3 Xaa4 Arg Leu (SEQ ID NO: 17), Phe Cys Xaa3 Gly Xaa5 Leu (SEQ ID NO: 18), Phe Cys Xaa3 Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO: 19)， Phe Cys Ile Xaa4 Xaa5 Leu (SEQ ID NO: 20), Phe Cys Ile Xaa4 Arg Xaa6 (SEQ ID N0:21)以及Phe Cys Ile Gly Xaa5 Xaa6 (SEQ ID NO: 22) 。 X^選自由 Ala、 Val、 Leu、 Iie、 Pro、 Trp、 Tyr和Met組成的組。Xaa2選自由Gly、 Ser、 Thr、 Tyr、 Asn和Gln組成的組。乙3選自由Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Trp 和Met組成的組。Xw選自由Gly、 Ser、 Thr、 Tyr、 Asn、 Ala和Gln組成的 組。Xw選自由Lys與His組成的組。X^選自由Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Trp和Met組成的組。任何長度的肽佐劑都可以使用。 一般而言，肽佐劑的長度範圍自大約6 到大約IOO，自大約6到大約90，自大約6到大約80，自大約6到大約70，自 大約6到大約60,自大約6到大約50,自大約6到大約40,自大約6到大 約30，自大約6到大約25，自大約6到大約20，自大約6到大約15,自大 約6到大約14,自大約6到大約13，自大約6到大約12，自大約6到大約 11，自大約6到大約10,自大約6到大約9，自大約6到大約8個胺基酸。 本發明的肽佐劑的長度可以自大約8到大約100,自大約8到大約90,自大 約8到大約80，自大約8到大約70,自大約8到大約60,自大約8到大約 50，自大約8到大約40，自大約8到大約30,自大約8到大約25，自大約 8到大約20,自大約8到大約15,自大約8到大約14，自大約8到大約13， 自大約8到大約12，自大約8到大約11,自大約8到大約10個胺基酸。本 發明的肽佐劑的長度可以自大約IO到大約IOO,自大約10到大約90，自大 約10到大約80,自大約IO到大約70,自大約10到大約60,自大約10到 大約50，自大約10到大約40，自大約10到大約30,自大約10到大約25, 自大約IO到大約20,自大約10到大約15，自大約10到大約14,自大約 10到大約13,自大約10到大約12個胺基酸。本發明的肽佐劑的長度可以 自大約12到大約100，自大約12到大約90，自大約12到大約80,自大約 12到大約70,自大約12到大約60，自大約12到大約50,自大約12到大 約40,自大約12到大約30,自大約12到大約25,自大約12到大約20， 自大約12到大約15,自大約12到大約14個胺基酸。本發明的肽佐劑的長 度可以自大約15到大約100,自大約15到大約90,自大約15到大約80,
自大約15到大約70,自大約15到大約60,自大約15到大約5Q，自大約 15到大約40,自大約15到大約30,自大約15到大約25,自大約15到大 約20，自大約15到大約19,自大約15到大約18，自大約15到大約17個 胺基酸。本發明的肽佐劑可以包含含有大約6，大約7,大約8,大約9,大 約IO,大約ll,大約12，大約13,大約14，大約15,大約20,大約30, 大約40,大約50,大約60，大約70,大約80,大約90，大約100個氨基 酸的肽。肽佐劑可以以化學方法合成，並且使用熟知的技術進行純化，例如^>力爿/7s/j^/s s刀d 6b/7/br/z^f/0/7 Eds. Mant ef <3/., C. R. C Press (1991)中i己 載的,以及肽合成儀,如Symphony (Protein Technologies, Inc.);或通過 使用重組DNA技術，例如，將編碼肽的核苷酸序列插入適當的表達載體中，例如大腸桿菌或酵母菌表達載體，並在各自的宿主細胞中表達，使用熟知的 技術對其進行純化。