檢測載體及其製備方法與應用的製作方法

2023-07-08 14:56:56 2

專利名稱：：檢測載體及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及組織化學檢測載體，尤其涉及免疫組織化學檢測載體，更具體的是涉及一種親和素包被的檢測載體。
背景技術：
：目前，許多領域，如核酸的分子雜交和分離純化，抗原抗體反應，靶蛋白的分離純化，藥物篩選等，都可使用酶聯免疫吸附檢測技術(Enzyme—LinkedimmunosorbentAssay,ELISA)。該技術通常使用的實驗器材(如酶標板)主要是聚苯乙烯等疏水性材料，這就必然使實驗器材(如酶標板)表面具有疏水特性。在現有的檢測技術當中，主要是通過與器材表面形成疏水鍵或離子鍵的方式，將親水性物質(如蛋白質、多肽或核酸等)固定在實驗器材(如酶標板)表面。由於不同的親水性物質(如蛋白質、多肽或核酸等)的物理性質是不同的，其表面性質也會有所差異。以蛋白質/多肽為例，由於組成其具體分子的胺基酸種類和數量不盡相同，其親水性/疏水性亦有較大的區別。基於聚苯乙烯等疏水性材料的器材，傳統的固定方法雖然簡便，但是往往不能使親水性的目標物質(如蛋白質、多肽或核酸等)得到充分地固定，尤其是那些呈親水性較強的蛋白質、短肽或核酸。因此，為保證檢測的靈敏度，需要大量蛋白質和短肽來固定，不僅增加生產成本，在操作過程中，還容易將固定的蛋白質和短肽洗脫，致使檢測結果重複性較差。另外，通過此傳統方法固定，易引起蛋白質(如抗體)構象改變(變性)，失去與配基(如抗原表位)的結合能力，致使固定在器材(如酶標板)表面的有效分子數生物素(Biotin)—親和素(Avidin)系統是近年來出現的一種生物反應放大系統，已廣泛應用於免疫學、分子生物學和臨床醫學等領域中。鏈黴親和素(Streptavidin)結合的四聚體SARS抗原肽被應用於對SARS病毒有特異反應性T細胞水平高低的檢測中(CN1613870A)。由於MHC/小肽四聚體能直接刺激特異性的T細胞的核心蛋白複合物，為此利用鏈酶親和素同時能結合四個分子的特性，將製備得到的純的標記有生物素的SARS抗原肽與鏈酶親和素結合後，直接定量測定人外周血樣品中對SARS病毒有特異反應性T細胞水平的高低。在基因晶片的檢測方面，生物素(Biotin)—親和素(Avidin)反應放大系統同樣得以應用(CN101162201A)。晶片點加鏈酶親和素標記的納米級金顆粒，通過鏈酶親和素與生物素的特異結合將金顆粒連接到耙標分子上；然後點加銀染試劑，利用銀染試劑的氧化還原反應形成的銀顆粒沉積在納米金上，形成肉眼可見的雜交信號。這種方法與單歩金標銀染法相比，其靈敏度提高10—100倍。因此，生物素(Biotin)—親和素(Avidin)—直以來應用於反應放大系統，以使得檢測的靈敏度得以有效提高。本發明的一個目的在於提供一種檢測載體。本發明的另一個目的在於提供一種檢測載體包被方法。本發明的又一個目的在於提供一種親水性分子的包被方法。本發明的再一個目的在於提供一種使用親和素包被親水性抗原的方法。本發明的第五個目的在於提供一種經由親水性分子包被方法包被的產物在親和組織化學檢測中的應用，尤其是在類風溼關節炎免疫抗體體外檢測中的應用。本發明所述的高靈敏度檢測載體包括疏水性器材、與其直接結合的親和素，以及結合於親和素上的親水性配基；所述疏水性器材與親和素之間通過疏水相互作用結合；所述配基通過共價連接於其上的生物素非共價地連接於親和素四個亞基；所述親水性配基選自於多肽、蛋白質、核酸或有機小分子。進一步地說，所述親和素(Avidin)是一種分子質量為68,000Da，pl為10.5的一種鹼性糖蛋白，又稱卵白素，在雞蛋清中含量比較豐富，因此--般從蛋白清中提取。所述鏈黴親和素(Streptavidin)是一種從鏈黴菌
