一種測定玉米種胚脂肪氧化酶活性的方法

2023-12-10 02:30:16 1

專利名稱：一種測定玉米種胚脂肪氧化酶活性的方法
技術領域：
本發明涉及一種測定玉米種胚脂肪氧化酶活性的方法。
背景技術：
酶是一種有生物催化活性的蛋白質。其活性受到溫度，反應緩衝液PH值，緩衝液種類、濃度和底物濃度等條件影響，因此測量酶的活性，就需要知道酶反應的條件。脂肪氧化氧化酶(lipoxygenase，LOX，ECl. 13. 11. 12)，是脂類降解的關鍵酶之一， 以不飽和脂肪酸為底物，可以產生醛、酮等有毒害的物質。在大豆種子(David J. Parrish和 A. Carl Leopold, 1978 ；Robert L. Tilden 和 Sherlie H. West，1985 ；)，水稻種子(吳躍進， 吳敬德，張瑛，2001)中均證明脂肪氧化酶與種子的耐貯藏性質相關。王鏡巖，朱聖康，徐長法(2002)指出，脂肪氧化酶催化的反應需要活性氧參加，作用機理是將不飽和脂肪酸中的雙鍵氧化斷裂為小分子的醛、酮等物質，如丙二醛等，進而引起細胞膜通透性的變化或者蛋白質的變性。測量脂肪氧化酶活性的方法有很多種，其中紫外分光光度計法是最普遍的一種方法。其原理是通過反應底物亞油酸在234nm處與脂肪氧化酶反應發生散射而產生分光光度值的變化。利用紫外分光光度計法來測量脂肪氧化酶活性，通常有兩個問題需要解決。一是亞油酸在不同的PH值條件下會產生溶解度的變化，通常反應環境的pH值越低，亞油酸的溶解度越小，在未加入酶液時就會產生渾濁，從而幹擾測量的靈敏性。如果採用降低亞油酸底物的方法，則會影響其測量範圍。二是亞油酸在不同濃度的反應緩衝液條件下溶解度也會發生變化。其實質是反應液中離子濃度對亞油酸溶解度的影響。因此，不同的作物脂肪氧化酶測量的條件不同。大豆種子、花生種子脂肪氧化酶的紫外分光光度計法均有報導，但是玉米種子脂肪氧化酶的紫外分光光度計法未見報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種測定玉米種胚脂肪氧化酶活性的方法。本發明所提供的測定玉米種胚脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步驟使酶活檢測體系在溫度為2416°C的條件下反應，分別在反應的tl時刻和t2時刻測定酶活檢測體系在234nm處的OD值，分別記作OD (tl)和OD (t2)；根據下述公式1 :A = 60sX
/0.01/(t2-tl)計算出玉米種胚脂肪氧化酶活性；所述酶活檢測體系由吐溫20、亞油酸、pH值為8. 0濃度為0. 02mol/ml的1Tris-Hcl 緩衝液和待測玉米種胚脂肪氧化酶組成；所述酶活檢測體系中亞油酸濃度為0. 3mmol/L, 吐溫20濃度為0. 25mmol/L，待測玉米種胚脂肪氧化酶的濃度不大於0. 0167mg/3mL ；玉米種胚脂肪氧化酶活性的定義為所述酶活檢測體系每分鐘增加0. 01個吸光度所需要的酶量為一個酶活力單位。其中，所述tl可為反應開始時計起的第15s ；所述t2可為所述反應開始時計起的第 30s。具體測定方法包括下述步驟1)從玉米種胚中提取脂肪氧化酶，得到玉米種胚脂肪氧化酶粗酶液；2)配製含吐溫20的亞油酸溶液，其中，所述吐溫20的質量濃度為8. 3mmol/L，亞油酸的濃度為lOmmol/L ；3)取適當體積的粗酶液和100 μ 1步驟2)配製的含吐溫20的亞油酸溶液，並加入 0. 02mol/L、pH值8. 0的Tris-Hcl緩衝液將體積補至:3ml，得到反應體系，所述反應體系中酶蛋白含量不大於0. 0167mg ；將所述反應體系在溫度為M_26°C的條件下進行反應，用紫外分光光度計分別測定反應15秒、30秒時反應體系在234nm處的OD值，代入公式1，計算出玉米種胚脂肪氧化酶活性。其中，步驟1)中從玉米種胚中提取脂肪氧化酶可按照下述方法進行取萌發24h 的玉米種胚，加入pH值為7. 0、濃度為0. 05mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液進行冰上研磨，磨碎後離心、收集上清液，即為玉米種胚脂肪氧化酶粗酶液，其中，玉米種胚與緩衝液的質量比可為Ig IOml0本發明通過設計梯度實驗，確定了採用紫外分光光度計法測量玉米種胚脂肪氧化酶活性適宜的反應緩衝液PH值和濃度。相對於現有的種子脂肪氧化酶的測量方法，本發明方法有四個優點，一是可以定量的測量出脂肪氧化酶活性，二是對玉米種胚脂肪氧化酶活性的測量提供了適宜的條件。三是反應步驟簡單，易於操作，四是酶液和底物亞油酸用量少，節約成本。採用本發明的方法測量玉米種胚脂肪氧化酶活性，對篩選耐貯藏玉米品種和公司調控種子貯藏條件都具有重要意義。


