心磷脂組合物及它們製備的方法和應用的製作方法

2023-07-19 22:20:36 2

專利名稱：心磷脂組合物及它們製備的方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的心磷脂組合物，製備它們的方法和包含它們的脂質體組合物。本發明還涉及含有活性劑的脂質體製劑或複合物或乳劑，和它們在診斷測定和治療人和動物疾病中的應用。
背景技術：
脂質體製劑具有增加疏水性藥物在水溶液中的溶解度的能力。它們經常降低與藥物治療相關的副作用並且它們為開發活性劑的新製劑提供靈活的工具。
脂質體通常從天然磷脂如磷脂醯膽鹼，磷脂醯乙醇胺，磷脂醯絲氨酸，磷脂醯甘油，磷脂酸，和磷脂醯肌醇製備。可以加入陰離子磷脂，如磷脂醯甘油和心磷脂以產生提供膠體穩定性的淨負表面電荷。這些成分通常從天然來源中純化，有時它們可以化學合成。
心磷脂(也稱為雙磷脂醯甘油)，構成一類複雜的陰離子磷脂，其典型地從與高代謝活性相關的組織，包括心肌和骨骼肌的線粒體的細胞膜中純化。然而，已知的色譜純化技術不能將心磷脂解析為分離的分子種類。因此，含有該成分的藥物製劑是不均一的。
通過化學合成可以獲得均質的四肉豆蔻醯心磷脂。然而，該化合物的可獲量有限，目前太貴而不能常規用於藥物製劑。其它均質心磷脂種類含有限定的疏水性醯基，如脂肪酸，不能商購或僅可獲得少量並且成本昂貴。
心磷脂的有限可獲量部分是由於合成它的方法繁瑣，費時且昂貴的事實。通常，它們包含從取代甘油的不同衍生物開始逐步構建分子的單個部分和多步中間體純化。已知的合成方法主要分成兩組(a)使用磷酸化劑將2-O-保護的甘油的伯羥基與1，2-O-二醯基-sn-甘油偶聯和(b)在2，4，6-三異丙基苯磺醯氯(TPS)和吡啶的存在下2-O-保護的甘油的伯羥基和磷脂酸縮合。
Ramirez等(Synthesis，769-770(1976)；Tetrahedron，33599-608(1977))描述一種心磷脂的合成方法，其中在三乙胺的存在下用二(1，2-二甲基亞乙烯基)焦磷酸鹽磷酸化1，2-O-二醯甘油。產物與2-叔丁基二甲基甲矽烷基氯甘油在胺催化劑的存在下反應生成心磷脂的磷酸三酯形式。在溫和鹼性條件下去除丙酮基磷酸酯保護基以獲得磷酸二酯，在溫和酸性條件下去除甲矽烷基。該合成方法進行重要的酯交換反應，其產生除了所需心磷脂以外的多種副產物。
Duralski等(Tetrahedron Lett.，391607-1610(1998))描述通過與4，4』-二甲氧基三苯甲基氯反應保護甘油的伯羥基。然後通過與與叔丁基二甲基甲矽烷基氯反應保護2-羥基，通過用對甲苯磺酸處理去除三苯甲基。使用雙官能磷酸化劑2-氯苯基偶磷二-(1，2，4-三唑胺(triazolide))磷酸化二醯甘油的伯羥基，該雙官能磷酸化劑由含有1，2，4-三唑和2-氯苯基磷酸二氯化物的混合物在三乙胺的存在下原位產生，並使與甲矽烷基化的甘油在2，4，6-三異丙基磺醯氯和N-甲基咪唑的存在下反應。通過用2-硝基苯甲醛肟和N，N，N，N-四甲基胍處理將完全保護的心磷脂脫保護，通過用乙酸處理去除甲矽烷基。
Saunders和Schwarz(J.Am.Chem.Soc.，883844-3847(1966))描述通過用氯氧化磷磷酸化2，3-二-O-硬脂醯-D-甘油，加入2-O-苄基甘油和通過催化加氫去除苄基來製備心磷脂。通過矽酸色譜法純化產物。該方法後來為研究者所置疑(Ramirez等，Tetrahedron，33599-608(1977))，不能使用它來成功地獲得心磷脂。
Mishina等(Bioorg.Khim.，11992-994(1985)；Bioorg.Khim.，131110-1115(1987))使用油酸咪唑來醯化sn-甘油-3-膽鹼磷酸，其然後用甘藍磷脂酶D裂解以獲得1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸。該化合物在含有2，4，6-三異丙基苯磺醯氯的吡啶中與2-O-叔丁基二甲基甲矽烷基甘油縮合，產生保護的心磷脂，其通過標準方法脫保護而生成心磷脂。