肽是用於促進抗原吸收的。此外，吸收透過黏膜進行，特別是透過鼻粘 膜。肽促進透過腸、血腦屏障、皮膚以及鼻黏膜的吸收(還參見未決的第1 0 / 8 9 1,4 9 2號美國申請，2004年7月15日申請，公開號為2 0 050059593,在此引用其全文以供參考)。因此肽可以與以鼻和/或 鼻黏膜組織為目標的抗原一起配製或共同給藥。4艮據本發明，藥物組合物可 以在給予前預先混合而成，或者兩種藥劑各自在2 4小時內給予、在體內混 合而成。優選的是兩種藥劑分別在12、 8 、 4 、 2或1小時內給予。經鼻輸送組合物通常包含直徑為約5 0 jam的水溶性聚合物，以用於削 弱黏膜纖毛清除功能，並達到可重複的經鼻給藥製劑的生物利用度。有益的 是，經鼻輸送組合物不需要如腸道輸送所需的胃腸道抗性。包含聚合物的經 鼻組合物是否適用其他賦形劑是需要慎重考慮的，以確保使肽佐劑結合於 黏膜表面。用於經鼻輸送的鼻用製劑組合物是本領域中熟知的。此鼻用製劑組合 物通常包含水溶性聚合物，該聚合物已被廣泛用於製備作為經鼻給藥 (Davis, In: Delivery Systems for Peptide Drugs, 125:4-21 (1986)) 的肽的載體的藥物劑型(Martin et al., In: Physical Chemical Principles of Pharmaceutical Science, 3rd Ed.,pages 592-638 (1983))。包埋於聚合物骨架中的肽的經鼻吸收性可以通過延遲鼻
黏膜纖毛清除功能而增強(Ill咖et al,, Int. J. Pharm,, 46:261-265 (1998))。其它可能的增強機制包括增加濃度梯度或減少肽吸 收的分散路徑(Ting et al. ， Pharm. Res. , 9: 1330-1335 (1992))。然而， 減低黏膜纖毛排除率已經被預期成為一種即將成功的，使經鼻給予的全身 性藥物實現可重複性的生物利用率的好方法(Gonda et al., Pharm. Res. 7: 69-75 (1990))。直徑約50 jii m的微粒可能會在鼻腔中沉積(Bjork et al，. Int. J. Pharm. ， 62:187-192 (1990);和Ilium et al, Int. J. Pharm., 39:189-199 (1987))，而直徑小於10微米的微粒會通過鼻的過濾系統，沉 澱於下呼吸道中。直徑大於200微米的微粒經鼻給藥後不會保留在鼻中 (Lewis et al， Proc. Int. Symp. Control ReL Bioact. Mater.， 17: 280-190 (1990))。本發明中所用的特定水溶性聚合物並無嚴格要求，可以選自任何已熟 知的用於經鼻劑型的水溶性聚合物。用於經鼻輸送的水溶性聚合物的典型 例子為聚乙烯醇(PVA)。該材料為可膨脹的親水性聚合物，其物理特性取 決於分子量、水解程度、交聯度以及結晶性(Pe卯as et al., In: Hydrogels in Medicine and Pharmacy, 3:109-131 (1987) )。 PVA可以通過相分離、 噴霧千燥、噴霧包埋以及噴霧凝集方式被用於分散材料的塗覆(Tinget al, supra )。還可加入常規的藥學上可接受的乳化劑、表面活性劑、懸浮劑、抗氧 化劑、滲透促進劑、增量劑、稀釋劑與防腐劑。水溶性聚合物也可用作載 體。其它的藥學上可接受的載體和/或稀釋劑對於本領域的技術人員而言 是熟知的(見，例如，Remington' s Pharmaceutical Science, 16th Ed.， Eds. Osol， Mack Publishing Co., Chapter 89 (1980); Digenis et al.