一種兩親性殼聚糖衍生物抗蛋白質吸附塗層的製備方法和應用與流程

2023-07-22 17:17:16 1

本發明屬於生物醫用材料和高分子化學領域，具體涉及一種兩親性殼聚糖衍生物抗蛋白質吸附塗層的製備方法和應用。
背景技術：
：蛋白質是兩親性的大分子物質，在生命體中屬於一種不可或缺的物質，有著極其豐富的生物功能。但由於蛋白質表面的親和性，導致其易吸附在材料表面造成材料的汙染，繼而影響材料的性能，並產生一系列危害。在非生物方面，海洋生物吸附實質上是蛋白質吸附的問題，海洋生物如藤壺、貽貝、硅藻等分泌物中多含有大量的蛋白質和多糖，其分泌物易在材料的表體上吸附分散，從而汙損海洋生物在材料表面上吸附生長且黏著更多的其他汙損海洋物。對於海洋運輸業來說，生物垢的產生導致船體自重加大，輪船的運輸消耗增加且嚴重的腐蝕船體，降低船隻的使用壽命。對於海洋養殖產業，海洋生物的附著易造成網箱養殖中的網眼堵塞，使養殖物缺氧致死，影響產率造成大量的經濟損失。而在生物方面，對於生物材料植入人體內後，體內蛋白質開始吸附在材料上，引起體內不同程度的生物學反應，如血漿蛋白質附著在心血管植入物表面導致血管內血栓的形成；藥物緩釋的納米粒子在體內循環中會被蛋白質吸附產生蛋白質電暈作用，導致納米粒子被吞噬到不了靶細胞，藥物療效下降。對於常見的隱形眼鏡的使用中，溶菌酶的吸附會導致眼睛的疾病。蛋白質的吸附還會引起生物傳感器的測量誤差，導致測量數據的不準確。蛋白質吸附性的危害存在於各個方面。因此，減少蛋白質的吸附性，研究具有優良的抗蛋白質特性的材料是當今材料、化學、生物等領域的研究重點。殼聚糖又名幾丁聚糖，是由幾丁質完全或部分脫乙醯化的產物，是第二大生物聚合物，來源廣泛。殼聚糖有良好的生物可降解性，易被人類腸道通常存在的細菌菌群降解，其生物降解性隨聚合物中乙醯胺基團比例的增加而增加，與幾丁質不同，完全脫乙醯殼聚糖幾乎不分解。殼聚糖具有豐富的親水基團氨基和羥基，易進行化學改性，且安全無毒。研究者常在殼聚糖的結構單元上引入有利基團達到理想的化學改性效果，生成具有不同性質的殼聚糖衍生物，使其在化學、生物工程、食品工業、環境治理、皮膚組織修復等許多研究方向得到廣泛的關注、研究及應用。但殼聚糖分子具有強親水性，不溶於鹼性及許多有機溶劑，ph使用範圍小，易流失等缺點限制了它的廣泛使用。目前，所研究的抗蛋白質吸附材料主要有以下幾類：(1)基於地形異質性的抗蛋白質吸附材料，可產生具有高水平的地形異質性的超疏水表面，這種具有小突起的獨特結構可以帶來大量的空氣滯留在水下，以減少液體和表面之間的接觸面積，使蛋白質不能接近表面，這種超疏水表面最初是在蓮花上觀察到的，其自清潔性能是眾所周知的，其優異的抗粘附能力是基於疏水性的蠟角質層和乳頭表面結構。(2)基於兩性離子聚合物的抗蛋白質吸附材料，現在，對含有兩性離子聚合物材料的研究還處在開始階段，由於兩性離子聚合物的高極性，它只能溶解在高極性溶劑如水或乙醇中，與其它低極性單體共聚非常困難；另一方面，含兩性離子聚合物的材料遇水後溶脹從而造成其機械強度降低以及在固體表面不容易固定等問題使得這些材料的性能有待於提高。(3)基於兩親性聚合物的抗蛋白質吸附材料，以兩親性聚合物為代表的具有微觀相分離結構的抗蛋白質吸附材料具有抑制血小板吸附、阻止血小板變性、抑制血液凝聚等特點，最有望成為新一代血液相容性材料，目前已成為抗蛋白質吸附材料研究的前沿領域。抗蛋白質吸附材料的製備方法，一般採用物理吸附或共混，表面接枝，形成表面塗層等方法引入抗蛋白質吸附單元。