Stepanov等(Zh.Org.Khim，20985-988(1984))描述使用縮合劑2，4，6-三異丙基苯磺醯氯，二醯基磷脂酸與2-O-苄基甘油縮合。
Keana等(J.Org.Chem.，512297-2299(1986))描述在吡啶中使用2，4，6-三異丙基苯磺醯氯，磷脂醯甘油(PG)甲酯與磷脂酸(PA)的偶聯。用重氮甲烷甲基化偶聯產物的一甲基酯，產生心磷脂的二甲酯，其進行NaI脫甲基化以獲得心磷脂。
也已經通過二醯甘油磷酸苄酯的銀鹽與1，3-二碘丙醇苄醚或1，3-二碘丙醇叔丁醚反應產生心磷脂。例如，De Haas和van Deenen(Biochim.Biophys.Acta，116114-124(1966))使用多步順序來獲得心磷脂，總產率為26％。摩爾比為2∶1的苄基二醯-L-α-甘油磷酸銀和2-叔丁氧基-1，3-二碘甘油之間的反應產生三酯，將其純化和脫保護以產生心磷脂。立即用碘化鋇處理從三酯上去除苄基保護基，通過用氯仿中的無水HCl處理去除叔丁基醚基團。類似地，Inoue等(Chem.Pharm.Bull.，111150-1156(1963))描述製備心磷脂的1，3-丙二醇類似物的方法，其中通過1，3-二碘丙烷和苄基二醯-L-α-甘油磷酸銀反應製備磷酸二酯鍵，用碘化鈉去除苄基保護基。儘管這些稍後的方案適於製備小量心磷脂，對於常規大量製備無吸引力，因為包括許多步驟，要求小心純化中間體和使用高度光敏的銀鹽中間體和不穩定的碘中間體。
需要可以用於以更節省成本的方式製備大量多樣和均質的心磷脂種類的新合成方法。這些方法將增加廣泛多樣的均質心磷脂種類的可獲量，和將使開發活性劑的新脂類製劑可用的脂類多樣化，其將具有比目前可能的更確定的組成。
本發明提供這些方法和組合物。本發明的這些和其它優點以及另外的發明特徵將從本文提供的發明描述中變得明顯。

發明內容
發明簡述本發明提供新的心磷脂分子和類似物及新的心磷脂合成途徑，該心磷脂具有不同鏈長和飽和/不飽和的不同脂肪酸和/或烷基鏈。反應路線可以用於產生新形式的心磷脂，包括心磷脂變體。通過本發明方法製備的心磷脂可以便利地整合到脂質體、乳劑或複合物(例如藥物複合物)中，該脂質體、乳劑或複合物也可以包括(例如與脂質體複合或包埋在脂質體中)活性劑如基因和基因載體，反義分子(例如寡核苷酸)，蛋白質和肽，蛋白質或化學藥物(例如疏水性或親水性藥物)或診斷劑。這些脂質體和其它製劑也可以用於治療疾病或診斷和/或分析測定。


圖1顯示心磷脂的通用結構。
圖2顯示心磷脂的一種合成方案。
圖3顯示心磷脂的一種備選合成方案。
圖4顯示心磷脂醚類似物的一種備選合成方案。
圖5顯示心磷脂的一種備選合成方案。
圖6顯示心磷脂的一種備選合成方案。
圖7顯示心磷脂的一種備選合成方案。
圖8顯示心磷脂的一種備選合成方案。
發明詳述本發明提供心磷脂分子(包括其類似物或衍生物)。在一個實施方案中，心磷脂分子具有按照下列通式的結構 其中Z1和Z2相同或不同並且是-O-C(O)-，-O-，-S-，-NH-C(O)-等；R1和R2相同或不同並且可以是H，或飽和或不飽和烷基；R3為(CH2)n且n＝0-10；R4為氫，烷基，取代烷基，環烷基，取代的環烷基，肽，二肽，多肽，蛋白質，糖類如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖等，雜環，核苷，多核苷酸等；X為陽離子，最優選非毒性陽離子如氫，銨，鈉，鉀，鈣，鋇離子等。
在優選實施方案中，心磷脂類似物可以具有式II或式III