， J. Pharm. Sci., 83:915-921 (1994); Vantini et al.， Clinica Therapeutica, 145:445-451 (1993); Yoshitomi et al., Chem. Pharm. Bull" 40:1902-1905 (1992); Thoma et al.， Pha歷zie， 46:331-336 (1991); Morishita et al.， Drug Design and Delivery, 7:309-319 (1991); 和 Lin et al.， Pharmaceutical Res.， 8: 919-924 (1991))。在此引用上述每篇文獻的全文以供參考。用於本發明的方法的組合物可以以吸入劑、液體滴劑、氣霧劑或其它 劑型給予，從而使組合物與黏膜相接觸。當以液體給予時，本發明的組合 物可以以水溶液方式給予，例如，鹽水溶液。必要時可以調節溶液的參數(例如pH、滲透率、粘度等)，以促進本發明的組合物輸送。例如，對 於含有AT1002的水溶液，優選的是可以將pH值調整為酸性pH以增加肽 佐劑的穩定性。本發明使用的特定抗原沒有嚴格要求，可以是例如任何的生物活性 肽、脂質、多糖、疫苗，或任何其它不能經細胞間通路吸收的成分，無論 其大小或帶電性。本發明所使用的疫苗的例子包括肽抗原和減毒微生物、病毒，寄生蟲 和/或真菌。本發明所使用的肽抗原的非限制性例子包括產腸毒素的大腸 桿菌的熱變性腸毒素的B亞單位、霍亂毒素B亞單位、白喉毒素、破傷風 桿菌毒素、百日咳毒素、腸病原體莢膜抗原、腸病原體的纖毛或菌毛、HIV 表面抗原、灰塵過敏原以及蟎蟲過敏原。其它本領域已知的例如流感、百 曰咳、HIV、腦膜炎球菌抗原、乳頭瘤病毒、細菌、病毒、寄生蟲、真菌 以及類似物也可以使用。根據本發明製備的疫苗的其它例子包括但不限 於，包含來自癌症的抗原(例如可溶性抗原)、來自病毒、細菌、寄生蟲、 真菌和/或蛋白感染素(prion)的抗原的疫苗。用於本發明疫苗的抗原可以 是任何來源的，例如可以為重組的、合成的、天然的或修飾的抗原。抗原 可以是減毒或去活的病毒、細菌、寄生蟲和/或真菌。抗原可以是重組體 病毒、細菌、寄生蟲和/或真菌。抗原也可以是表達異種疫苗抗原的重組 體病毒、細菌、寄生蟲和/或真菌。抗原可以是過敏原。本發明所使用的減毒和/或去活的微生物與病毒包括產腸毒素大腸杆 菌、腸病原性大腸桿菌、霍亂弧菌、弗氏痢疾桿菌、傷寒沙門菌與輪狀病 毒(Fasano et al， In: Le Vaccinazioni in Pedistria， Eds. Vierucci et al， CSH， Milan, pages 109-121 (1991); Guandalini et al， In: Management of Digestive and Uver Disorders in Infants and Children, Elsevior, Eds. Butz et al， Amsterdam, Chapter25 (1993); Levine et al, Sem. Ped, Infect. Dis.， 5: 243—250 (1994);與Kaper et al. Chin. Microbiol. Rev. ， 8:48-86 (1995)。在此引用上述每篇文獻的全文以供參 考)。癌症的例子包括那些由感染原(例如幽門螺旋桿菌、乳頭狀瘤病毒、 皰疹病毒)以及不同病因的癌症(例如黑色素瘤、結腸癌、前列腺癌與其 他)造成的癌症。的抗原的例子包括但不限於，麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、風疹病毒 抗原、白喉棒狀桿菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破傷風桿菌抗原、炭 疽桿菌抗原、流感病毒抗原以及癌症抗原。本發明所使用的抗原的劑量並無嚴格限制，可根據所選擇的特定成 分、目標疾病或病情，以及受試者的年齡、體重與性別改變。