一種來源於墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法

2023-08-04 00:50:36

專利名稱：一種來源於墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程技術領域，特別涉及一種來源於墊狀巻柏的海藻 糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法。
背景技術：
塾4犬巻4白(Selaginella pulvinata Maxim)為巻4白^f巻^白屬才直4勿，俗,爾 "九死還魂草"。它一^L多生長在荒山禿嶺及千旱的巖石縫中，極耐乾旱，也 耐寒。在天氣乾旱的時候，小枝就巻起來，縮成一團，以保住體內的水分。一 旦得到雨水，氣溫升高，巻縮的小枝會平展開來。有研究表明墊狀巻柏這類復 蘇植物體內含有大量的應激代謝物-海藻糖。
海藻糖又稱酵母糖，是由兩個吡喃環葡萄糖分子通過a-l,l糖苷鍵連結 而成的非還原性糖，其理化性質十分穩定，能夠在高溫、高寒、高鹽和乾燥失 水等惡劣條件下對生物細胞起到保護作用。海藻糖作為滲透調節物質通過滲透 調節來維持高的細胞質滲透壓，保證在乾旱脅迫下細胞的正常生理功能；在缺 水情況下，可以保持細胞膜的液體流動相，防止細胞膜通透性增加，出現融合 現象；可以替代水分子通過氫4定作用參與肽鏈摺疊，維持在缺水情況下蛋白質 的空間結構和功能。
在生物體內，海藻糖的生物合成過程為先由海藻糖-6-磷酸合成酶 (trehalose-6-phosphate synthase, TPS )催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDP )和 6-磷酸葡萄糖反應生成6-磷酸海藻糖，再在海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶 (trehalose-6-phosphate phosphatase, TPP )的作用下脫石舞酸，最終生成海 藻糖。其中，海藻糖-6-磷酸合成酶是該合成途徑中的一個關鍵酶；不同生物 體內的海藻糖-6-磷酸合成酶具有各自不同的特點，如在編碼基因和結構等方
面即存在著明顯的差異。
目前人們研究海藻糖的主要策略之一，是通過對海藻糖上述合成途徑相關
基因的克隆與表達研究，增強其合成途徑的代謝，從而實現海藻糖在生物體內 的富集。其中海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)成為主要關注對象之一，許多科學
7家在此方面進行了不懈的努力。但目前，人們對大腸桿菌和真菌等體內TPS基 因的研究與利用相對較多，對植物體內TPS基因的開發研究還非常有限。

發明內容
本發明的主要目的就是針對現有技術對植物體內海藻糖-6-磷酸合成酶 (TPS )基因開發研究的局限性，提供一種來源於植物墊狀巻柏的海藻糖-6-磷 酸合成酶的基因序列，以期待應用於其它轉基因作物中使之具有相應的優良的 抗旱耐鹽等性能。
本發明的另一個目的是提供一種上述基因序列的克隆方法。
為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下
一種來源於墊狀巻柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，該序列具有如SEQ ID NO. 1所述的核香酸序列。
其所對應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
上述核苷酸序列，可通過包括下述步驟的方法，從植物墊狀巻柏葉片中提 取總RNA、設計引物、進行PCR擴增、測序等克隆得到
(1) 總RNA的提取和純化
可採用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物墊狀巻柏葉片中提取 得到純化的墊狀巻柏葉片總RNA;
常用的RNA提取方法很多，如試劑盒法(Trizol法)、熱硼酸法、異硫氰 酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸鈉法、十六烷基三曱基溴化銨法、及各種改 進方法等，均可用於墊狀巻柏葉片總RNA的提取；本發明中可優選Trizol法。
純化主要是為了去除總RNA中的DNA汙染，獲得純化的墊狀巻柏葉片總 RNA，以滿足後續對目的基因的表達進行定量檢測等需要。常用的RNA純化方 法包括DNA酶消化法(簡稱D法)、酸酚變性法(簡稱S法)、EDTA法(筒稱E 法)等；本發明中可優選DNA酶消化法。
(2) 中間片段的克隆
A、中間片段cDNA第一鏈的合成
以上述步驟(1)純化的墊狀巻柏葉片總RNA作為模板，以oligod (T) 18: 5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3'為反轉錄引物，進行cDNA第一鏈合成，得到的cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的cDNA
模板；
B、 PCR擴增
以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為cDNA才莫板，利用下述上遊 引物jfl和下遊引物jxl，進行PCR擴增 j f1: 5'-TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG-3', jxl: 5'-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3';
擴增得到墊狀巻柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中間片段，通過克隆 測序，得到中間片^:序列。
本步驟中，擴增體系可優選為
TaqPlusPCR Master Mix 10 |iL ,
c腿模板 1 juL ,
2x引物(jxl/jfl) 0.5 juL ,
ddH20 8 。
擴增程序可優選為
94°C, 5min;
94 。C， 30 s, 55 。C, 45 s, 72°C， 1 min 30 s ( 30個循環)； 72 。C， 8 min; 4。C保溫。 (3) 3'端的克隆
根據上述步驟(2)得到的中間片段序列，設計併合成用於擴增3'端的特 異性上遊引物Sl和通用性下遊引物AP2,分別為 S1:5'-GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3', AP2: 5'-TACGTACGGCATG ACAGTG-3';
以前述步驟(2 ) A中得到的cDNA第一鏈為模板，利用上遊引物Sl和下遊 引物AP2進行PCR擴增；擴增得到完整的3'端，通過克隆測序，得到3'端序 列。
本步驟中，擴增體系可優選為
TaqPlusPCR Master Mix 10 yL , c醒模板 2 jaL ,
92x引物(S1/AP2) 0.5 |iL ,
ddH20 7 ja 。
擴增程序可優選為 94°C, 3 min;
94°C， 30 s; 55°C, 45 s; 72°C, 1 min 30 s ( 33 72°C, 8 min; 12。C保溫。 (4)、 5'端的克隆:
C、 合成5'端的cDNA第一鏈
以上述步驟(1)純化的墊狀巻柏葉片總RNA作為才莫板，以下述特異性下 遊引物jxl和5'端接頭上遊引物SMARTI IA 01 igo為反轉錄引物，進行反轉錄 jxl: 5'- TGTTCGGGCATTGTTGTCAT- 3',
SMARTIIA Oligo: 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'; 合成得到反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈；
D、 第一段PCR擴增
根據上述步驟(2 )得到的中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物A2 和同源上遊引物Cl:
A2: 5'-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3', CI: 5'-ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3';