發明內容(S&eptomycMavWw7)培養物中提取的蛋白質，相對分子質量60,000Da，不具有糖鏈。其特性與親和素一樣，也具有4個生物素結合位點，與生物素具有高親和力。進一歩地說，本發明所述的疏水性器材選自於塑料或玻璃。塑料應當理解為全部或部份由碳與氧、氫、氮及其它有機及無機元素化合而成，在製造的最後階段成為固體，在製造中某些階段是液體(塑料材料在成為最終產品以前，在某些階段必需要能夠流動。)，因而可以加熱或加壓力，或二者並用的方式，使其形成各種形狀，此龐大而變化多端的材料族類中的任何一種，如樹脂、熱固性樹脂、纖維素衍生物等，在-條長鏈的分子結構中存在眾多的重複原子或分子。塑料包括人工合成或自然界有機材料。玻璃應當被理解為易碎的非晶體物質，這些物質可以是透明的也可以是半透明的，通常由熔融矽和矽碳酸鹽融合組成。玻璃還可以認為是--類不具有結晶過程，而是由熔化狀態固化而來的材料，大體上由Na20、CaO和6Si02化學氧化物組成，具有光學屬性和各種機械屬性。具體地說，所述的疏水性器材由聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯或玻璃等製成，具有多孔構造的酶標板。本發明所述的親水性配基選自於多肽、蛋白質、核酸或有機小分子。多肽和蛋白質即可以為化學合成，也可以通過生物體自身合成。化學合成的多肽和蛋白質可以理解為由多個胺基酸通過一個分子的羧基端與另一分子的氨基端形成醯胺鍵，並由此一一相連形成的兩性(親水性和疏水性)聚合物分子；還可以理解為在以胺基酸為主體結構並通過化學反應方式結合有聚合物的大分子，如聚乙二醇化(PEGylation)修飾(Adv.Drugdeliv.Rev.28,275—299;Adv.Drugdeliv.Rev.54,453—609;Adv.Drugdeliv.Rev.60,1—88)、醯基化(Acylation)(J.Pha腿.Sci.86,768—773;J.Pharma.Sci.86,1365—1368)和糖基化(Glycosylation)(J.Pharma.Sci.87,326—332;Adv.Drugdeliv.Rev.6,103—131;Adv.Drugdeliv.Rev.13,251—267)等。生物體自身合成的蛋白質/多肽可以理解為由胺基酸組成的；也可以理解為在胺基酸的骨架上具有化學修飾的，如糖基化等生物修飾過程。所述多肽至少有兩個胺基酸相連構成。多肽和蛋白質的胺基酸指具有既共價連接氨基又共價連接羧基的不對稱中心碳原子的有機分子。核酸包括DNA和各類RNA(tRNA、mRNA、rRNA禾nsiRNA等)，還包括以核苷為主體結構並結合有聚合物的大分子，如聚乙二醇化(PEGylation)修飾、醯基化(Acylation)和糖基化(Glycosylation)等。所述的聚合物為以催化或加成等聚合化反應合成的支鏈或直鏈聚合物或天然存在的聚合物，如纖維素、澱粉、葡聚糖、甲殼素和脂肪酸等。有機小分子指具有親水性的有C、H、O或C、H、O、N、P、S等幾種元素組成的分子量小於2000Da的有機小分子，如各類胺基酸、水溶性維生素(Vitamin)和分子量在200—2000Da的聚合物，如聚乙二醇等o本發明所述的檢測載體製備方法，依次包括如下具體步驟1、配置包被液；2、將包被液加入疏水性器材表面；3、在0—4(TC條件下保存6小時以上4、洗滌疏水性器材表面2次以上；5、加入含有經生物素標記的親水性分子的溶液於洗滌後的疏水性器材表面；6、10—30。C條件下保存1小時以上;7、洗滌疏水性器材表面2次以上。進一歩地說，所述的包被液pH為7.0—8.0的緩衝液，其中溶解有濃度為0.1—10ug/mL的親和素，可以選擇0.5、1、2或5嗎/mL。所述的緩衝液具體可以為磷酸緩衝液(PhosphateBuffer,PB)、磷酸緩衝鹽溶液(PhosphateBufferSaline,PBS)、檸檬酸緩衝液、碳酸鹽緩衝液、Tris—HC1、三羥甲基氨基甲垸緩衝液(TBS)和巴比妥緩衝液。