本發明還提供包含心磷脂類似物的組合物，所述類似物具有按照下列同時的結構 其中Z1和Z2相同或不同並且是-O-C(O)-，-O-，-S-，-NH-C(O)-等；R1和R2相同或不同並且是H，或飽和或不飽和烷基；R3為(CH2)n且n＝0-10；R4為氫，烷基，取代烷基，環烷基，取代的環烷基，肽，二肽，多肽，蛋白質，糖類如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖等，雜環，核苷，多核苷酸等；R5為接頭，其可以包含烷基，取代烷基，環烷基，取代環烷基，烷氧基，聚烷氧基如PEG化的含有約1至約500個烷氧基單體單元的醚(可以具有至少約10個烷氧基單體單元，如至少約50個烷氧基單體單元或至少約100個烷氧基單體單元，如至少約200個烷氧基單體單元或至少約300個烷氧基單體單元或至少約400個烷氧基單體單元)，取代的聚烷氧基等，肽，二肽，多肽，蛋白質，糖類如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖等；
X為陽離子，最優選非毒性陽離子如氫，銨，鈉，鉀，鈣，鋇離子等。
在最優選的實施方案中，Z1和Z2為-O-C(O)-，R1和R2相同並且是C4至C34的飽和和/或不飽和烷基，更優選含有14-24個碳原子(如約16-約20個碳原子)。術語「烷基」包含飽和或不飽和直鏈和支鏈烴基部分。術語「取代烷基」包含另外攜帶一個或多個取代基的烷基，所述取代基選自羥基，烷氧基(或低級烷基)，巰基(低級烷基)，環烷基，取代的環烷基，滷素，氰基，硝基，氨基，醯氨基，亞氨基，硫代，-C(O)H，醯基，氧醯基，羧基等。R3最優選為CH2。R4優選為氫。X最優選為氫或銨離子，其給出如圖1所示的心磷脂的通用結構。
可以通過任何期望方法製備心磷脂分子和類似物。本發明提供的一種製備心磷脂分子或其類似物的優選方法包括，在偶聯劑N，N』-二環己基碳二亞胺或N，N』-羰二咪唑的存在下將磷脂酸和2-O-保護的甘油反應。本發明另一優選實施方案是一種生產心磷脂或其類似物的方法，其包含在偶聯劑的存在下將磷脂酸和甘油反應，所述偶聯劑為三異丙基苯磺醯氯，或N，N』-二環己基碳二亞胺或N，N』-羰二咪唑。
本發明的一個實施方案提供製備心磷脂及其類似物如本發明的化合物的一種適當方法，包括將式V的醇 (其中Z1，Z2，R1，R2和R3定義如上)和2-O-保護的甘油或2-O-取代的甘油在偶聯劑存在下反應，所述偶聯劑為二氯磷酸酯或N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯。該方法特別適合於製備式I，II，和III的心磷脂。本發明方法的另一實施方案特別適合於製備式II的心磷脂，包括在偶聯劑的存在下將1，2-O-二醯甘油和2-O-保護的甘油反應，所述偶聯劑為二氯磷酸酯或N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯(phosphonamidic chloride)。本發明另一實施方案特別優選用於製備式III的心磷脂醚類似物，包括在偶聯劑的存在下將1，2-O-二烷基甘油和2-O-保護的甘油反應，所述偶聯劑為二氯磷酸酯或N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯。
本發明的一個實施方案提供合成心磷脂分子及其類似物的另一種方法，包括將式V(以上)的醇和式VI的二醇 (其中R4和R5定義如上)在偶聯劑的存在下反應，所述偶聯劑是二氯磷酸酯或N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯。該方法特別適合於生產按照式IV的分子。
用於本發明合成方法的優選偶聯劑是式VII的二氯磷酸酯 其中W是烷基或取代烷基，包括甲基，乙基，異丙基，叔丁基，烯丙基，2-取代的乙基，滷代乙基如2，2，2-三溴乙基；苄基或取代的苄基；苯基或取代的苯基如2-氯苯基，4-氯苯基和2，4-二氯苯基；或其它任何可去除的保護基。用於本發明合成方法中的另一種優選偶聯劑是N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯。