以前述步驟C所得反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈為cDNA模板，利用特異 性下遊引物A2和同源上遊引物CI,進4亍5'端第一I殳PCR擴增；
擴增得到的產物為cMA5'端第一段，通過克隆測序，得到5'端第一段的 序列。
本步驟中，擴增體系可優選為
TaqPlusPCR Master Mix 12 jliL ， cDM模板 2 |iL ，
2 x引物(A2/C1 ) 0. 5 jaL ,
細20 5 juL 。
擴增程序可優選為 94。C， 3 min;94°C， 30 s; 65°C, 45 s; 72°C， 1 min 30 s (2個循環)； 每兩個循環遞減2°C;
94°C， 30 s; 55°C， 45 s; 72°C, 1 min 30 s (25個循環)； 72°C， 8 min; 12。C保溫。 E、第二段PCR擴增
根據前述步驟D所得cDNA 5'端第一段的序列，設計併合成特異性下遊引 物A5和5'端通用性上遊引物P3:
A5: 5'-GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3', P3: 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';
以前述步驟C所得反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈為cDNA模板，利用特異 性下遊引物A5和5'端通用性上遊引物P3，進行5'端第二段PCR擴增
擴增得到的產物為cDNA5'端第二段，通過克隆測序，得到5'端第二段序列。
本步驟中，擴增體系可優選為
TaqPlusPCR Master Mix 10 jiL ， c腿模板 1. 5 iaL ,
2 x引物(A5/P3) 0. 5 juL ,
ddH20 7. 5 juL 。
擴增程序可優選為
94°C, 30 s; 72°C, 2 min ( 5個循環)；
94°C, 30 s; 70°C, 30 s; 72°C, 2 min (5個循環)；
94°C, 30 s; 68°C, 30 s; 72°C, 2 min (25個循環)；
12。C保溫。
(5 ) ORF的克隆和拼接
將上述步驟(2 )所得中間片段序列、步驟(3 )所得3'端序列、和步驟(4 )
所得5'端第一段序列和第二段序列進行拼接，得到的cDNA全長作為ORF( Open
Reading Frame,開》文閱讀框)擴增的cDNA才莫一反；
以下述上遊引物0RF4和下遊引物0RF5進行PCR擴增
ORF 4: 5'-CCCAAGCTT (HindiII)CCTCGAG (Xhol)ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC
ii-3',
0RF5: 5'-CGC GGATCC (BamHI)ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3'; 擴增得到的產物為完整開放閱讀框，即墊狀巻柏的海藻糖-6-磷酸合成酶 基因，通過克隆測序，即得其基因序列。 本步驟中，擴增體系可優選為
2 xGC Buffer I (含Mg+)104 ，
2x引物(ORF4/ORF5)0. 5JUL ，
cDNA模板1 juL ,d證Mixture3. 2JUL ，
TaKaRa LA Taq0. 24 ，
ddH204. 64 。
擴增程序可優選為 94°C， 5 min;
94°C， 30 s; 57°C, 1 min 30 s; 72°C, 2 min (IO個循環)； 94°C, 30 s; 72°C， 2 min 30 s (25個循環)； 72°C， 8 min; 12。C保溫。 與現有技術相比，本發明的有益效果是
本發明來源於植物墊狀巻柏的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS )的基因序列是 一種新的TPS基因序列，使人們對TPS基因的研究對象從大腸桿菌和真菌等微 生物及少數有限的植物體進一 步擴展到墊狀巻柏等多種植物體。
並且，根據該TPS基因在墊狀巻柏植物體內催化合成的海藻糖所表現出的 優良的抗旱、耐鹽等性能可以預料如果將其通過轉基因技術導入玉米等其他 植物的基因中，將可培育出具有相應的優良的抗旱、耐鹽等性能的植物新品種。


圖1為SpTPSl基因中間片段電泳檢測結果圖， 圖2為SpTPSl基因3'端電泳4企測結果圖， 圖3為SpTPSl基因5'第一段電泳檢測結果圖， 圖4為SpTPSl基因5'第二段電泳檢測結果圖，
12圖5為SpTPSl基因電泳檢測結果圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施方式
對本發明的上述發明內容作進一步的詳細描述。
但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於下述實施例。在不脫離本 發明上述技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替 換和變更，均應包括在本發明的範圍內。
在下述各實施例中，將墊狀巻柏的海藻糖-6-磷酸合成酶簡稱為5^77757。 通過各實施例，最終得到來源於墊狀巻柏的海藻糖-6-磷酸合成酶核苷酸序列 (如SEQ ID NO. 1所述)及其所對應的胺基酸序列(如SEQ ID NO. 2所述)。
實施例1
本實施例為墊狀巻柏葉片總RM的提取和純化，包括下述步驟
(1) 取墊狀巻柏幼嫩葉片放入液氮預冷過的研缽，立即加入液氮，盡可 能的研磨碎樣品，趁液氮尚未揮發將樣品按每管0. 1 g分裝入用液氮預冷過的 1. 5 mL離心管中，立即向每管力口入1 mL Trizol (Invitrogen公司)，劇烈振 蕩後，室溫i丈置5 min。
(2) 4°C、 12000 r/min離心2 min,將上清液轉入新的無RNase的離心管中。
(3) 向每管加入0. 1 mL 5 mol/L的NaCl,混合均勻，再向每管加入0. 3 mL氯仿，劇烈振蕩15s後，室溫;故置3min, 4°C、 12000 r/min離心15min, 在儘可能不吸入中間層的情況下，吸出上清液轉入另一乾淨的1.5 mL離心管 中。
(4) 向每管加入與所得上清液相等體積的異丙醇，輕輕混勻後，室溫放 置10 min, 4°C、 12000 r/min離心10 min，小心倒掉管中液體，保留沉澱， 加入l mL 75%乙醇洗滌沉澱。
(5) 4°C、 7500 r/min離心5 min，小心倒掉管中液體，保留沉澱，再加 入l mL 75%乙醇洗滌沉澱，4°C、 7500 r/min離心5 min,，所得沉澱即為墊 狀巻柏葉片總RNA， -20。C保存。
實施例2本實施例為i^7^57基因中間片段的克隆，方法如下
以上述實施例1所得純化的墊狀巻柏葉片總RNA作為4莫板，以oligod (T) 18: 5' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T) 18-3'為反轉錄引物，按照 Takara公司的PrimeScript Reverse Transcriptase說明書進行c腿第一鏈 合成，擴增體系總體積為20 jLiL;得到中間片段的cDNA第一鏈。
先通過比對5個已知的海藻糖-6-磷酸合成酶M酸序列復活巻柏 (/ep/cto/^//" 77^57 U96736. 1 ); 番痴 ( 5Wa刀咖
//co; em.c咖7戶i7 E. F151131. 1);擬南芥( ^ra6/do;^/s /^a/y犯a ZP57 NM106505. 4 ); 小立豌蘚 r戶i7 (戶力j^co肌'"e//3 w&;7 777^7
XM001778453 );甘蔗ZPW ( &cc/ a/7//z7力/6Wd cw/"rar r戶57 EU761244 ), 確定出中間位置的保守區域，再以復活巻柏r屍W為詢問序列在NCBI進行核苷 酸比對，結合比對情況，得到一對兼併引物
jfl: 5'-TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG -3';
jxl: 5'-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3'。
以前述中間片段的cDM第一鏈為cDNA模板，以設計的引物jfl和jxl進 行墊狀巻柏海藻糖-6-磷S臾合成酶基因cDNA中間片段的擴增。 擴增體系為TaqPlusPCR Master Mix10 pL c腿模板 1 ILiL