所述的親和素具體為鏈酶親和素。'具體地說，所述的緩衝液pH選擇7.4。具體地說，所述的緩衝液選擇磷酸緩衝鹽溶液。進一歩地說，所述的疏水性器材為具有一定體積的容器或直板。更進一歩地說，所述的疏水性器材為酶標板。具體地說，所述的疏水性器材為96或48孔酶標板。進一歩地說，所述的0—40。C溫度範圍選擇0—10。C。更進一步地說，所述的0—1(TC溫度範圍選擇2—8°C，具體可以選擇4°C。進-^歩地說，所述的6小時以上的孵育時間，具體為12小時以上，可以選擇範圍為12—18小時。進一歩地說，所述的洗滌液為pH為7.4的緩衝液。所述的緩衝液具體可以為磷酸緩衝液、磷酸緩衝鹽溶液、檸檬酸緩衝液、碳酸鹽緩衝液、Tris—HCl、三羥甲基氨基甲垸緩衝液(TBS)和巴比妥緩衝液。具體地說，所述的緩衝液選擇磷酸緩衝鹽溶液。進一步地說，所述的親水性分子為蛋白質、多肽、核酸或有機小分子。更進一步地說，所述的親水性分子為抗原，其能與抗體結合形成抗原抗體複合物。更進一步地說，所述的親水性分子為蛋白質或多肽抗原。進一歩地說，所述的10—30。C溫度範圍選擇15—25t:。具體地說，所述的10—3(TC溫度範圍優選20—25'C。本發明所述的檢測載體製備方法，還包括的後續步驟有乾燥，真空封存。本發明通過親和素或鏈黴親和素與疏水性器材之間的疏水相互作用而直接結合，再通過共價連接於配基上的生物素以非共價連接於親和素或鏈黴親和素四個亞基即得到檢測載體，另一方面也同時實現了親水性分子，尤其是親水性抗原的包被。所述親水性配基選自於多肽、蛋白質、核酸或有機小分子。本發明所述的檢測載體製備方法在ELISA檢測中的應用。本發明所述的檢測載體製備方法在類風溼關節炎免疫抗體體外檢測中的應用。本發明所述的鏈酶親和素分子中存在大量的疏水基團，可與疏水性器材(如酶標板)表面緊密結合，並克服了在檢測各個步驟中洗滌疏水性器材(如酶標板)表面而容易將固定的蛋白質和短肽洗脫的缺陷，提高包被分子的有效性，從而提高了檢測結果的重複性。每個鏈黴親和素分子含有4個與生物素結合的亞基，並且鏈黴親和素與生物素結合雖然是非共價鍵，但其親和力接近共價鍵，很穩定，生物素在1(T"mol/L濃度即可與親和素結合(Kdl(T15)。本發明所述的親水性分子的生物素標記方法可以通過先由固相合成或基因工程表達並純化，所得蛋白質或多肽再與生物素連接並純化(如申請號為200310108264.0中國發明專利所公開的技術方案)。多肽固相合成技術的具體歩驟參見Eur.J.Immunol.1994,24,3188—3193;J.Org.Chem.1972,37,3404—3409;黃惟德，陳常慶多肽合成，北京科學出版社，1985。還可以選擇採用在固相合成過程中先與生物素連接再純化的方式分別進行，其具體方式參見Deibel,M.R.,Jr.,Lobl,T.J.andYem,A.W.,Atechniqueforrapidpurificationoflowyieldproducts:Biotinylationofchemicallysynthesizedproteinson-resin.Pept.Res.1989,2,189一194。核酸可以通過化學合成或各類聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction,PCR)方法獲得後，再與生物素連接；或在化學合成過程中先與生物素連接再純化的方式得到。在常規的ELISA方法中，在固定蛋白質或多肽之後，一般需用封閉液(如含有牛血清白蛋白)封閉未包被的酶標板表面。但經鏈酶親和素包被後的酶標板用於ELISA檢測方法中，應用親和素(如鏈黴親和素)預包被的酶標板，可與生物素標記的多肽分子定向結合，即結合的多肽分子游離於酶標板表面，呈現類似三維樣結構，減少空間位阻，有利於多肽分子在保持空間構象情況下與待測樣品(如血清)中特異分子(如抗體)結合，增加分子間(如抗原一抗體)的親和力，從而表現出良好的特異性。