抗蛋白質吸附材料主要應用於(1)生物醫用材料：廣泛應用於心血管系統，軟組織修復，血液淨化，藥物及生物活性物控制釋放和生物傳感器等領域；(2)海洋防汙材料：海洋微生物在船體或其它海洋設施表面上吸附、生長，並與其它海洋生物不斷粘附而形成的生物垢，給海洋運輸和海洋資源的勘探、開發、利用等造成巨大的危害，海洋防汙實際是一個表面的抗蛋白質吸附問題。兩親性聚合物由於具有親水性和低表面能以及具有可發生微相分離的兩親性特殊結構所以能夠有效地抵抗蛋白質的吸附，作為抗蛋白質吸附材料越來越引起科學研究者的關注。目前報導的兩親性聚合物抗蛋白質材料，作為一種新型的抗生物汙染材料展現了其獨特的優勢，一方面解決了常規的親水性抗汙材料在水環境下的不穩定性，從而不需要通過複雜的化學鍵結合的方法將分子鏈固定；另一方面可以通過改性的方法在一些不抗汙染的疏水材料表面接枝一段親水基團，從而擴大了許多材料的使用範圍，目前已成為抗蛋白質吸附材料研究的前沿領域。研究兩親性聚合物抗蛋白質防汙的專利和文獻報導很多，其中兩親性殼聚糖抗蛋白質吸附的文獻還未見報導。中國發明專利(cn101658484a）公開一種膽固醇甲醯氯修飾的殼聚糖共聚物載藥膠束的製備方法，該法利用膽固醇甲醯氯在殼聚糖氨基上連結膽固醇，在水性介質中自組裝製備共聚物載藥膠束。保護殼聚糖的氨基，在殼聚糖羥基上接上疏水長鏈得到兩親性殼聚糖，將得到的兩親性殼聚糖用於抗蛋白質研究的文獻尚未見報導。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種兩親性殼聚糖衍生物抗蛋白質吸附塗層的製備方法和應用。該方法首先引入疏水性基團改變殼聚糖的親水程度，得到兩親性殼聚糖衍生物，削弱其分子間氫鍵的影響，改變了殼聚糖的生物特性並拓寬了應用範圍。對殼聚糖進行疏水改性時，由於殼聚糖分子鏈上的羥基和氨基均具有反應活性，但是氨基顯示出更高的活性，為了保留氨基賦予殼聚糖的特性，必須在反應前對分子鏈上的氨基進行保護。該方法使用甲磺酸來進行氨基保護，然後殼聚糖羥基與膽固醇氯甲酸酯進行親核取代得到兩親性的膽固醇殼聚糖酯。調控不同投料比的兩親性物質的親疏水基團比例，探究最佳抗蛋白質效果。該方法通過引入疏水基團，提高了膜的兩親性能，使其抗蛋白質能力增強。同時實驗方法簡單，原料易得，有很好的應用前景。為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案：本發明所述的一種兩親性殼聚糖衍生物抗蛋白質吸附塗層的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟：（1）膽固醇氯甲酸酯的活化在圓底燒瓶中，按順序加入膽固醇氯甲酸酯（chol-cl）、n,n-二甲基甲醯胺(dmf)以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），在一定溫度下攪拌一段時間後得到無色澄清溶液a；（2）抗蛋白質的兩親性膽固醇殼聚糖酯（chcs）的合成在三口燒瓶中，加入殼聚糖（cs），隨後加入甲磺酸，通氮氣除氧氣後封口，攪拌至殼聚糖完全溶解，在氮氣保護下，逐滴加入步驟（1）製備的溶液a，反應過程不斷有沉澱析出，反應在一定溫度條件下攪拌一定時間；反應結束後將上述混合物倒入大量沉澱劑中，產物經離心後洗滌，再將所得的洗滌產物通過溶解-沉澱方式進行提純後，抽濾，冷凍乾燥得到米白色固體狀的膽固醇殼聚糖酯（chcs）；（3）利用langmuir技術研究chcs在空氣/水界面單分子膜行為用微