2x引物(jxl/jfl) 0. 5 |aL
ddH20 8 jaL
擴增程序為94°C， 5min;
94 °C, 30 s, 55 °C, 45 s， 72°C, 1 min 30 s ( 30個循環)； 72 °C， 8 min; 4。C保溫。 取所得擴增產物IO jaL經1%非變性瓊脂糖凝膠80 V電泳40 min， EB染 色後紫外線才全測擴增片段，結果如圖l所示。
擴增得到的產物為分7Pi7基因cDNA中間片段，通過包括下述步驟的方法 克隆測序，得到的中間片段序列如SEQ ID NO. 3所述 ①目的片段的回收與純化
將擴增出來的特異條帶用乾淨刀片在紫外光下快而準確的從瓊脂糖中挖出，置於1.5 mL離心管中，用凝膠回收試劑盒(北京天根公司)回收膠中的 DNA片段；
② 連接反應
將回收的DNA片段克隆於TaKaRa公司的pMD18-T載體中。連接反應採用 連接試劑盒(Takara公司)，擴增體系總體積10 16。C連接過夜；
③ 感受態細l包的製備
I 、從LB平板上挑取新活化的￡ co// "^5"單菌落，接種於3-5 mL LB 液體培養基中，37°C、 225 r/min振蕩培養12h左右，直至對數生長後期；將 該菌懸液以1: 100-1: 50的比例接種於100 mL LB液體培養基中，37。C振蕩培 養2-3 h至OD600 = 0. 35-0. 5左右；
II、 將培養液轉入離心管中，冰上放置10min,然後於4。C下3000 r/min 離心10 min;
III、 棄去上清，用預冷的0. 05 mol/L的CaCl2溶液10 mL輕輕懸浮細胞， ;水上》文置15-30 min後，4。C下3000 r/min離心10 min;
IV、 棄去上清，加入4 mL預冷含15。/。甘油的0. 05 mol/L的CaCl2溶液， 輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態細胞懸液；
V、 將感受態細胞分裝成200 juL的小份，貯存於-8(TC可保存半年；
④ 質粒DNA的轉化
I、 從-8(TC冰箱中取出一管大腸桿菌感受態細胞i^5"，置於冰上融化；
II、 在無菌條件下加入10 juL連接反應液，輕輕渦旋混勻後，在冰上放 置30 min;
III、 42。C水浴熱擊90 s,不要搖動，之後迅速放入冰浴冷卻2-3 min;
IV、 力口入700 |uL無Amp的LB液體i條養基，混勻後，37°C、 100 r/min 搖床振搖培養，溫育45 min;
V、 取100 nL已轉化的菌液塗於一個LB/Amp的培養平一反上，正面朝上 放置30 min，待菌液完全被培養基吸收後，用封口膜封住，然後倒轉培養皿， 37。C避光培養16-24 h;隨後篩選陽性菌落；
⑤ 重組菌落的鑑定與保存
從外觀上看， 一般白色且圓的菌落為陽性，準確鑑定還需要以下的步驟
15I 、在過夜培養的平板上用滅菌的牙籤挑取幾個白色菌落，分別點種於盛
有含O. 1 g/L Amp的LB液體培養基的1. 5 mL離心管中，37°C、 100 r/min振 搖培養過夜；
II、 取IO juL的菌懸液於1. 5 mL離心管中，加入90 |aLddH20，煮沸10 min，離心，取上清液2 juL作為才莫板，用引物jf 1/jxl進行PCR擴增，PCR 擴增體系和擴增條件均同前，用1%的非變性瓊脂糖凝膠電泳;險測擴增產物； 如果產物為目的條帶時，此重組菌落為陽性克隆，否則為陰性；同時設不加菌 懸液的陰性對照；
III、 取已經鑑定的陽性克隆的菌落懸浮液750 juL,加入250 juL的滅菌 甘油，混勻後，用液氮速凍，置於-8(TC冰箱中保存備用；
IV、 最後送英-睃生物技術公司測序，所得序列在NCBI的Blastn進行比對 分析，驗證克隆片段是否正確。
實施例3
本實施例為SpTPSl基因3'端的克隆，方法如下
根據上述中間片段的測序結果，設計合成1個特異性上遊引物
SI:5'-GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3',
另外設計合成1個3'端通用性下遊引物
AP2: 5'-TACGTACGGCATGACAGTG-3';
以前述實施例2得到的中間片段cDNA第一鏈為模板，利用上遊引物S1和 下遊引物AP2進行PCR擴增；
擴增體系為
TaqPlusPCR Master Mix
cDNA模板
2x引物(S1/AP2)
ddH20
擴增程序為
94°C, 3 min;
94°C， 30 s; 55°C, 45 s;
72°C, 8 min; 12。C保溫。
10 iliL ， 2 iaL , 0. 5 |uL 7 ja 。
72°C, 1 min 30 s (33個循環)取所得擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。
擴增得到的產物為分W57基因3'端，通過克隆測序，得到的3'端序列如 SEQ ID NO. 4所述。
克隆測序參照前述中間片段的測序方法，將電泳檢測後的產物經膠回收試 劑盒回收，再將回收的產物克隆到pMD18-T載體上，轉化E. coliDH5a感受 態細胞，以S1/AP2為引物，經菌液PCR驗證後，用質粒小提試劑盒提取質粒 (北京天根生化科技有限公司)，並將菌液送英駿生物技術公司測序。所得序 列在NCBI的Blastn進行比對分析，驗證克隆片段是否正確。
實施例4
本實施例為SpTPSl基因5'端的克隆，包括下述步驟
(1) 、 5'端的cDNA第一鏈合成
以上述實施例1所得純化的墊狀巻柏葉片總RNA作為才莫板，以下述特異性 下遊引物jxl和5'端接頭上遊引物SMARTIIA Oligo為反轉錄引物，釆用MMLV Reverse Transcriptase (大連寶生物^^司)進行反轉錄，反轉錄擴增體系總 體積為10 u L:
jxl: 5'-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3',
SMARTIIA Oligo: 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'; 合成得到反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈；
(2) 、第一段PCR擴增
根據上述步驟(2 )得到的中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物A2: A2: 5'-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3',
再根據設計中間片段的5個已知的6-磷酸海藻糖合成酶序列的比對(同 上)，在靠近5'端處尋找同源區段，設計併合成同源上遊引物C1: CI: 5'-ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3';
以前述步驟(1 )所得反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈為cDNA才莫板，利用 特異性下遊引物A2和同源上遊引物CI,進行5'端第一段PCR擴增； 擴增體系為
TaqPlusPCR Master Mix 12 jliL , c飄模板 2 iliL ，
172 x引物(A2/C1) 0. 5 pL ，
ddH20 5 jliL 。
擴增程序為
94°C, 3 min;
94°C, 30 s; 65°C， 45 s; 72°C， 1 min 30 s (2個循環)； 每兩個循環遞減2°C;
94°C， 30 s; 55°C, 45 s; 72°C, 1 min 30 s (25個循環)； 72°C, 8 min; 12。C保溫。 取所得擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示。 擴增得到的產物為5WPW基因5'端第一段，通過克隆測序，得到的5'端 第一段序列如SEQ ID NO. 5所述。
克隆測序參照前述中間片段的測序方法，將電泳檢測後的產物經膠回收試 劑盒回收，再將回收的產物克隆到pMD18-T載體上，轉化E. coliDH5a感受 態細胞，以A2/C1為引物，經菌液PCR驗證後，提取質粒，並將菌液送英駿生 物技術公司測序。所得序列在NCBI的Blastn進行比對分析，驗證克隆片段是 否正確。
(3)、第二段PCR擴增
根據前述步驟(2 )所得cDNA 5'端第一段的序列，設計併合成特異性下遊 引物A5:
A5: 5GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3',
另外根據5'端反轉錄接頭引物設計合成1個5'端通用性上遊引物P3: P3: 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';
以前述步驟(1)所得反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈為cDNA模板，利用 特異性下遊引物A5和5'端通用性上遊引物P3，進行S'端第二段PCR擴增
擴增體系為
TaqPlusPCR Master Mix 10 |uL ，
c腿模板 1.5 iaL ，
2x引物(A5/P3) 0.5 juL ，
ddH20 7. 5 juL 。擴增程序為
94°C， 30 s; 72°C, 2 min (5 94°C, 30 s; 70。C， 30 s; 72。C， 2 min (5 94°C, 30 s; 68°C， 30 s; 72°C, 2 min (25個循環)； 12。C保溫。
取所得擴增產物經ly。瓊脂糖凝膠電泳;險測，結果如圖4所示。
擴增得到的產物為5W^i7基因5'端第二段，通過克隆測序，得到的5'端 第二段序列如SEQ ID NO. 6所述。
克隆測序參照前述中間片段的測序方法，將電泳檢測後的產物經膠回收試 劑盒回收，再將回收的產物克隆到pMD18-T載體上，轉化E. coli DH5 a感受 態細胞，經菌落PCR驗證後，送英駿生物技術公司測序。所得序列在NCBI的 Blastn進行比對分析， -驗證克隆片段是否正確。
實施例5
本實施例為SpTPSl基因開放閱讀框0RF克隆，方法如下 將上述實施例2所得中間片段序列、實施例3所得3'端序列、和實施例4 所得5'端第一段序列和第二段序列進行拼接，得到cDNA全長(作為0RF擴增 的cDNA模板)，通過NCBI裡ORF finder工具分析開放閱讀框，並根據表達載 體的酶切位點的需要"i殳計上遊引物0RF4和下遊引物0RF5如下
0RF 4: 5'-CCCAAGCTT (HindiII)CCTCGAG(Xhol)ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC
-3',
0RF5: 5'-CGC GGATCC (BamHI)ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3'; 以拼4妄得到的cDNA全長作為0RF擴增的cMA才莫^=反，以上遊引物0RF4和 下遊引物0RF5進行PCR擴增
擴增體系為
2 x GC Buffer I (含Mg+) 10 juL ,
2 x引物(ORF4/ORF5 ) 0. 5 ja L ,
cDNA模板 1 juL ,
dNTP Mixture 3. 2 ju L ，
TaKaRa LA Taq 0. 2 ja L ,
19ddH20 4. 6 iaL 。
擴增程序為
94°C, 5 min;
94°C， 30 s; 57°C， 1 min 30 s; 72°C, 2 min (IO個循環)； 94°C， 30 s; 72°C， 2 min 30 s (25個循環)； 72°C, 8 min; 12。C保溫。 取所得擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖5所示。 擴增得到的產物為完整開放閱讀框，即墊狀巻柏的海藻糖-6-磷酸合成酶 基因，通過克隆測序，即得其基因序列，如SEQ ID NO. 1所述；其對應的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
克隆測序參照前述中間片段的測序方法，將電泳;險測後的產物經膠回收試 劑盒回收，再將回收的產物克隆到pMD18-T載體上，轉化E. coli DH5 a感受 態細胞，經菌液PCR—瞼證後，送英駿生物技術^^司測序。所得序列在NCBI的 Blastn進4亍比對分衝斤。序歹'J 表
四川農業大學
—種來源於墊狀巻柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法 6
1 2790 飄
來源於墊狀巻柏(iWag^eZ/a ;w〃/加"yl/ax/yz )的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的 核苷酸序列
1
atgcctactccgtattccaatacgaattcctcaagcgctcccttagtgcctctcaatctc60
astctgccgccttcgttagcgtcttccagagtcgagcgccttgtccgagagcggc獄tg120
aggaggaatgacgaccagcctgaatcggtgcaagaatcgcacgaacaggt3c3agatcat180
acgcaggagcagccggattcacccttgacgccggatcgtcagcagcggctgctcgttgta240
gcgaatcggttgccggtttccgccacgcgc^gggcgacgatcaatggagcttggaagtg300
，gctggcggcctcgtctctgcgcttcttggtgtgaagcagttccaggtagtatggatc360
ggccggcccggtgtctatgtccaggacgagctcggcaagcaatcgcttgccaaggcgctt420
gagg譜agggatttgtgggtgtgttgctagacgagg,cagtggatcaatattacaat480
ggctactgcaacaatgtcttgtggcctctctttcactacaUgg"tgcgtcaagaagac540
cgcctggccgcgactcgaagtcttcaatcacaattcggcgcctacaagcgtgc^acagg600
ctgtttgcagatgccgtcattaaacactac譜g卿gcgatt tcgt Uggacac"gat660
tatcacctcatggtcctgcctagctatctcaaggagcacgacccacg^tg纖gtcgga720
tggttcctgcacactccatttccttcatctg^cactgcctctccgctca780
gaattgcttcagggtgtccttggtgc卿tttggttggtttCC￡LC￡lCgt￡Lcgactatgcc840
aggcattttgUagcgcctgttgggtctggaagggactcccgagggagtg900
21ga8gatcaaggcgtgttgccgcgtttcctgtcgggat柳ttctg謹gg960
tgcatccaggctgttgaaacag"gcagtgaagaagcatatagaagaactcagtgccaga1020
tttgctggccgtaaggtgatgttgggagtggataggcttgatccaattaagggcatacca1080
caaaagctactcgcatttgagaagtttttggagg^aatccacattggcgtga識ggtg1140
attctggtccagattgcggttcccacasgacaagatgtgctggaatatcaaaagctcgca1200
agccaggtgcatga汪atcgtgggtcgcatc ggtcgttacggttctcttacgactgta1260
cccatccaccatctcgaccgttcgatg汪aatttcctgagctctgtgctttgtacaccatt1320
actgatgtgttgcttgtaacatccttacggg"ggtatgaacctcgttagctacgagttt1380
gtcgcctgtcaaaatgaaaagaagggsgctctcgtattaagtgagttcgcsggtgctgca1440
caatcactsggtgcsggctcaattttggtaaacccatggaacattattgaaaccgcta汪t1500
gctattggagaagcacttaacatgcccgaggaagaacgtgaagagcgtcatagacttaac1560
ttcatgcacgttacaccccaUgtgctcaggtctgggcggagacattcaccagtgaattg1620
aatgactcaatactggaggcggagctgcgtactttgcatattcctccacaactgccatca1680
