含有唾液酸的糖鏈的製造方法
2023-12-10 08:15:37 2
含有唾液酸的糖鏈的製造方法
【專利摘要】已知唾液酸以α2,3連接或α2,6連接於糖鏈的非還原末端的糖鏈的重要性，存在對此糖鏈化合物的工業化生產的需求。尤其，在例如製造糖蛋白藥物時，在控制唾液酸的連接模式（α2,6連接或α2,3連接）的同時，大規模生產均一結構的糖鏈是不可或缺的。對於3分支型或4分支型的N-型複合型糖鏈，一般認為難以化學合成在所有的非還原末端均具有唾液酸的糖鏈，目前尚未報導過化學合成的該糖鏈。酶學上亦難以有效率地製備此糖鏈。本發明中，新發現唾液酸轉移酶具有在CMP存在下分解反應產物中的唾液酸的活性，發現可通過酶而分解CMP，從而有效率地製造含唾液酸的糖鏈。進而還發現，對於傳統上難以合成的以α2,6連接加成四分子唾液酸的4分支N-型糖鏈，可以以2分支型糖鏈為原料，進行糖鏈延長反應，在不進行各步酶反應後的純化的情況下，以一鍋法合成而高產率地進行製備。
【專利說明】含有唾液酸的糖鏈的製造方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及可應用於糖蛋白等藥物、分析儀器用的標準品、學術用試劑、糖鏈陣列等的糖鏈的合成法。
【背景技術】
[0002]先前的大量研究表明連接於蛋白質的糖鏈結構在該蛋白質的生物活性的機能上扮演著重要角色。並且，糖鏈也稱為「細胞的臉」。已知在細胞表面上表達的糖鏈與細胞間相互作用或信號傳遞、發育或分化、受精、癌轉移等相關。關於哺乳類的糖鏈修飾，為人熟知的主要是Asn連接型、黏蛋白型、蛋白多糖型糖基化和其它的類型。這些修飾通過不同的生物合成途徑，形成它們各自固有的糖鏈結構。已知的是在這樣的糖鏈結構的非還原末端側，加成海藻糖或唾液酸等糖。
[0003]唾液酸是對作為連接有氨基或羧基的特殊的9碳糖的神經氨酸中氨基或羥基被取代的化合物的總稱。5位的氨基被乙醯化的N-乙醯神經氨酸(Neu5Ac)可能是自然界中最多的形式。另外，還已知有5位的氨基是以乙醇醯基修飾的N-乙醇醯基神經氨酸或去氨基神經氨酸KDN等各種結構。
[0004]據報導，含有唾液酸的糖鏈不僅存在於人類或老鼠等哺乳類中，還存在於脊椎動物或棘皮動物，甚至原生生物或具有革蘭氏陰性病原性的一些細菌中。通過唾液酸轉移酶製備該含有唾液酸的糖鏈。唾液酸轉移酶用加成於胞苷一磷酸(CMP)的唾液酸作為底物供體，通過存在於唾液酸供體的2位的醛基，將唾液酸轉移至例如半乳糖的3位或6位、N-乙醯半乳糖胺的6位、或另一唾液酸的8位等。例如轉移唾液酸於半乳糖的3位的酶被稱為α _2，3-唾液酸轉移酶，轉移唾液酸於半乳糖或N-乙醯半乳糖胺的6位的酶被稱為α-2，6-唾液酸轉移酶，轉移唾液酸於另一唾液酸的8位的酶被稱為α-2，8-聚唾液酸轉移酶。其中，關於α-2，6-唾`液酸轉移酶，已知人類中作為轉移唾液酸於半乳糖的6位的酶，有ST6Gal-1和ST6Gal-1I，及作為轉移唾液酸於N-乙醯半乳糖胺的6位的酶，有ST6GalNAc-1、ST6GalNAc-11、ST6GalNAc-1II 和 ST6GalNAc_IV。
[0005]ST6Gal-1將作為具有連接於4位的半乳糖的N-乙醯葡糖胺的N-乙醯乳糖胺結構(Gal β l-4GlcNAc)識別為底物受體，從而修飾一些糖脂質或N-連接型糖鏈的非還原末端結構。其對底物受體的特異性主要是利用2分支或3分支的N-連接型糖鏈進行分析。據報導，唾液酸容易轉移於α?，3連接的甘露糖的分支上的乳糖胺(參考非專利文獻I)。關於2分支或3分支的N-連接型糖鏈的製備，因為例如難以從天然物中提取糖基轉移酶的底物，和酶的大規模製備法尚未確立等，所以很難有效率地大量地生產這些糖鏈。
[0006]另一方面，關於4分支之N-連接型糖鏈的α 2，6唾液酸轉移反應，已通過使用來自牛的ST6Gal-1來進行研究。在糖鏈的4個N-乙醯乳糖胺結構中，唾液酸最容易轉移至在α?，3連接的甘露糖上以β?，2連接加成的N-乙醯乳糖胺結構上，然後是在al，3連接的甘露糖上以β?，4連接加成的N-乙醯乳糖胺結構，進一步的是在al，6連接的甘露糖上加成的2個N-乙醯乳糖胺結構中任一者，但未發現含有四分子唾液酸的產物(參考非專利文獻2)。另外，人ST6Gal-1，以及ST6Gal-1I已被報導具有底物特異性(參考非專利文獻3和4。)。但對於以4分支的N-連接型糖鏈為受體底物的唾液酸加成還未進行研究。
[0007]據報導，有關ST6Gal-1的因CMP的產物抑制，其被0.25mM的CMP抑制49% (參考非專利文獻5)，或抑制71% (參考非專利文獻6)。
[0008]另一方面，作為來自細菌的α 2，6-唾液酸轉移酶，報導有Photobacteriumdamsel a JT0160 (參考非專利文獻 7)、Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-145 (參考非專利文獻8)等，但關於以4分支的N-連接型糖鏈為受體底物的唾液酸的加成，它們中的任一種均未被研究。