量進樣器移取50-300µl1.0mg/ml的chcs氯仿溶液，在langmuir-blodgett（lb）槽體的正上方緩慢滴加至亞相水面上，使其更好的鋪展在水面上；等待5-30min至成膜分子全部擴散且氯仿揮發後，手動歸零天平壓力，設置滑障速度為10-200cm2/min，壓縮滑障，得到有序密集排列的單分子膜的表面壓（π）與平均分子面積（a）等溫曲線；π-a等溫曲線顯示chcs單分子膜的壓縮過程表面壓呈現先緩慢增加到急劇增加，而後下降的變化過程；chcs單分子膜成膜性能良好，能在水相上穩定存在，從而說明chcs具有良好的兩親性；（4）抗蛋白質吸附實驗將一定量cs或步驟（2）製得的chcs配製成一定濃度的溶液，利用勻膠機在基板上旋塗膜，乾燥並預處理後備用；將預處理後的塗層浸入不同濃度的蛋白質溶液中，在一定條件下，吸附一段時間後，利用bca法測定吸附前後蛋白質溶液濃度的變化，根據濃度變化值計算出蛋白質的吸附量，進而得出抗蛋白質吸附率。上述步驟（1）中所述的膽固醇氯甲酸酯與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為：1:1～3，n,n-二甲基甲醯胺加入量為50～200ml；步驟（1）中所述的反應條件為25～50℃，攪拌2～6h得到無色澄清溶液a。上述步驟（2）中所述的殼聚糖與甲磺酸溶劑比例為：0.1g:5～100ml；步驟（2）中所述的反應溫度為25～80℃，攪拌時間12～120h。上述步驟（1）中所述的膽固醇氯甲酸酯與步驟（2）中所述的殼聚糖重複單元摩爾比為：0.01～7:1。上述步驟（2）中所述的粗產物提純用到的沉澱劑為水、甲醇、乙醇中一種或多種組合，用沉澱劑提純後的產物經離心後洗滌，再將所得的洗滌產物通過氯仿溶解-甲醇沉澱的方式提純後進行抽濾，冷凍乾燥。上述步驟（4）中所述的將一定量cs或步驟（2）製得的chcs配製成一定濃度的溶液是用溶劑配製成濃度為1～50mg/ml的溶液，所述溶劑為醋酸-水溶液、四氫呋喃、氯仿、乙醇中一種或多種組合。上述步驟（4）中所述的基板為玻片、矽片、金屬、塑料、纖維或木材，旋塗膜條件為：轉速為1000～5000r/min，時間為20～100s，cs和chcs用量50～1000µl。上述步驟（4）中所述的塗層的預處理的步驟是：將乾燥好的csch或cs塗層或空白潔淨的基板分別用10～100wt%的酒精浸泡1～10min，再用蒸餾水衝洗去除殘留的酒精，然後浸入到1～10ml0.01～0.2m、ph=7.0pbs溶液中浸泡1～5h。上述步驟（4）中所述的不同濃度的蛋白質溶液是用pbs與蛋白質配製的，不同濃度的蛋白質濃度在0.01～20mg/ml，蛋白質溶液需現配現用，所述蛋白質為牛血清白蛋白、人血清蛋白、溶菌酶、小鼠免疫球蛋白、乳鐵蛋白、纖維蛋白原、肌紅蛋白、牛血紅蛋白、刀豆蛋白、膠原蛋白中的一種或多種組合。本發明上述的一種兩親性殼聚糖衍生物抗蛋白質吸附塗層的製備方法製得的抗蛋白質吸附塗層的應用，其特徵在於，在20～40℃時，將預處理好的csch或cs塗層或空白潔淨的基板分別浸泡在1～10ml蛋白質溶液中進行蛋白質吸附，1～5h後取出樣品；所述的bca法是指二價銅離子在鹼性條件下被蛋白質還原成一價銅離子，一價銅離子與bca試劑形成紫色複合物，該複合物在562nm處顯示強烈的吸收光，吸光值和蛋白質濃度在廣泛範圍內有良好的線性關係，根據吸光值利用bca法測樣品蛋白質濃度，在酶標儀或紫外可見分光光度計上測定試樣吸附蛋白質前後的蛋白質溶液在562nm處的吸光值，根據工作曲線從吸光值的大小得到吸附前後蛋白質的濃度，根據濃度變化計算出蛋白質的吸附量,進而計算出抗蛋白質吸附率。