gac雄gtggttactaagttcgccgagtcgaagaatcggctaatgattctgggtttcaat1740
tctgcactaactgcaccagtggaagctccacgtggaagagctcctgaccagattag汪gaa1800
atgaagattcgcctacatccaaacttggaagaagtgttcaatgttctttgcagtg汪tcca1860
agaaccactatagtcattct"gtgggagtgaacgtgctgttttggatgaggcatttgga1920
gagtttg"atgtggUggcagcagagaatgga"gtttcttcgtcacaca固gg，g1980
ccatgcctgagcacctaaacatggattgggtagagagtgt編gttggU2040
tttgattatttctgtgagagaacgcctcgttcgtttgtggaagcccgtggaacttcattg2100
gtgtggaattacaagtatgctttggg，gtacaagcacgggatatgcta2160
cagcatctttgg雄ggaccgatttccaatgcagctgtggatgttgttcaaggtgggagg2220
tctgtagaagttcgccctgttggagtctcaaagggctctgcaattgatcggattcttggg2280
gagattgtacatagcaagcacatggttactcctattgatttcgmtgtgtattggtcat2340
ttcttgagcaaggatga柳tatatacacattctttgagccsigagctcccatttttagag2400
agcggaaattcaagtgcaaaggttctagacaagagattaggttc頃gggatctggcaaa2460
tUggtgg"caaggctcaaatcttatcctccaatgtctcctg織gggtggtgcgcaag2520
attgatgatgagcggctg"tgaagacgctggtagatgggaaggctcgtcagtgcttgat2580
ctcaagggtgaaaattatttctcttgtgctgtggggactatgaagcgttcattagcacga2640tactgtttga attcttctga cgaagtactt acattcttga gctcacttgc tgcggcttca 2700 gaatcttttc ctcaaaagag gagcgattcc tttaagagga atggtggatg gcatagccca 2760 actccaaggg ttgtcgctgt cgataattaa 2790
2 929 PRT
來源於墊狀巻柏(<5re"^7/2e//a /w/W/j^a胞u'邁)的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的 M斷列
2
Met Pro Thr Pro Tyr Ser Asn Thr Asn Ser Ser Ser Ala Pro Leu Val
15 10 15
Pro Leu Asn Leu Asn Leu Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Arg Val Glu
20 25 30
Arg Leu Val Arg Glu Arg Gin Leu Arg Arg Asn Asp Asp Gin Pro Glu
35 40 45
Ser Val Gin Glu Ser His Glu Gin Val Gin Asp His Thr Gin Glu Gin
50 55 60
Pro Asp Ser Pro Leu Thr Pro Asp Arg Gin Gin Arg Ixu Leu Val Val 65 70 75 80
Ala Asn Arg Leu Pro Val Ser Ala Thr Arg Lys Gly Asp Asp Gin Trp
85 90 95
Ser Leu Glu Val Ser Ala Gly Gly Leu Val Ser Ala Leu Leu Gly Val
100 105 110
Lys Gin Phe Gin Val Val Trp lie Gly Arg Pro Gly Val Tyr Val Gin
115 120 125
Asp Glu Leu Gly Lys Gin Ser Leu Ala Lys Ala Leu Glu Glu Lys Gly
23130
Phe Val Gly Val Leu 145
Gly Tyr Cys
135
Leu Asp Glu Glu Thr 150
Val Leu Trp Pro
140 Asp
Gin
Asn Asn 165
Arg Gin Glu Asp Arg Leu Ala Ala 180
Lys Arg Ala Asn
Val 155
Phe His Tyr
Gly Ala Ty] 195
Gin Glu Gly Asp
Leu 170
Thr Arg Ser Leu Gin 185
Leu Phe Ala Asp
His
Ty
210
Val Leu Pro Ser Tyr 225
Trp Phe Leu His
Arg 200
Phe Val Trp Thr His 215
Lys Glu His Asp
Tyr Tyr Asn 160
lie Gly Leu 175
Ser Gin Phe 190
Ala Val lie Lys 205
Tyr His Leu Met
Leu 230
Pro Phe Pro Ser
Asp 220
Arg Met Lys
Thr 245
Pro Leu Arg Ser Glu Leu Leu Gin 260
Thr Tyr Asp Ty
Gly Phe His 275
Leu Gly Leu Glu
Pro 235
Ser Glu lie Tyr Arg 250
Gly Val Leu Gly Ala 265
Arg His Phe Val
Arg
lie 290
lie Thr Arg Val
Lys 305
Cys lie Gin Ala
Ala 280
Gly Thr Pro Glu Gly 295
Ala Phe Pro Val
Val Gly 240 Thr Leu 255
Asp Leu Val 270
Ser Ala Cys Thr 285
Glu Asp Gin Gly
Ala 310
Val Glu Thr Asp Ala 325
Phe Ala Gly Arg
Val 300
lie Asp Ser
Leu Ser Ala Arg 340
Leu Asp Pro lie Lys Gly lie 355
Gly 315
Val Lys Lys His lie 330
Val Met Leu Gly
Pro 360
Lys 345
Gin Lys Leu Leu
24
Ala 365
Glu Arg 320 Glu Glu 335
Val Asp Arg 350
Phe Glu LysAsn Pro His Trp Arg Asp Lys Val lie Leu Val Gin 375
Phe Leu Glu Glu 370
lie Ala Val Pro Thr Arg Gin Asp Val 385
Ser Gin Val His
Val 380
Tyr Gin Lys
Thr Arg Gin Asp Val Leu Glu 390 395 Glu lie Val Gly Arg lie Asn Gly Arg Tyr 405 410 Pro lie His His Leu Asp Arg
Ser
Cys Ala Leu Tyr Thr lie 435 440
Asp Gly Met Asn Leu Val Ser Tyr Glu Phe Val Ala Cys Gin
Met Lys 430 Leu Val 445
Leu Ala 400 Gly Ser 415
Phe Pro
Leu Thr Thr Val Pro lie His His Leu 420 425 Glu Leu Cys Ala Leu Tyr Thr lie Thr Asp Val Leu Leu Val Thr Ser
Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ser Tyr Glu Phe 450 455 460