本發明所使用的ZOT肽的劑量並無嚴格限制，可根據受試者的年齡、 體重與性別而改變。 一般而言，本發明使用的用以經黏膜增強生物活性成 分吸收的肽的最終濃度範圍為約10—訓1(T"M,優選約10—6M$j 5. 0 x 10-5M。 在實施例中，為了達到這樣的最終濃度，單一口服製劑組合物中肽的劑量， 例如用於向腸黏膜給予的，通常為約4. Ong到2. 5微克，或4. Ong到1000ng, 優選40ng到80ng。在某些方案中，例如對於約20g的哺乳動物，抗原的 給予劑量為約2.5微克，肽佐劑的劑量為約22. 5微克(1: 10比例)。在 其它方案中，例如對於約20g的哺乳動物，抗原的給予劑量為約2. 5微克， 肽的劑量為約22. 5,或約15,或約7.5微克。本發明所使用的抗原與肽的比例並無嚴格限制，可依據特定時間內被 輸送的生物活性成分的劑量，甚至還可依據目標黏膜的類型而變化。通常 本發明中所用的治療劑或免疫原性試劑與肽的重量比在約1: 100至約3: 1，或l: 10至約2: l的範圍內。申請人預期，佐劑肽相對於抗原的含量 越高，能夠引發的系統和/或目標黏膜的免疫反應越強烈。保守取代，即將胺基酸以性質相似其它胺基酸取代，可以被應用於具 有序列SEQ ID N0: l的肽中。保守取代的例子包括但不限於，Gly^Ala、 ValIle"Leu、 AspGlu、 Lys ~>Arg、 Asn"Gln以及Phe"TrpWTyr。 典型的保守性胺基酸取代在約1到2個胺基酸殘基範圍內。使用本領域熟 知的電腦程式如DNASTAR軟體，或參考Dayhoffetal., (1987) i"〃ss^Prc^e//7 5b( i/e/ ce s/2d 57/7/cfwre(Nat1. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.),可以得到關於如何確定胺基酸殘基被取代後不會喪 失生物或免疫活性的指導。胺基酸取代被定義為一對一的胺基酸替換。當取代的胺基酸具有相似 的結構和/或化學性質時，它們的性質是保守的。保守性替換的例子是以 異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸，穀氨酸取代天冬氨酸，或是色氨酸取代蘇 氨酸。特別優選的肽的類似物包括性質保守的取代產物，例如具有相關側鏈 的胺基酸族中形成的取代產物。特別的是，胺基酸一般被分為以下的族 (1)酸性一天冬氨酸與穀氨酸；(2 )鹼性一賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3 ) 非極性一丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨 酸、色氨酸；(4)不帶電極性一甘氨酸、天冬醯胺、穀氨酸、半胱氨酸、絲 氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；以及(5 )芳香胺基酸一苯丙氨酸、色氨酸與酪氨 酸。例如，可合理預期的，分別以異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸，穀氨酸取 代天冬氨酸，絲氨酸取代蘇氨酸，或相似地以結構上相關的胺基酸相互間的 保守取代不會對生物活性產生重大影響。任何本領域已知的分析方法均可以用於確定本發明的肽的生物活性。例 如，分析方法可以包括(1)根據W sA， ^S^， 8: 5242-5246 (1991)—文中的記載，分析放置於尤斯灌流室(Ussing chamber) 中的迴腸的組織抗性(Rt)的減低結果；(2)如下文所述，分析尤斯灌流室 (Ussing chamber )中的腸上皮細胞單層的組織抗性(Rt)的減低結果；或 者(3)分析腸或鼻對治療劑或免疫原性試劑吸收的增強效果，如在W0 96/37196;美國專利申請第08/443， 864號，1995年5月24日申請；美國專 利申請第08/598,852號，1996年2月9曰申請；以及美國專利申請第 08/781, 057號,1997年1月9日申請中的記載。