具體地說，本發明採用如下技術方案：一種兩親性殼聚糖衍生物抗蛋白質吸附塗層的製備方法，包括以下步驟：（1）膽固醇氯甲酸酯的活化在圓底燒瓶中，按順序加入膽固醇氯甲酸酯（chol-cl）、n,n-二甲基甲醯胺(dmf)以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），在一定溫度下攪拌一段時間後得到無色澄清溶液a；（2）抗蛋白質的兩親性膽固醇殼聚糖酯的合成（chcs）在三口燒瓶中，加入殼聚糖，隨後加入甲磺酸，通氮氣除氧氣後封口，攪拌至殼聚糖完全溶解，在氮氣保護下，逐滴加入步驟（1）製備的溶液a，反應過程不斷有沉澱析出，反應在一定溫度條件下攪拌一定時間。反應結束後將上述混合物倒入大量沉澱劑中，產物經離心後洗滌，再將所得的洗滌產物通過溶解-沉澱方式進行提純後進行抽濾，冷凍乾燥得到米白色固體狀的膽固醇殼聚糖酯（chcs）；（3）利用langmuir技術研究chcs在空氣/水界面單分子膜行為。用微量進樣器移取50-300µl1.0mg/ml的chcs氯仿溶液，在langmuir-blodgett（lb）槽體的正上方緩慢滴加至亞相水面上，使其更好的鋪展在水面上。等待5-30min至成膜分子全部擴散且氯仿揮發後，手動歸零天平壓力，設置滑障速度為10-200cm2/min，壓縮滑障，得到有序密集排列的單分子膜的表面壓（π）與平均分子面積（a）等溫曲線。π-a等溫曲線顯示chcs單分子膜的壓縮過程表面壓呈現先緩慢增加到急劇增加，而後下降的變化過程。chcs單分子膜成膜性能良好，能在水相上穩定存在，從而說明chcs具有良好的兩親性。（4）抗蛋白質吸附實驗將一定量cs或步驟（2）製得的chcs配製成一定濃度的溶液，利用勻膠機在基板上塗膜，塗層乾燥及預處理後備用；將預處理後的塗層浸入不同濃度的牛血清白蛋白（bsa）溶液中，在一定條件下，吸附一段時間後，利用bca法測定吸附前後蛋白質溶液濃度的變化，根據濃度計算出蛋白質的吸附量，進而計算抗蛋白質吸附率。在本發明方法中，步驟（1）中所述的膽固醇氯甲酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽摩爾比為：1:1～3，n,n-二甲基甲醯胺加入量為50～200ml，反應條件為25～50℃，攪拌2～6h得到無色澄清溶液a。在本發明方法中，步驟（2）中所述的殼聚糖與甲磺酸溶劑比例為：0.1g:5～30ml；反應條件為25～80℃，攪拌12～120h。其中所述的粗產物提純用到的沉澱劑是水，所得的洗滌產物通過氯仿溶解-甲醇沉澱的方式提純後進行抽濾，冷凍乾燥。步驟（1）中所述的膽固醇氯甲酸酯、步驟（2）中所述的殼聚糖重複單元摩爾比為：0.01～7:1。在本發明方法中，步驟（4）中所述的將一定量cs或步驟（2）製得的chcs配製成一定濃度的溶液是用溶劑配製成濃度為1～50mg/ml的溶液，所述溶劑為水、醋酸、四氫呋喃、氯仿、乙醇中一種或多種組合；其中所述的基板塗覆條件是：乾燥潔淨的20×20mm規格的基板，轉速為1000～5000r/min，時間為20～100s，cs和chcs用量50～1000µl；其中所述的塗層的預處理的步驟是：將乾燥好的csch或cs塗層或空白潔淨的基板分別用10～100%的酒精浸泡1～10min，目的在於打開蛋白質吸附通道，最大程度的吸附蛋白質，再用