Asn Glu Lys Lys Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Ala Gly 465 470 475
Gin Ser Leu Gly Ala Gly Ser lie Leu Val Asn Pro Trp Asn
Ala 485
Glu Thr Ala Asn Ala lie Gly Glu 500
Arg Glu Glu Arg His Arg Leu
Val 490
Ala Leu Asn Met Pro 505
Phe Met His Val
Glu Arg His Arg Leu Asn 515 520 Val Trp Ala Glu Thr Phe Thr Ser Glu
Ala Gin 530
Leu Glu Ala Glu Leu Arg 545 550 Asp Lys Val Val Thr Lys
Thr 535
Thr Leu His lie
Ala Ala 480 lie lie 495
Glu Glu Glu 510
Thr Pro His Ser 525
Asn Asp Ser lie
Leu 540
Pro Gin Leu
Pro
555
Phe Ala Glu Ser Lys Asn Arg Leu
Thr Lys Phe Ala Glu Ser 565 570 Leu Gly Phe Asn Ser Ala Leu Thr Ala Pro Val Glu Ala
Asn Ser Ala Leu Thr Ala 580 585 Arg Ala Pro Asp Gin lie Arg Glu Met
Pro Ser 560 Met lie 575
Arg Gly
Lys
25
Pro 590
lie Arg Leu His Pro Asn595
Uu Glu Glu Val Phe Asn 610
Val lie Leu Ser Gly Ser 625 630 Glu Phe Asp Met Trp Leu 645
Trp Met
Thr Gin Gly Glu 660
Trp Val Glu Ser 675
600 605 Val Leu Cys Ser Asp Pro Arg Thr 615 620 Glu Arg Ala Val Leu Asp Glu Ala 635
Ala Ala Glu Asn Gly Met Phe Leu 650
Pro Glu His
Thr
Leu Asn 670
Thr lie
Phe Gly 640 Arg His 655
Met Asp
Pro Arg Ser Phe Val Glu 690
Lys Tyr Ala Asp Val 705
Gin His Leu Trp
Thr Met 665
Val Gin Leu Val Phe Asp Tyr Phe Cys Glu Arg Thr 680
Arg Gly Thr Ser
Ala 695
Phe Gly Arg Val
Cys 685
Val Trp Asn Tyr
Thr 725
Gin Gly Gly Arg Ser Val Glu 740
Ser Ala lie Asp Arg lie Leu 755
Pro lie Asp Phe
Glu 710
Gly Pro lie Ser
Leu 700
Gin Ala Arg Asp Met Leu 715 720 Asn Ala Ala Val Asp Val Val 730 735 Pro Val Gly Val Ser Lys Gly
Val Thr 770
Asp Glu Asp lie Tyr 785
Ser Gly Asn Ser
Val Arg 745
Gly Glu lie Val His 760
Met Cys lie Gly
Val 775
Thr Phe Phe Glu Pro 790
Ala Lys Val Leu
Gly Ser Gly Lys 820
Ser 805
Leu Gly Gly
His 780
Glu Uu Pro Phe 795
Lys Arg Leu Gly
Ser 750
Ser Lys His Met 765
Phe Leu Ser Lys
Ser Arg 825
Asp 810
Leu Lys Ser Tyr 26
Pro 830
Leu Glu 800 Ser Lys 815
Pro MetSer Pro Asp Arg Val Val Arg Lys lie Asp Asp Glu Arg Leu lie Glu
835 840 845
Asp Ala Gly Arg Trp Glu Gly Ser Ser Val Leu Asp Leu Lys Gly Glu
850 855 860
Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val Gly Thr Met Lys Arg Ser Leu /Via Arg 865 870 875 880
Tyr Cys Leu Asn Ser Ser Asp Glu Val Leu Thr Phe Leu Ser Ser Leu
885 890 895
Ala Ala Ala Ser Glu Ser Phe Pro Gin Lys Arg Ser Asp Ser Phe Lys
900 905 910
Arg Asn Gly Gly Trp His Ser Pro Thr Pro Arg Val Val Ala Val Asp 915 920 925
Asn
3 979 DM
來源於墊狀巻柏(Se"^'/2e"a p〃/w'朋^ 的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的
中間片段核苦酸序列
3
Uggtcgtaaggttatgttgggagtggataggcttgatccaattaagggcataccaca^60
agctactcgcatttgagaaatttttggaggaaaatccacattggcgtgac120
t tgtcc柳ttgcggttcccacaagacaag"gtgctggaatatcaaa3gctcgcaagcc180
柳tgcatgagatcgtgggtcgc"caacggtcgttacggttctcttacgactgtaccca240
tccaccatctcgaccgttcgatgaaatttcUgagctctgtgctttgtacgccattactg300
atgtgttgcttgtaacatccttacgggatggtatga汪cctcgttagttacgaatttgtcg360cctgtcaaaatgaaaagaagggagctctcgtattaagtgagttcgcaggtgctgcacaat420
cacUggtgcaggctcaattctggtaaacccatggaacatt"tgaaaccgctaatgcta480
ttggag卿cacttaacatgcccgagga3gaacgtgaagaacgtcatagacttaacttca540
tgcacgtUcaactcatagtgctcaggtctgggcggagacattcaccagtgaattgaatg600
actcaatattggaggcggagctgcgtactttgcatattcctccacaactgccatcagaga660
^gcggttsctaagtttgccgagtcga柳atcggctaatgattctgggtttcaattctg720
cactaeictgcaccagtggaagctccacgtggaagagctcctgaccagattagagaaatga780
agattcgcctttgaaagaagtgttcaatgttctttgcagtgatccasgaa840
ccactatagtcattcttagtgggagtgaacgtgctgUttggatgaggcatttggagagt900
ttgatatgtggttggcagcag，atggaatgttccttcgtcacacacaaggagagtgga960
tgacaacaatgcccgaac3979
4 1255 DNA
來源於墊狀巻柏(Se7ag/z7e7/a /w/w'朋^船W邁)的海藻糖-6-石粦酸合成酶基因的3 端核苷酸序列
4
tgcc"c柳g咖gcggttactaagttcgccgagtcgaaga"cggcta"gattctgg60
gtttcaattctgcactaactgcaccagtggaagctccacgtggaagagctcctgaccaga120