使用本發明的技術方案包被的疏水性器材(如酶標板)不會引起血清中蛋白和酶標記二抗的結合，從而減少常規封閉步驟，使得抗原(蛋白質、多肽或核酸)分子形成空間構象，進一歩保證分子構象。經鏈黴親和素包被的疏水性器材(如酶標板)有如下特性對生物素或生物素標記分子高親和力；具有一致的高包被數量；較低的洗脫性(如酶標板每個小孔小於6ng);對一般的表面活性劑(如SDS，TritonX一100，NP—40，Tween—20等)具有耐受性；穩定性高，易於長期保存(2—8。C可保存至少1年)；具有預封閉特性，可立即使用，免去常規的封閉步驟等。生物素標記的核酸(DNA或RNA)、蛋白質或多肽和小的有機分子等的結合實驗均可應用此系統，如核酸的分子雜交、分離純化，抗原抗體反應，靶蛋白的分離純化，藥物篩選等，既可應用到科學研究，又可應用到臨床檢測系統中。具體實施例方式以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍中。本發明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪一奧德裡奇(Sigma—Aldrich)。實施例1檢測載體的製備濃縮洗滌液的配製先根據下表配製10倍濃度的pH7.4磷酸鹽緩衝液，Tween—20濃度可以為0.1—0.05%(v/v)，本發明應用0.05%(v/v)(簡稱10xPBST)，tableseeoriginaldocumentpage10樣品稀釋液用於稀釋待檢樣品，其配比如下:試劑名稱用量牛血清白蛋白(BSA)25g1%(w/v)硫柳汞鈉鹽12.5ml慶大黴素(40mg/ml)6.25ml1倍濃度PBST(lxPBST)2482ml包被液的配製l倍濃度的磷酸鹽緩衝液(lxPBS，pH7.4)用於稀釋和包被親和素到酶標板表面；lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween⑧一20)用於稀釋生物素標記的親水性分子(蛋白質、多肽或核酸)。親水性分子具體包被方法如下用包被液("PBS,pH7.4)稀釋鏈黴親和素至濃度為2嗎/ml，然後加入到酶標板各孔中(140"L/孔)，4。C過夜(12—18小時)，取出酶標板，去除包被液，用洗滌液lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)洗2次，然後加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween⑨—20)稀釋生物素標記的多肽，在脫色搖床上混勻，室溫孵育l小時，棄去未結合的生物素標記的多肽，350(illxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)洗板2次，乾燥。真空箱內保存待用。生產時，將酶標板條裝入袋中，真空封口。實施例2檢測載體的製備所述洗滌液、稀釋液和包被液如實施例l所述。親水性分子具體包被方法如下用包被液稀釋鏈黴親和素，然後加入到酶標板各孔中，l(TC過夜，取出酶標板，去除包被液，用洗滌液洗2次，然後加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween⑧一20)稀釋生物素標記的多肽，2(TC孵育1小日寸(在脫色搖床—匕混勻)，棄去未結合的生物素標記的多肽，洗板，乾燥。真空箱內保存待用。實施例3檢測載體的製備所述洗滌液、稀釋液和包被液如實施例1所述。親水性分子具體包被方法如下用包被液稀釋鏈黴親和素，使其濃度為l嗎/ml。然後加入到酶標板各孔中，37'C8小時，取出酶標板，去除包被液，用洗滌液洗2次，然後加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)稀釋生物素標記的多肽，3(TC孵育1小時(在脫色搖床上混勻)，棄去未結合的生物素標記的多肽，洗板，乾燥。