蒸餾水衝洗去除殘留的酒精，然後浸入到1～10ml0.01～0.2m、ph=7.0pbs溶液中浸泡1～5h；其中所述的不同濃度的蛋白質溶液是用pbs與蛋白質配製的，不同濃度的蛋白質濃度在0.01～20mg/ml，蛋白質溶液需現配現用；其中所述的在一定條件下，吸附一段時間是在20～40℃時，將預處理好的csch或cs塗層或空白潔淨的基板分別浸泡在1～10ml蛋白質溶液中進行蛋白質吸附，1～5h後取出試樣；其中所述的bca法測樣品蛋白質濃度，是在酶標儀或紫外可見分光光度計上測得，測定蛋白質溶液在562nm處的吸光值。本發明對應的一種非兩親性殼聚糖抗蛋白質吸附塗層即未改性的殼聚糖塗層。本發明提供的利用兩親性殼聚糖衍生物抗蛋白質吸附的方法，其優點在於：（1）本發明以殼聚糖為功能高分子，經氨基保護後分子鏈中羥基與膽固醇氯甲酸酯反應引入疏水基團，合成膽固醇殼聚糖酯（chcs），既保留氨基的活性又賦予殼聚糖兩親性。chcs合成示意圖見圖1，與傳統方法相比，該法能保護氨基同時減緩反應劇烈程度，使分子量分布均勻，膜性能提高；（2）本發明結合殼聚糖具有豐富的親水基團氨基和羥基，易進行化學改性，且安全無毒、來源豐富、抗酸鹼的優點和膽固醇氯甲酸酯易與羥基反應的特性提出一種簡單，易與控制的方法，合成一種兩親性殼聚糖衍生物，並用於抗蛋白質研究；（3）兩親性聚合物由於具有親水性以及具有可發生微相分離的兩親性特殊結構，所以能夠有效地抵抗蛋白質的吸附，作為抗蛋白質吸附材料越來越引起科學研究者的關注。本發明通過在殼聚糖上引入疏水基團，改善了膜的兩親性能，使其抗蛋白質能力增強；（4）實驗改性方法簡單，操作易行，原料易得，成本低廉，有很好的應用前景。本發明用於抗蛋白質吸附材料的製備和應用研究。附圖說明圖1為本發明所製備的一種兩親性殼聚糖衍生物chcs合成示意圖。圖2為本發明所製備的一種兩親性殼聚糖衍生物chcs的傅立葉紅外光譜圖。圖3為本發明所製備的一種兩親性殼聚糖衍生物chcs的核磁碳譜圖。圖4為本發明所製備的一種兩親性殼聚糖衍生物chcs單分子膜的表面壓（π）-平均分子表觀面積（a）等溫曲線。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細描述本發明利用兩親性聚合物抗蛋白質的機理，改性得到一種兩親性殼聚糖衍生物，與傳統的抗蛋白質材料比較，兩親性聚合物抗蛋白質材料，作為一種新型的抗生物汙染材料展現了其獨特的優勢，一方面解決了常規的親水性抗汙材料在水環境下的不穩定性，從而不需要通過複雜的化學鍵結合的方法將分子鏈固定；另一方面可以通過改性的方法在一些不抗汙染的疏水材料表面接枝一段親水基團，從而擴大了許多材料的使用範圍，目前已成為抗蛋白質吸附材料研究的前沿領域。實施例1（1）膽固醇氯甲酸酯的活化在250ml圓底燒瓶中，按順序加入1.38g膽固醇氯甲酸酯（chol-cl）、100mln,n-二甲基甲醯胺(dmf)以及0.60g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），反應在45℃下攪拌2h後得到無色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白質的兩親性膽固醇殼聚糖酯（chcs）在250ml三口燒瓶中，加入1.0g殼聚糖，隨後加入35ml甲磺酸，通氮氣除氧氣後封口，攪拌至殼聚糖完全溶解，在氮氣保護下，逐滴加入步驟（1）製備的溶液a，反應過程不斷有沉澱析出，反應在45℃下攪拌72h。