ttag柳aatgaagattcgcctacatccaaacttggaagaagtgttcaatgttctttgca180
gtgatccaagaaccactatagtcattcttagtgggagtgaacgtgctgttttggatgagg240
catttggagagtttgatatgtggttggcagcagagaatggaatgtttcttcgtc3cacac300
aaggagagtggatgacfiaccatgcctgagcacctaaacatggattgggtagagagtgtac360
agttggUtttgattatttctgtgagagaacgcctcgttcgtttgtggaagcccgtgaaa420
cttcattggtgtgga"tacaagt"gcagatgtggaattcaagcacggg480
atatgctacagcatctttggacaggaccgatttccaatgcagctgtggatgttgttcaag540
28gtgggaggtctgtag汪agttcgccctgttggagtctcaaagggctctgcaattgategga600
ttcttggggagattgtacat3gca3gcacatggttactcctattgatttcgttatgtgta660
UggtcaUtcttgagcaaggatgaagatatatacacattetttgagecagagctcccat720
ttt Ugagagcggaaatteaagtgc纖ggttctagacaagagatUggttccaagggat780
ctggcaaattaggctcaaatcttatcctccaatgtctcctg織gggtgg840
tgcgcaagattgatgatgageggctgattgaagacgctgg"gatgggaaggctcgtcag900
tgcttgatct固gggtgaaa"tatttctcttgtgctgtggggactatgaagcgttcat960
tagcacgatactgtttgaattcttctgacgaagtacttacatttttgagctcacUgctg1020
cggcttcagaatcttttcctcaaaagaggagegattcetttaagaggaatggtggatggc1080
由gcccaactccaagggttgtcgctgtcgataattsaaagaaaggaa汪ggcgtggtacg1140
cttgtggctgaacaccaaga€Lg€lC￡L￡L￡Lggtacacctaaatgtgtaatgtgtgcttattta1200
ttcttttattcga^3gasgtgUc" teagttgagctaaaaaaa1255
5 1045 DM
來源於墊狀巻柏(5Wa^r'/ e7/a puh/朋/^船x/'歷)的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的5 端第一段核脊酸序列
5
"cggatggcctggtgtctatgtccaggacgagcteggeaageaatcgettgcggcg60
cttgaggaaaaggg"ttgtgggtgtgttgctagacgaggaaacagtggatcaatattac120
aatggctactgcaacaatgtcttgtggcctctctttcactacattggattgcgtcaagaa180
gaccgcctggccgcgactcgaagtcttcaatcacaatteggcgcctacaagcgtgcaaac240
aggctgtttgcagatgccgtcat Uaacactaccaagaaggcgatttcgtt tggsMcat300
gattatcacctcatggtcctgectagctatctcaaggagcacgacccacga"ga3agtc360
ggatggttcctgcacactccatttccttcatctgaaatatatagaacactgcctctccgc420
tcagaattgcttcagggtgtccttggtgcag"ttggttggtttccacacgtacgactat480gccaggcattttgttagcgcctgtacaaggatattgggtctggaagggactcccgaggga540
gtggaagatcaagggaaaataacgcgtgttgccgcgtttcctgtcgggatagattctgaa600
sggtgcatccaggctgttgaaacagatgcagtgaagaagcatatagaagaactcagtgcc660
agatttgctggccgtaaggtgatgttgggagtggataggcttgatccaattaagggcata720
ccacsaaagctactcgcatttgagaagtttttggaggaaaatccacattggcgtgacaag780
gtgattctggtccagattgcggttcccacaagacaagatgtgctggaatatcaaaagctc謂
gcaagccaggtgcatgaaatcgtgggtcgcatcaacggtcgttacggttctcttacgact900
gtacccatccaccatctcgaccgttcgatgaaatttcctgagctctgtgctttgtacgcc960
at UctgatgtgUgcttgtaacatccttacgggatggtatgaacctcgttagctacgag1020
tttgtcgcctgtcaaaatga1045
6 <211〉 575 <212〉腿
來源於墊狀巻柏(Xe/ag/zje/" pw/w'加"他x/zb)的海藻糖-6-石粦酸合成酶基因的5 端第二段核苦酸序列
<400〉 6
agcagtggtatcaacgcagagtacgcggggatatatgagttttattttagcaaactataa60
aggtttgcctctctccacttacctagtaagtgg"ggtttcccgtgtgttcgtctgccgt120
cttcacatgcctactccgtattccaatacgaaUcctcaagcgctccctt;igtgcctctc180
3atctcaatctgccgccttcgttagcgtcttccagagtcgagcgccttgtccgagagcgg240
caactgaggagga"gacgaccagcctgaatcggtgcaagaatcgcacgaacaggtacaa300
gatcatacgcaggagcagccggattcatccttggcgccggatcgtcagcagcggctgctc360
gttgtagcgaatcggttgccggtttccgcc3CgCg固gggcgacgatcaatggagcttg420
gaagtgagcgctggcggcctcgtctctgcgcttcttggtgtgaagcagttccaggtagta480
tggatcggctggcccggtgtctatgtccaggacgagctcggcaagcaatcgcttgccaag540
gcgcttgaggaaaagggatttgtgggtgtgttgca575
30
權利要求
1、一種來源於墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，該序列具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
2、 根據權利要求1所述的序列，其特徵在於所述的核苦酸序列對應的 胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