[0009]另外，關於4分支的N-連接型糖鏈的α 2，3唾液酸轉移反應，將其中四分子的唾液酸以α 2，3連接加成的4分支N-連接型糖鏈加成於紅細胞生成素(EPO)等糖蛋白(參考非專利文獻9)，據報導，唾液酸加成對糖蛋白在血中的穩定性有貢獻(參考非專利文獻10)。雖然這些結構為天然中存在的結構，但未見有實際上大量製備四分子的唾液酸以α 2，3連接加成的4分支的N-連接型糖鏈的報告例。這是因為，就成本而言，用作原料的EPO等很難進行大量的製備，並且在酶合成中，也很難由其他天然物廉價地製備成作為受體的去唾液酸4分支型N-連接型糖鏈。並且，已知的是在EPO中也混合存在加成於糖蛋白的α 2，3連接及α 2，6連接的4分支型N-連接型糖鏈等(參考非專利文獻11)。
[0010]關於加成於抗體藥物或細胞因子等糖蛋白藥物中的N-型糖鏈的唾液酸的連接模式，有報導稱加成α 2，6連接唾液酸的蛋白質比加成α 2，3連接唾液酸的蛋白質在血中消失得更快。對於糖蛋白從血中清除，糖蛋白通過與體內的凝集素(Lectins)結合而攝入細胞內，最終被代謝。因此，具有α 2，6連接的唾液酸的糖蛋白有希望通過結合特異的凝集素而被以特異於器官的方式攝入，以及有希望靈活地用於藥物傳遞。另外，已知的是糖蛋白根據分子尺寸，在腎臟中隨尿液排出。據報導，紅細胞生成素的表觀分子尺寸隨其糖鏈的分支數目的增多而增加，從而導致在血中清除得慢。因此，具有α 2，3連接和/或α 2，6連接的唾液酸的糖鏈，尤其是具有四分子的α 2，3連接和/或α 2，6連接的唾液酸的4分支N-型糖鏈的合成，有希望應用於生產不同的臟器攝入效率的糖蛋白藥物。
[0011]另外，人流感病毒可識別在細胞表面表達的糖鏈中的α 2，6連接的唾液酸而進行感染，而來自鳥類的流感病毒可識別α 2，3連接的唾液酸而進行感染。不僅流感病毒，許多病毒也通過識別待感染細胞的糖鏈結構而感染該細胞，所以有必要使用各種糖鏈，來調查與病毒的結合特異性。因此，具有α 2，3連接或α 2，6連接的唾液酸的糖鏈可作為用於研究病毒結合特異性的材料，而應用於病毒檢測等。
[0012][文獻列表]
[0013][非專利文獻]
[0014][非專利文獻 I]:van den Eijnden DH et al., Biochem Biophys ResCommun.，92(3)，839-45(1980)
[0015][非專利文獻 2] Joziasse et al.，JBC, 262，2025-2033 (1987)
[0016][非專利文獻 3]:Takashima et al.，JBC, 277，45719-45728 (2002)
[0017][非專利文獻 4] =Krzewinsk1-Recchi et al.，EJB, 270，950-961 (2003)
[0018][非專利文獻 5]:Miyazaki T et al., Glycobiology, 18, 187-194(2008)
[0019][非專利文獻 6]:Kleineidam et al., Glycoconj.J., 14, 57-66 (1997)[0020][非專利文獻 7]:Yamamoto T et al.，BBB, 62，210-214 (1998)
[0021][非專利文獻 8] =Yamamoto T et al.，Glycobiology, 17，1167-1174 (2007)
[0022][非專利文獻 9]:Takeuchi et al.，J.Biol.Chem.，263 (8)，3657-63 (1988)
[0023][非專利文獻 10]:Tsuda et al.，Eur J Biochem.，188 (2)，405-11 (1990)
[0024][非專利文獻 11]:Takeuchi et al., J.Biol.Chem.，263 (8)，3657-63 (1988)
【發明內容】
[0025](本發明要解決的技術問題)
[0026]已知具有在糖鏈的非還原末端的α 2，3連接或α 2，6連接唾液酸的糖鏈是很重要的。對於這些糖鏈化合物，儘管有可能是天然存在的，但由於自天然物提取有作為天然物的稀少性、取得的困難性、安全性等問題，因此需要它們的工業化生產。尤其，製造抗體醫藥品或細胞因子等糖蛋白藥物或研究病毒的結合特異性等時，不可避免地需要通過控制唾液酸的連接模式(α 2，6連接或α 2，3連接)，量產均一結構的糖鏈。尤其，對於3分支型或4分支型的N-型複合型糖鏈，一般認為難以從化學上合成所有的非還原末端都具有唾液酸的糖鏈，例如對於所有的非還原末端都具有α 2，6連接唾液酸的4分支型N-型複合型糖鏈，並沒有化學合成的報導。此外，酶學上也難以有效率地製備這些具有唾液酸的3分支型或4分支型的糖鏈。
[0027]解決問題的方法