反應結束後將上述混合物倒入大量冰水中，產物經離心後洗滌，再將所得的洗滌產物通過氯仿溶解-甲醇沉澱方式進行提純後進行抽濾，冷凍乾燥得到米白色固體狀的膽固醇殼聚糖酯（chcs）。chcs對水的靜態接觸角為89.02°。結合紅外光譜圖（圖2）和核磁碳譜圖（圖3）證實兩親性殼聚糖chcs成功合成。實施例2（1）膽固醇氯甲酸酯的活化在250ml圓底燒瓶中，按順序加入2.76g膽固醇氯甲酸酯（chol-cl）、100mln,n-二甲基甲醯胺(dmf)以及1.20g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），反應在45℃下攪拌2h後得到無色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白質的兩親性膽固醇殼聚糖酯（chcs）在250ml三口燒瓶中，加入1.0g殼聚糖，隨後加入35ml甲磺酸，通氮氣除氧氣後封口，攪拌至殼聚糖完全溶解，在氮氣保護下，逐滴加入步驟（1）製備的溶液a，反應過程不斷有沉澱析出，反應在45℃下攪拌72h。反應結束後將上述混合物倒入大量冰水中，產物經離心後洗滌，再將所得的洗滌產物通過氯仿溶解-甲醇沉澱方式進行提純後進行抽濾，冷凍乾燥得到米白色固體狀的膽固醇殼聚糖酯（chcs）。chcs對水的靜態接觸角為91.89°。實施例3（1）膽固醇氯甲酸酯的活化在250ml圓底燒瓶中，按順序加入5.49g膽固醇氯甲酸酯（chol-cl）、100mln,n-二甲基甲醯胺(dmf)以及2.40g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），反應在45℃下攪拌2h後得到無色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白質的兩親性膽固醇殼聚糖酯（chcs）在250ml三口燒瓶中，加入1.0g殼聚糖，隨後加入35ml甲磺酸，通氮氣除氧氣後封口，攪拌至殼聚糖完全溶解，在氮氣保護下，逐滴加入步驟（1）製備的溶液a，反應過程不斷有沉澱析出，反應在45℃下攪拌72h。反應結束後將上述混合物倒入大量冰水中，產物經離心後洗滌，再將所得的洗滌產物通過氯仿溶解-甲醇沉澱方式進行提純後進行抽濾，冷凍乾燥得到米白色固體狀的膽固醇殼聚糖酯（chcs）。chcs對水的靜態接觸角為96.52°。實施例4（1）膽固醇氯甲酸酯的活化在250ml圓底燒瓶中，按順序加入8.23g膽固醇氯甲酸酯（chol-cl）、150mln,n-二甲基甲醯胺(dmf)以及3.60g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），反應在45℃下攪拌2h後得到無色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白質的兩親性膽固醇殼聚糖酯（chcs）在250ml三口燒瓶中，加入1.0g殼聚糖，隨後加入35ml甲磺酸，通氮氣除氧氣後封口，攪拌至殼聚糖完全溶解，在氮氣保護下，逐滴加入步驟（1）製備的溶液a，反應過程不斷有沉澱析出，反應在45℃下攪拌72h。反應結束後將上述混合物倒入大量冰水中，產物經離心後洗滌，再將所得的洗滌產物通過氯仿溶解-甲醇沉澱方式進行提純後進行抽濾，冷凍乾燥得到米白色固體狀的膽固醇殼聚糖酯（chcs）。chcs對水的靜態接觸角為97.59°。