3、 一種權利要求1所述的來源於墊狀巻柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序 列的克隆方法，包括下述主要步驟(1) 總RNA的提取和純化採用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物墊狀巻柏葉片中提取得 到純化的墊狀巻柏葉片總RNA;(2) 中間片段的克隆A、 中間片段cDNA第一鏈的合成以上述步驟(1)純化的墊狀巻柏葉片總RNA作為才莫板，以oligod (T) 18: 5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3'為反轉錄引物，進行 cDNA第一鏈合成，得到的cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的cDM模板；B、 PCR擴增以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為cDNA模板，利用下述上遊 引物jfl和下遊引物jxl，進行PCR擴增 j f1: 5'-TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG-3'， jxl: 5'-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3';擴增得到墊狀巻柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中間片段，通過克隆 測序，得到中間片段序列；(3) 3'端的克隆以前述步驟(2) A中得到的cDNA第一《連為4莫板，利用下述上遊引物Sl 和下遊引物AP2進行PCR擴增Sl:5'-GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3', AP2: 5'-TACGTACGGCATG ACAGTG-3'; 擴增得到完整的3'端，通過克隆測序，得到3'端序列；(4)、 5'端的克隆C、 合成5'端的cDNA第一鏈以上述步驟(1)純化的墊狀巻柏葉片總RNA作為模板，以下述下遊引物 jxl和上遊引物SMARTIIA Oligo為反轉錄引物，進行反轉錄 jxl: 5'_ TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3',SMART11A 01i go: 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG- 3'; 合成得到反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈；D、 第一段PCR擴增以前述步驟C所得反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈為cDNA才莫板，利用下述 下遊引物A2和同源上遊引物CI,進行5'端第一段PCR擴增 A2: 5'-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3'， CI: 5'-ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3';擴增得到的產物為cDNA5'端第一段，通過克隆測序，得到5'端第一段的序列；E、 第二段PCR擴增以前述步驟C所得反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈為cDNA模板，利用下述 下遊引物A5和上遊引物P3,進行5'端第二段PCR擴增； A5: 5'-GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3'， P3: 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';擴增得到的產物為cDNA5'端第二段，通過克隆測序，得到5'端第二段序列；(5 ) 0RF的克隆和拼接將上述步驟(2 )所得中間片段序列、步驟(3 )所得3'端序列、和步驟(4 ) 所得5'端第一段序列和第二段序列進行拼接，得到的cDNA全長作為0RF擴增 的c廳模板；以下述上遊引物0RF4和下遊引物0RF5進行PCR擴增0RF 4: 5'-CCCAAGCTT(Hindi11)CCTCGAG (Xhol)ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC-3'，0RF5: 5'-CGC GGATCC (BamHI)ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3';擴增得到的產物為完整開放閱讀框，即墊狀巻柏的海藻糖-6-磷酸合成酶 基因，通過克隆測序，即得其基因序列。
4、 根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(1)中， 採用的RNA提取方法為Tr izol法；純化方法為DM酶消化法。
5、 根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(2)中進 行PCR擴增時，擴增體系為TaqPlusPCR Master Mix 10 jjL ，c腿模板 1 ML ,2x引物jxl/jfl 0.5 iaL ，ddH20 8 yL ;擴增程序為94°C， 5min;94 。C， 30 s, 55 。C， 45 s， 72°C， 1 min 30 s; 30個循環； 72 。C， 8 min; 4。C保溫。
6、 根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(3)中進 行PCR擴增時，擴增體系為TaqPlusPCR Master Mix 10 jaL , cDNA模板 2 (iL ,2 x引物S1/AP2 0. 5 jn L ，d歸 7 jLi ;擴增程序為94°C, 3 min;94°C, 30 s; 55°C， 45 s; 72°C, 1 min 30 s; 33個循環； 72。C, 8 min; 12。C保溫。
7、 根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(4)中進 行第一段PCR擴增時，擴增體系可優選為TaqPlusPCR Master Mix 12 juL ,c腿模板 2 juL ，2x引物A2/C1 0.5 ju L ，ddH20 5 juL ; 擴增程序可優選為 94°C， 3 min;94°C， 30 s; 65°C， 45 s; 72°C， 1 min 30 s ; 2個循環； 每兩個循環遞減2°C;94°C， 30 s; 55°C， 45 s; 72°C, 1 min 30 s ; 25個循環； 72°C， 8 min; 12。C保溫。
8、 根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(4)中進 行第二段PCR擴增時，擴增體系為TaqPlusPCR Master Mix 10 juL ,c腿模板 1.5 juL ,2 x引物A5/P3 0. 5 nL ,ddH20 7. 5 jaL ;擴增程序為94°C, 30 s; 72°C, 2 min; 5個循環；94°C, 30 s; 70°C, 30 s; 72°C， 2 min ; 5個循環；94°C， 30 s; 68°C， 30 s; 72°C， 2 min ; 25個循環；12。C保溫。
9、 根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(5)中進 行PCR擴增時，擴增體系為formula see original document page 0TaKaRa LA Taq ddH20 擴增程序為94。C， 5 min;94°C， 30 s; 57°C, 1 min 30 s 94°C， 30 s; 72°C, 2 min 30 s 72°C， 8 min; 12。C保溫。0. 2 juL ， 4.6 jaL ;72°C, 2 min ; 10個循環; 25個循環；
全文摘要
本發明公開了一種來源於墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，該序列具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。該序列是一種新的TPS基因序列，使人們對TPS基因的研究對象從大腸桿菌和真菌等微生物及少數有限的植物體進一步擴展到墊狀卷柏等多種植物體。並且，根據該TPS基因在墊狀卷柏植物體內催化合成的海藻糖所表現出的優良的抗旱、耐鹽等性能可以預料如果將其通過轉基因技術導入玉米等其他植物的基因中，將可培育出具有相應的優良的抗旱、耐鹽等性能的植物新品種。本發明還公開了一種上述來源於墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列的克隆方法。
文檔編號C12P19/34GK101586107SQ20091005993
公開日2009年11月25日 申請日期2009年7月8日 優先權日2009年7月8日
發明者付鳳玲, 李晚忱, 荊 林, 禹 牟, 偉 蔣 申請人:四川農業大學