圖1為0. 02mol/L反應緩衝液PH值對脂肪氧化酶活性影響。圖2為pH8. 0條件下不同反應緩衝液濃度對脂肪氧化酶活性的影響。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明的方法進行說明，但本發明並不局限於此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。下述實施例中所用的玉米自交系178在文獻「許啟鳳，優質高產玉米新品種農大 108的選育與推廣[J].中國農業大學學報，2003，8(1) :25力6」中公開過，公眾可從中國農業大學獲得。實施例1、考察玉米種胚脂肪氧化酶酶活紫外線測定方法最適的反應緩衝液pH值和濃度1)提取玉米種胚脂肪氧化酶液取玉米種胚0. 3g，加入3. Oml pH值為7. 0，濃度為0. 05mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液進行冰上研磨，磨碎後離心、收集上清液， 即為玉米種胚脂肪氧化酶粗酶液，放入4°C儲存，儘快進行測量。採用考馬斯亮藍法測定粗酶液中的可溶性蛋白的含量，標準曲線由濃度為0-0. 2mg的牛血清白蛋白建立，標準曲線方程為 Y = 4. 964X+0. 0422。
2)配製反應底物(含吐溫20的亞油酸溶液)配製lOmmol/L的亞油酸溶液，內含 8. 3mmol/L 的吐溫 20。3)配製不同pH值的反應緩衝液0. 02mol/l、pH值3. 0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液，0. 02mol/l, pH值4. 0醋酸-醋酸鈉緩衝液，0. 02mol/l, pH值5. 0醋酸-醋酸鈉緩衝液，0. 02mol/l、pH值6. 0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液，0. 02mol/l、pH值7. 0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液，0. 02mol/L、pH值8. 0的Tris-Hcl緩衝液。從下述三方面考察最適的反應緩衝液pH值和濃度一、考察反應緩衝液pH值對底物亞油酸吸光度的影響將上述2)配製的底物用3)中不同pH值的緩衝液進行不同倍數的稀釋，用紫外分光光度計測定混合1 和30s時在234nm處的OD值，確定/NOD值變化範圍在0到0. 002 之間時所需要的亞油酸濃度的範圍，結果見表1。表 權利要求
1.一種測定玉米種胚脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步驟使酶活檢測體系在溫度為2446°C的條件下反應，分別在反應的tl時刻和t2時刻測定酶活檢測體系在234nm處的 OD 值，分別記作 OD (tl)和 0D(t2)；根據下述公式 1 :A = 60sX
/0. 01/ (t2-tl)計算出玉米種胚脂肪氧化酶活性；所述酶活檢測體系由吐溫20、亞油酸、pH值為8. 0濃度為0. 02mol/ml的Tris-Hcl緩衝液和待測玉米種胚脂肪氧化酶組成；所述酶活檢測體系中亞油酸濃度為0. 3mmol/L,吐溫20濃度為0. 25mmol/L，待測玉米種胚脂肪氧化酶的濃度不大於0. 0167mg/3mL ；玉米種胚脂肪氧化酶活性的定義為所述酶活檢測體系每分鐘增加0. 01個吸光度所需要的酶量為一個酶活力單位。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述tl為反應開始時計起的第15s；所述 t2為所述反應開始時計起的第30s。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述方法具體包括下述步驟1)從玉米種胚中提取脂肪氧化酶，得到玉米種胚脂肪氧化酶粗酶液；2)配製含吐溫20的亞油酸溶液，其中，所述吐溫20的質量濃度為8.3mmol/L，亞油酸的濃度為lOmmol/L ；3)取適量粗酶液和100μ 1步驟2~)所述含吐溫20的亞油酸溶液，並加入0. 02mol/L、 PH值8. 0的Tris-Hcl緩衝液將體積補至:3ml，得到酶活檢測體系，所述酶活檢測體系中玉米種胚脂肪氧化酶含量不大於0. 0167mg ；使所述酶活檢測體系在溫度為M_26°C的條件下反應，用紫外分光光度計分別測定反應15秒、30秒時體系在234nm處的OD值，代入公式1， 計算出玉米種胚脂肪氧化酶活性。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於步驟1)中從玉米種胚中提取脂肪氧化酶的方法如下取萌發Mh的玉米種胚，加入pH值為7. 0、濃度為0. 05mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液進行冰上研磨，磨碎後離心、收集上清液，即為玉米種胚脂肪氧化酶粗酶液，其中，玉米種胚與緩衝液的質量比為Ig 10ml。
全文摘要
本發明公開了一種測定玉米種胚脂肪氧化酶活性的方法。該方法包括如下步驟使酶活檢測體系在24-26℃下反應，分別在反應t1和t2時刻測定體系在234nm處的OD值，分別記作OD(t1)和OD(t2)；根據下述公式1A＝60s×[OD(t2)-OD(t1)]/0.01/(t2-t1)計算出玉米種胚脂肪氧化酶活性；所述酶活檢測體系由吐溫20、亞油酸、pH值為8.0濃度為0.02mol/ml的Tris-Hcl緩衝液和待測玉米種胚脂肪氧化酶組成；其中亞油酸濃度為0.3mmol/L，吐溫20濃度為0.25mmol/L，待測玉米種胚脂肪氧化酶的濃度不大於0.0167mg/3mL；酶活定義為所述酶活檢測體系每分鐘增加0.01個吸光度所需要的酶量為一個酶活力單位。
文檔編號G01N21/78GK102279181SQ201110096159
公開日2011年12月14日 申請日期2011年4月18日 優先權日2011年4月18日
發明者王國英, 王建華, 胡新民, 趙正楠 申請人:中國農業大學