（3）膽固醇殼聚糖酯langmuir膜的製備採用langmuir技術，兩親性物質可以在空氣/水界面形成langmuir膜，且隨著單層膜的形成水相表面壓發生變化。根據langmuir膜天平記錄的表面壓（π）與平均分子面積（a）等溫曲線，可動態研究在亞相上兩親性物質的單分子膜行為。具體單分子膜的形成如下，用微量進樣器移取100µl1.0mg/ml的chcs氯仿溶液，在lb槽體的正上方緩慢滴加至亞相水面上，使其更好的鋪展在水面上。等待30min至成膜分子全部擴散且氯仿揮發後，手動歸零天平壓力，設置滑障速度為50cm2/min，壓縮滑障，得到有序密集排列的單分子膜的π-a等溫曲線如圖4所示。從π-a等溫曲線可以看出，單分子膜的壓縮過程呈現出明顯的氣態膜、液態膜和固態膜三個階段的物理狀態，膜表面壓從緩慢增加、急劇增加到下降，塌陷壓為47.25mn/m，相應平均單分子層極限面積（a*）是310.30cm2。表明chcs單分子膜成膜性能良好，能在水相上穩定存在，從而說明chcs具有良好的兩親性。實施例5（1）膽固醇氯甲酸酯的活化在500ml圓底燒瓶中，按順序加入10.98g膽固醇氯甲酸酯（chol-cl）、200mln,n-二甲基甲醯胺(dmf)以及4.80g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），反應在45℃下攪拌2h後得到無色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白質的兩親性膽固醇殼聚糖酯（chcs）在500ml三口燒瓶中，加入1.0g殼聚糖，隨後加入35ml甲磺酸，通氮氣除氧氣後封口，攪拌至殼聚糖完全溶解，在氮氣保護下，逐滴加入步驟（1）製備的溶液a，反應過程不斷有沉澱析出，反應在45℃下攪拌72h。反應結束後將上述混合物倒入大量冰水中，產物經離心後洗滌，再將所得的洗滌產物通過氯仿溶解-甲醇沉澱方式進行提純後進行抽濾，冷凍乾燥得到米白色固體狀的膽固醇殼聚糖酯（chcs）。chcs對水的靜態接觸角為98.12°。實施例6（1）膽固醇氯甲酸酯的活化在500ml圓底燒瓶中，按順序加入13.73g膽固醇氯甲酸酯（chol-cl）、250mln,n-二甲基甲醯胺(dmf)以及6.0g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），反應在45℃下攪拌2h後得到無色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白質的兩親性膽固醇殼聚糖酯（chcs）在500ml三口燒瓶中，加入1.0g殼聚糖，隨後加入35ml甲磺酸，通氮氣除氧氣後封口，攪拌至殼聚糖完全溶解，在氮氣保護下，逐滴加入步驟（1）製備的溶液a，反應過程不斷有沉澱析出，反應在45℃下攪拌72h。反應結束後將上述混合物倒入大量冰水中，產物經離心後洗滌，再將所得的洗滌產物通過氯仿溶解-甲醇沉澱方式進行提純後進行抽濾，冷凍乾燥得到米白色固體狀的膽固醇殼聚糖酯（chcs）。chcs膜對水的靜態接觸角為106.75°。實施例7將實施例1或實施例2或實施例3或實施例4或實施例5或實施例6製得的不同取代度的chcs配製成15.0mg/ml的氯仿溶液備用。用移液槍取100µl上述備用的溶液，加在清潔乾淨的玻片中心；設定好塗膜機參數（speed1=500r/min，timer1=15s；speed2=2000r/min，timer2=50s）。把玻片置於塗膜機的特定支架上，啟動塗膜機，旋轉塗膜。在50℃乾燥5h後，在另一面以相同條件塗膜。