本發明的肽以可逆的和重複的方式快速打開閉合帶，因此可以作為鼻抗 原吸收促進劑來使用，ZOT也以同樣方式來使用(見W0 96/37196;美國專 利申請第08/443,86號，1995年5月24曰申請；美國專利申請第08/598,852 號，1996年2月9曰申請；美國專利申請第08/781, 057號，1997年1月9 曰申請)。上述所揭示的內容概括描述了本發明。此處披露的所有參考文獻都明確 地被引用以供參考。通過參考下文所述的特定的實施例將更全面地理解本發 明，此處提供的實施例僅是用於說明，並不作為本發明的保護範圍的限制。下列實施例證明通過給予抗原和含有SEQ ID No: 1的黏膜佐劑所誘 發的黏膜免疫反應可以在不同黏膜區域誘發血清IgG以及黏膜IgA,與其它 黏膜佐劑相比，其效果更好。因此，AT1002作為黏膜佐劑發揮作用，在受試 者體內誘發了針對抗原的免疫反應。實施例一使用破傷風類毒素(TT)與Z0T肽(AT1002 )進行鼻內免疫四隻C57BL/6雌性小鼠為一組，每組分別單獨以破傷風類毒素(TT)2. 5 iug，或以TT加上所示劑量的AT1002,或以TT加上已知的熱不穩定性腸毒 素(LT)佐劑作為對照組經鼻進行免疫。圖l顯示了四次免疫後，抗TT血清IgG的圖示平均滴度。結果顯示與 單獨用TT免疫的動物相比，AT1002作為佐劑發揮作用後，其對於TT的血清 反應更強。結果還進一步顯示了 30納摩爾劑量的AT1002相對最有效。圖2顯示了在四次免疫後，抗TT血清IgG的圖示平均滴度。結果顯示 了 AT1002誘發的抗TT血清反應較四次免疫後的反應強。再次顯示了 30納 摩爾劑量的AT1002相對最有效。以TT與不同劑量的佐劑AT1002進行六次免疫後，可以測定誘發出的血 清抗TT IgA反應(圖4)。四隻C57BL/6雌性小鼠為一組，各組分別單獨以 破傷風類毒素(TT) 2. 5jag,或以TT加上所示的劑量的AT1002經鼻免疫。 結果顯示了抗TT的血清IgA的圖示平均滴度。數據顯示AT1002誘發了對抗 一起給予的抗原的血清IgA。經過觀察，申請人進一步研究，誘發的反應可 以在一、二、三、四或五次免疫反應後發生。在以TT和不同劑量的佐劑AT1002六次免疫後，申請人還在陰道分泌物 中觀察到祐/i秀髮的抗TT的IgA反應(圖5 )。結果顯示抗TT的IgA的圖示平 均滴度，表明在遠離免疫位置的黏膜區域，AT1002誘發了對抗共同給予的抗 原的IgA。經過觀察，申請人進一步研究，誘發的反應可以在一、二、三、 四或五次免疫反應後發生。可以按照上述應用AT1002的方式來使用商品化的肽SLIGRL (小鼠，SEQ IDNo:23)和SLIGKV(人類,SEQ ID No: 24)(兩者均從Sigma公司購得)。簡 單來說，SEQIDNo:23或24之一的佐劑肽可與例如TT的抗原一起給予。免 疫反應的次數可以為l、 2、 3、 4、 5或6次。免疫反應是可以測定的，特別 是使用TT時，可以測定在血清和/或陰道分泌物中的抗TT的IgA以及抗TT 的IgG滴度。實施例二作為黏膜佐劑的ZOT肽這裡的結果證明肽AT1002發揮了黏膜佐劑的作用。更具體的說，在哺 乳動物的黏膜免疫反應中，其與AT1002共同給予會誘發血清中血清IgG、IgA 以及陰道分泌物中的黏膜IgA。