[0028]本發明的發明人等新發現了唾液酸轉移酶在CMP存在下分解反應產物上的唾液酸的活性，還發現所生成的CMP可通過酶而分解，從而可有效率地製造含唾液酸的糖鏈。本發明的發明人等進一步發現對於傳`統上難以合成的以α 2，6連接加成四分子唾液酸的4分支N-型糖鏈，可以通過包含以2分支型糖鏈為原料的糖鏈延長反應的一鍋法合成，無需在各步酶反應後進行精製，從而可高產率地製備。
[0029]亦即，本發明涉及製造具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物的方法，包括
[0030]在唾液酸轉移酶和磷酸酶(phosphatase)存在下，使第一糖鏈或其衍生物與CMP-唾液酸進行反應，
[0031]以將唾液酸轉移至所述第一糖鏈或其衍生物的非還原末端。
[0032]在此，根據本發明的具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物的製造方法的一個實施方案，所述第一糖鏈或其衍生物為3分支型或4分支型的N-連接型複合型糖鏈或它們的衍生物。
[0033]另外，根據本發明的具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物的製造方法的一個實施方案，所述第一糖鏈或其衍生物為由下式所表示的化合物:
[0034]
【權利要求】
1.具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物的製造方法，所述製造方法包括: 在唾液酸轉移酶和磷酸酶的存在下，使第一糖鏈或其衍生物與CMP —唾液酸進行反應， 以將唾液酸轉移至所述第一糖鏈或其衍生物的非還原末端。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述第一糖鏈或其衍生物為3分支型或4分支型的N-連接型複合型糖鏈或其衍生物。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述第一糖鏈或其衍生物為下式所表示的化合物:
4.如權利要求1所述的方法，其中，所述具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物為3分支型或4分支型的N-連接型複合型糖鏈，且為在糖鏈的各非還原末端都具有唾液酸的化合物或其衍生物。
5.如權利要求1所述的方法，其中，所述具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物為由下式所表示的化合物，
6.具有唾液酸的糖鏈或其衍生物的製造方法，所述方法包括以下步驟:(a)在糖基轉移酶的存在下，使由下式所表示的糖鏈
7.在非還原末端具有唾液酸的糖鏈或其衍生物的製造方法，所述方法包括以下步驟: Ca)在MAGAT4和MGAT5的存在下，使去半乳糖2分支複合型糖鏈或其衍生物與UDP-GlcNAc反應的步驟； (b)在β4GalTl的存在下，使所述步驟(a)的產物與UDP-Gal反應的步驟；和 (c)在唾液酸轉移酶和磷酸酶的存在下，使上述步驟(b)的產物與CMP-唾液酸反應的步驟。`
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中，所述唾液酸轉移酶為α2，6唾液酸轉移酶。
9.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中，所述唾液酸轉移酶為人源唾液酸轉移酶。
10.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中，所述唾液酸轉移酶為ST6Gal-1。
11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中，所述CMP-唾液酸為CMP-Neu5Ac。
12.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中，所述磷酸酶為鹼性磷酸酶。
13.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中，所述磷酸酶為來自大腸桿菌的鹼性磷酸酶。
14.化合物，所述化合物在4分支型的N-連接型複合型糖鏈或其衍生物的各非還原末端都具有唾液酸。
15.化合物，所述化合物在4分支型的N-連接型複合型糖鏈或其衍生物的各非還原末端都具有α 2，6連接型的唾液酸。
16.由下式所表示的化合物:
【文檔編號】C12N15/09GK103502462SQ201280011234
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年2月27日 優先權日:2011年3月4日
【發明者】千葉靖典, 高橋佳江, 成松久, 深江一博 申請人:株式會社糖鎖工學研究所