製得的塗層被分別標記為chcs-1、chcs-2、chcs-3、chcs-4、chcs-5和chcs-6。實施例8將殼聚糖(cs)溶解在2%的醋酸溶液中配製成15.0mg/ml的溶液備用，用移液槍取100µl上述備用的溶液，加在清潔乾淨的玻片中心；設定好塗膜機參數（speed1=500r/min，timer1=15s；speed2=2000r/min，timer2=50s）。把玻片置於塗膜機的特定支架上，啟動塗膜機，旋轉塗膜。在50℃乾燥5h後，在另一面以相同條件塗膜。製得的塗層試樣被標記為cs-0。實施例9將實施例7中的一系列csch塗層或實施例8中的cs-0塗層或空白潔淨的玻片分別用50wt%的酒精浸泡1min，再用蒸餾水衝洗去除殘留的酒精，然後浸入到3ml0.01m、ph=7.0pbs溶液中浸泡3h；最後將這些預處理後的塗層或玻璃片浸泡在2ml1.0mg/mlbsa溶液中(蛋白質溶液是用0.01m、ph=7.0pbs配製，現配現用)，在25℃下，吸附3h後，利用bca法，在酶標儀上測定蛋白質溶液在562nm處的吸光值。根據工作曲線從吸光值的大小得到吸附前後蛋白質的濃度，根據濃度變化計算出蛋白質的吸附量，進一步計算出抗蛋白質吸附率。試樣的抗蛋白質吸附率值列於下表；no.cs-0chcs-1chcs-2chcs-3chcs-4chcs-5chcs-6抗蛋白質吸附率44.6%52.1%60.1%67.3%80.3%31.8%28.1%實施例10將實施例7中製得的一系列csch塗層或實施例8中的cs-0塗層或空白潔淨的玻璃片分別用50wt%的酒精浸泡1min，再用蒸餾水衝洗去除殘留的酒精，然後浸入到3ml0.01m、ph=7.0pbs溶液中浸泡3h；最後將這些預處理後的塗層或玻璃片浸泡在2ml0.5mg/mlbsa溶液中(蛋白質溶液是用0.01m、ph=7.0pbs配製，現配現用)，在25℃下，吸附3h後，利用bca法，在酶標儀上測定蛋白質溶液在562nm處的吸光值，根據工作曲線從吸光值的大小得到吸附前後蛋白質的濃度，根據濃度計算出蛋白質的吸附量，進而計算抗蛋白質吸附率。試樣的抗蛋白吸附率值列於下表；no.cs-0chcs-1chcs-2chcs-3chcs-4chcs-5chcs-6抗蛋白質吸附率51.7%77.3%78.8%79.8%91.6%26.2%19.5%將實施例9或實施例10中所列的系列兩親性塗層抗蛋白質吸附率值之間對比，發現實施例9或實施例10中殼聚糖(親水性)和膽固醇氯甲酸酯取代度較高的殼聚糖衍生物塗層（相對膽固醇氯甲酸酯取代度較低的殼聚糖衍生物塗層呈疏水性）吸附蛋白質量都比較多，抗蛋白質吸附率低。而通過調節親水性和疏水性基團或鏈段的比例，使得殼聚糖衍生物中膽固醇基團取代度適中，此兩親性殼聚糖衍生物（即控制兩親性殼聚糖衍生物的兩親性在合理的範圍內）吸附的蛋白質明顯減少，抗蛋白質吸附率極高（如chcs-4）。抗蛋白質吸附機理：蛋白質分子由於特殊的化學結構和複雜的組成，極易吸附在疏水性材料表面。當疏水區域足夠小，與蛋白質分子疏水區域相當，即在表面形成一層親疏水基團交替排列的形式，對蛋白質形成競爭吸附和排斥的作用，會抑制蛋白質分子向材料表面靠近和吸附，調控塗層表面的親疏水面積大小，可以探究最佳的抗蛋白質效果。上述的具體實施方式是對本發明申請的進一步詳細說明，但本發明權利要求保護的範圍並不局限於實施方式中所描述的範圍，凡採用等同替換或等效變形的技術方案，均落在本發明權利要求的保護範圍。當前第1頁12