實施例三ATI002針對共同輸送的抗原誘發保護性反應。將破傷風類毒素(TT; ljig/單位劑量)單獨或與ATI002 ( 30jig/單位 劑量) 一起對小鼠(C57/BL6)進行鼻內給藥四周，兩個月後，以DP50劑量 (經過預先實驗測試，使50%動物麻痺劑量的50倍)的破傷風類毒素皮下刺 激小鼠，並監^L一周內發生麻痺和死亡的情況。表l中的結果顯示，單獨接 受TT免疫的小鼠沒有得到保護，但是接受了抗原和AT1002的小鼠全部得到 很好的保護。另外，在進行刺激前，立即對每個小鼠體內針對於抗原的血清 IgG滴度進行了分析。測量的滴度範圍則列於表中。表一經鼻內免疫的小鼠在破傷風類毒素刺激下的存活率 疫苗 存活數/小鼠數 抗TT IgG滴度範圍單獨TT 0/7 256-4， 096TT+AT1002 8/8 16,384-65,536結果表明a) AT1002對於共同給予的抗原誘發了保護性反應；b)以 AT1002使黏膜(鼻內)免疫誘發了針對系統性(皮下)刺激的保護性反應； 以及c)當在最後一次給予疫苗後兩個月進行刺激時，AT1002誘發了 "記憶 性，，保護反應。兩個月後的抗TT血清IgG的滴度仍然很高(注意兩個月的 時間對於小鼠生命周期而言是相當長的時間)。實施例4ATI002誘發細胞介導的反應參考圖6,單獨(白色條帶)將破傷風類毒素(TT; 1 )i g/單位劑量)或 將TT + AT1002 ( 22. 5lig/劑量，條紋條帶)對小鼠(C57BL/6)進行鼻內給 藥四周。在最後一次給藥後一周摘除脾臟，對脾細胞進行增殖分析測試，其 中在培養物中加入TT,並測定引入的氘代胸腺嘧咬核苷。刺激指數(含TT 的培養物的cpm/無TT的培養物的cpm)數值顯示以TT+AT1002免疫的小鼠 針對抗原增殖，而單獨以TT免疫的小鼠則沒有(數值等於或大於4認為是 陽性)。這些結果證實AT1002誘發了對抗共同給予的抗原的細胞介導的反應。 因此通過AT1002作為佐劑的黏膜性免疫反應，能夠激活抗原特異性T淋巴 細胞。
實施例5來自於健康捐獻者的外周血的人類單核細胞經純化後，在完全培養基中 進行培養。兩個小時後向培養物中加入刺激原，18小時後收集細胞，以所示 單克隆抗體染色，並以流式細胞儀(FACS)分析。結果見於圖7。圖7證實了 AT1002對於人類抗原呈遞細胞，如單核細胞或巨嗜細胞具 有免疫促進的效果。圖7顯示AT1002能夠上調單核細胞(粗體數字代表平均 螢光強度值)上的人類主要組織相容性I型與II型分子(HLA-I; HLA-DR)在 膜上的表達。有趣的是,在M微克/ml時所呈現的活性竟與降低20倍劑量如 l微克/ml時相同。單核細胞上的共同剌激分子CD-80(B7-1)與C脇(B7. 2) 沒有被上調。接著分析AT1002對人類巨嗜細胞的影響。來自於健康捐獻者的外周血 的人類單核細胞經純化後，在完全培養基中培養5天，以保證分化成巨嗜細 胞。然後向培養物中加入刺激原，18小時後收集細胞，經所示單克隆抗體染色 後以FACS進行分析。結果顯示在圖8中。圖8顯示ATI002大幅度上調了 HLA-1、 HLA-DR以及CD86 (粗體數字代表平均螢光強度數值)在膜上的表達。 共同刺激分子CD-80也被上調，圖中沒有體現。此外，AT1002上調CD40的表 達，該分子是對於天然淋巴細胞的激活相當重要的分子。脂多糖(LPS)被用作 巨嗜細胞活化的陽性對照。關於這點，應注意AT1002在上調HLA-I、 HLA-DR 分子時比LPS更有效。這些結果證實AT1002具有免疫促進活性。AT1002活化了單核球細胞與 巨嗜細胞，它們是具有先天免疫性的抗原呈遞細胞，對於刺激抗原特異性的 免疫反應非常重要。因此，AT1002作為疫苗佐劑使用。再者，單核細胞與巨嗜 細胞上上調的分子對於T淋巴細胞的刺激很重要。實際上，HLA I分子刺激 CD8+T淋巴細胞(細胞毒性細胞)，其對於對抗細胞間病原體，如病毒和細胞 間細菌(如結核桿菌)以及對抗腫瘤細胞是非常重要的；HLA-DR分子對刺激 CD4+T淋巴細胞的刺激是相當重要的，它們作為a)刺激B淋巴細胞產出各 類的抗原特異性抗體IgM、 IgG與IgA的幫助細胞，以及b)作為對抗由細 胞內與細胞外病原體引起的感染的效應細胞。共同刺激分子CD80與CD86則 對於T淋巴細胞的最佳刺激是很重要的。CD40分子對抗原特異性T淋巴細胞 的刺激，特別是對於表達CD40配體分子的內生T淋巴細胞的激活也是非常 重要的。不受任何理論的限制，本發明的肽的作用機理可以包含第一步驟，即肽