真空箱內保存待用。實施例4檢測載體的製備所述洗滌液、稀釋液和包被液如實施例1所述。親水性分子具體包被方法如下用包被液稀釋鏈黴親和素，使其濃度為0.5pg/ml。然後加入到酶標板各孔中，2(TC15小時，取出酶標板，去除包被液，用洗滌液洗3次，然後加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)稀釋生物素標記的多肽，10。C孵育2.5小時(在脫色搖床上混勻)，棄去未結合的生物素標記的多肽，洗板，乾燥。真空箱內保存待用。實施例5檢測載體的製備所述洗滌液、稀釋液和包被液如實施例l所述。親水性分子具體包被方法如下用包被液稀釋鏈黴親和素，使其濃度為2叫/ml。然後加入到聚苯乙烯酶標板各孔中，4"C20小時，取出酶標板，去除包被液，用洗滌液洗3次，然後加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)稀釋生物素標記的多肽，25。C孵育1小時(在脫色搖床上混勻)，棄去未結合的生物素標記的多肽，洗板，乾燥。真空箱內保存待用。實施例6不同製備方法的比較生物素標記抗原的購自(吉爾生化(上海)有限公司)，其胺基酸序列如下His—Gin—Cys—His—Gin—Glu—Ser—Thr—Cit—Gly—Arg—Ser—Arg—Gly—Arg—Cys—Gly—Arg—Ser—Gly—Ser;Cit為瓜氨酸，第三位和十六位Cys之間形成二硫鍵。抗體檢測試劑的製備抗人IgG抗體為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)標記的兔抗人IgG抗體採購於武漢博士德生物工程有限公司(貨號BA1070)。其具體配製方式為，取20jiL儲存液，加800ml抗體稀釋液作l:40000稀釋，混勻，分裝標準小瓶，每瓶15ml，28。C下保存。抗體稀釋液購自Pierce公司(貨號37552)。HRP標記的抗人IgG抗體底物A配製稱取檸檬酸17.9g和Na2HP04'12204.67g溶解於400ml去離子水中，然後緩慢加入30%H2O2330|iL，攪拌均勻後，加水至500ml，28。C下保存。HRP標記的抗人IgG抗體底物B配製稱取四甲基聯苯氨(tetmmethy1benzidine,TMB)O.lg於100ml去離子水中，加入二甲基亞碸(DMSO)2.5ml，在攪拌的同時，緩慢加入0.5ml6MHC1，直至完全溶解，最後加水至500ml，28。C下保存。HRP標記的抗人IgG抗體底物反應終止液的配製分別量取55ml98y。H2S04和去離子水445ml，然後將濃硫酸緩慢加入到去離子水中，混勻，28"C下保存。所述洗滌液、稀釋液和包被液如實施例l所述。使用親和素或鏈黴親和素的製備方法如下用包被液(lxPBST，pH7.4)稀釋鏈黴親和素，使其濃度為2嗎/ml，然後加入到酶標板(96孔)各孔中(每孔150pL)，4"C過夜，取出酶標板，去除包被液，用洗滌液(lxPBST，pH7.4)洗2次，然後加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)稀釋濃度為0.25|ig/ml生物素標記的多肽，每孔100pL。室溫(20—25。C)孵育1小時(在脫色搖床上混勻)，棄去未結合的生物素標記的多肽，洗板2次，加入類風溼關節炎患者血清，洗板2次，再加入HRP標記抗人IgG抗體，TMB底物顯色。不使用親和素處理的製備方法如下使用同樣酶標板，上述同樣的操作方法，只是去除鏈黴親和素包被，將10(ig/ml生物素標記多肽加入酶標板中(每孔100pL)直接包被，4°C過夜，取出酶標板，洗板2次，封閉，洗板2次，加入類風溼關節炎患者血清，洗板2次，再加入HRP標記抗人IgG抗體，TMB底物顯色。酶標儀測定波長設定在450nm，測定0045值。