與位於上皮細胞的受體結合。該結合作用調整閉合帶，允許共同輸送黏膜下 的抗原進入。接著，肽可以與免疫系統的細胞相互作用，以促進/調節免疫反應o在作為輸送系統的同時作為佐劑發揮、作用。這對於'黏膜免疫作用是相當重要 的，實際上其中兩個重要的問題是黏膜下抗原的輸送以及對免疫反應的剌激 和放大。 一般而言，黏膜疫苗中需要包含兩種不同化合物以實現這兩種不同的功能，而AT1002則是一個分子同時具有兩種活性。的技術人員的水平。在此作為參考的所有專利和文獻的引用程度均達到每一 篇文獻被特別地和獨立地顯示為引用其全文作為參考。
權利要求
1.一種誘發動物體內免疫反應的方法，包括向動物黏膜給予一種或多種抗原，以及一種或多種肽佐劑。
16. 如權利要求15所述的組合物，其中所述肽佐劑包含約6到約50個 胺基酸。
17. 如權利要求15所述的組合物，其中所述肽佐劑包含約6到約25個 胺基酸。
18. 如權利要求15所述的組合物，其中所述肽佐劑包含約6到約15個 胺基酸。
19. 如權利要求13所述的組合物，其中所述組合物存在於水溶液中。
20. 如權利要求13所述的組合物，其中所述組合物進一步包含一種或多 種藥學上可接受的賦形劑。
21. 如權利要求13所述的組合物，其中至少一種肽佐劑包含序列 FCIGRL,所述組合物存在於水溶液中，所述組合物包含至少一種選自由麻滲 病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、風滲病毒抗原、白喉棒狀桿菌抗原、百日咳博 德特氏菌抗原、破傷風桿菌抗原、炭疽桿菌抗原以及流感病毒抗原組成的組 中的抗原。
22. —種用於黏膜給予的疫苗，包含一種或多種抗原以及一種或多種肽 佐劑。
23. 如權利要求22所述的疫苗，其中至少一種抗原選自由麻滲病毒抗原、 腮腺炎病毒抗原、風瘮病毒抗原、白喉棒狀桿菌抗原、百日咳博德特氏菌抗 原、破傷風桿菌抗原、炭疽桿菌抗原以及流感病毒抗原組成的組。
24. 如權利要求22所述的疫苗，其中至少一種肽佐劑包含序列FCIGRL。
25. 如權利要求24所述的疫苗，其中所述肽佐劑包含約6到約50個氨 基酸。
26. 如權利要求24所述的疫苗，其中所述肽佐劑包含約6到約25個氨 基酸。
27. 如權利要求24所述的疫苗，其中所述肽佐劑包含約6到約15個氨 基酸。
28. 如權利要求22所述的疫苗，其中所述疫苗存在於水溶液中。
29. 如權利要求28所述的疫苗，其中所述疫苗進一步包含一種或多種藥 學上可接受的賦形劑。
30. 如權利要求22所述的組合物，其中至少一種肽佐劑包含序列 FCIGRL,所述疫苗存在於水溶液中，所述疫苗包含一種選自由麻疹病毒抗原、 腮腺炎病毒抗原、風疹病毒抗原、白喉棒狀桿菌抗原、百日咳博德特氏菌抗 原、破傷風桿菌抗原、炭疽桿菌抗原以及流感病毒抗原組成的組中的抗原。
31. —種刺激抗原呈遞細胞的方法，包含將一種佐劑肽與抗原呈現細 胞相接觸。
32. 如權利要求31所述的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括單核細胞。
33. 如權利要求31所述的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括巨噬細胞。
34. 如權利要求31所述的方法，其中刺激導致人類主要組織相容性I型 和II型分子的表達上調。
35. 如權利要求31所述的方法，其中刺激導致CD40的表達上調。
36. 如權利要求31所述的方法，其中所述佐劑肽包含序列FCIGRL。
37. 如權利要求31所述的方法，其中所述佐劑肽存在的濃度範圍為約1 Hg/ml到約20|ig/ml。
全文摘要
本發明涉及一種佐劑肽，及其促進黏膜中、特別是在鼻組織中的抗原吸收的用途。用於黏膜輸送的疫苗組合物包括佐劑肽和用於誘發免疫反應的抗原。
文檔編號A61K39/116GK101115503SQ200680002434
公開日2008年1月30日 申請日期2006年1月13日 優先權日2005年1月14日
發明者A·法撒諾, M·迪·瑪姬斯翠斯 申請人:馬裡蘭巴爾的摩大學;薩尼塔高級研究所