檢測結果發現，未使用親和素包被的酶標板，在最大包被濃度10叱/ml的包被濃度情況下產生的吸光度值為OD45。=0.781;而先用鏈酶親和素包被的酶標板在濃度0.25嗎/ml的包被濃度情況下產生的吸光度值為OD450=1.583。權利要求1、一種檢測載體，其特徵在於包括疏水性器材、與其直接結合的親和素或鏈黴親和素，以及結合於親和素或鏈黴親和素上的親水性配基；所述疏水性器材與親和素或鏈黴親和素之間通過疏水相互作用結合；所述配基是通過共價連接於其上的生物素以非共價連接於親和素或鏈黴親和素四個亞基；所述親水性配基選自於多肽、蛋白質、核酸或有機小分子。2、根據權利要求l所述的檢測載體，其特徵在於所述的疏水性器材由聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯或玻璃製成。3、根據權利要求1或2所述的檢測載體，其特徵在於所述的疏水性器材為一多孔板。4、根據權利要求3所述的檢測載體，其特徵在於所述的疏水性器材為96孔或48孔酶標板。5、一種權利要求1所述的檢測載體的製備方法，依次包括如下具體歩驟a)配置包被液；b)將包被液加入疏水性器材表面；c)在0—4.C條件下保存6小時以上；d)洗滌疏水性器材表面2次以上；e)加入含有經生物素標記的親水性分子的溶液於洗滌後的疏水性器材表面；f)10—30'C條件下保存1小時以上；g)洗滌疏水性器材表面2次以上；所述的包被液pH為7.0—8.0的緩衝液，其中溶解有濃度為O.l—10ug/mL的親和素或鏈酶親和素。6、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於所述的包被液為pH7.4的磷酸緩衝液或磷酸緩衝鹽溶液，所述的鏈酶親和素濃度為2ug/mL。7、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於所述的疏水性器材為容器或直板。8、根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於所述的疏水性器材為酶標板。9、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於所述的疏水性器材由聚苯乙烯、聚乙烯或聚氯乙烯製成。10、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於在所述的溫度範圍內選擇4。C。11、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於在所述的保存時間為12小時以上。12、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於在所述的10—3(TC溫度範圍選擇20_25°C。13、一種權利要求1、2或4所述的檢測載體在親和組織化學檢測中的應用。14、根據權利要求13所述的在親和組織化學檢測中的應用，其特徵在於在ELISA檢測中的應用。15、一種權利要求5—12之一所述的製備方法在ELISA檢測中的應用。全文摘要本發明公開了一種檢測載體及其製備方法，先將親和素/鏈黴親和素處理疏水性器材表面，之後將結合有生物素的親水性分子與親和素/鏈黴親和素相結合，從而完成對親水性分子的包被。親和素/鏈黴親和素可與疏水性器材表面緊密結合，並克服在檢測各個步驟中洗滌疏水性器材表面而容易將固定的蛋白質和短肽洗脫的缺陷，提高包被分子的有效性，從而提高了檢測結果的重複性。包被後的分子對一般的表面活性劑具有耐受性；穩定性高，易於長期保存；具有預封閉特性，可立即使用，免去常規的封閉步驟等。文檔編號G01N33/544GK101387642SQ200810201149公開日2009年3月18日申請日期2008年10月14日優先權日2008年10月14日發明者朱紹榮,王紹成申請人:上海榮盛生物藥業有限公司