本發明的一個實施方案在圖2中闡明，該圖描述一種合成心磷脂的新方法。在該方法中，磷酸化劑，o-氯苯基二氯磷酸酯(CPDCP)3，與1，2-O-二醯甘油1和2-O-保護的甘油2(Y為羥基保護基，優選苄基等，或甲矽烷基保護基，例如叔丁基二甲基甲矽烷基等)在惰性溶劑(例如二氯甲烷等)中在鹼(例如吡啶等)的存在下反應，以提供心磷脂前體4。o-氯苯基的去除可以通過4和2-吡啶醛肟(PAO)和1，1，3，3-四甲基胍(TMG)反應，接著用氫氧化銨水溶液處理完成，以提供心磷脂前體5的銨鹽。除了2-吡啶醛肟(PAO)以外，其它試劑如2-硝基苯並醛肟在TMG的存在下可以用於去除o-氯苯基。
通過取決於保護基性質的方法可以完成脫保護，產生心磷脂6。例如，通過在鈀催化劑的存在下氫化可以去除苄基。在酸性條件下可以將叔丁基二甲基甲矽烷基(TBDMS)脫保護。通過用2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)處理可以將對甲氧苄基(PMB)脫保護。
本文所用的術語「羥基保護基」是指用於保護羥基在合成步驟期間中免於不希望有的反應的基團。常規使用的羥基保護基在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Svnthesis，第3版，John Wiley Sons，紐約(1999)中公開。這些羥基保護基包括甲基醚；取代的甲基醚，包括甲氧基甲基，苄氧基甲基，對甲氧基苄氧基甲基，叔丁氧基甲基，2-甲氧基乙氧基甲基，四氫吡喃基，四氫呋喃基醚等；取代的乙基醚，包括1-乙氧基乙基，1-甲基-1-甲氧基乙基，1-甲基-1-苄氧基乙基，烯丙基，叔丁基醚等；苄基醚；取代的苄基醚，包括對甲氧基苄基，3，4-二甲氧基苄基醚等；甲矽烷基醚，包括三甲基甲矽烷基，三乙基甲矽烷基，二甲基異丙基甲矽烷基，二乙基異丙基甲矽烷基，叔丁基二甲基甲矽烷基等；酯類，包括甲酸酯，乙酸酯，氯乙酸酯，二氯乙酸酯，三氯乙酸酯，甲氧基乙酸酯，苯氧基乙酸酯等；和碳酸酯。
上述的本發明是一種簡單，有效的製備心磷脂的方法。合成的關鍵步驟是磷酸化偶聯反應。在該磷酸三酯方法中，將CPDCP用於以直接的方式順序地磷酸化醇而直接提供高產率的中間體磷酸三酯。該方法是構建心磷脂核心結構的一種簡單、節省成本的一罐式(one-pot)方法。
本發明的這種新的二氯磷酸酯偶聯方案優於常規的偶磷二-(1，2，4-三唑胺(triazolide))或偶磷二(羥基苯並三唑)方法(Ramirez等，Synthesis，449-489(1985)；van Boeckel等，Tetrahedron Lett.，213705-3708(1980)；van Boeckel等，Synthesis，399-402(1982))。一方面，偶磷二-(1，2，4-三唑胺)或偶磷二(羥基苯並三唑)需要從相應的二氯磷酸酯製備。在另一方面，偶磷二-(1，2，4-三唑胺)方法在大多數情形中在與第二個醇的縮合反應中，優選使用另外的活化劑如2，4，6-三異丙基苯磺醯基-(3-硝基-1，2，4-三唑)或2，4，6-三異丙基苯磺醯氯。
圖3表示的本發明另一實施方案包括使用新的磷酸化劑氯亞磷醯胺(chlorophosphoramidite)將1，2-二取代甘油與2-保護的甘油偶聯。(儘管N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯7已經用於合成肌醇磷脂(Bruzik等，Tetrahedron Lettt，362415-2418(1995)，它還未用於合成心磷脂)。在本方法中，將氯亞磷醯胺7用於偶聯反應來構建核心結構。在該方案中，1，2-O-二醯甘油1隨後與試劑7在惰性溶劑(例如二氯甲烷等)中在鹼(例如N，N-二異丙基乙胺等)的存在下反應，然後與2-O-保護的甘油2(Y為羥基保護基，優選苄基等)在活化劑如四唑等的存在下反應，接著通過用間-氯過苯甲酸(MCPBA)等氧化以產生保護的心磷脂前體8。通過與NaI反應去除保護的前體8的甲基，以生產心磷脂前體的鈉鹽，其然後通過用稀HCl接著10％氫氧化銨處理轉化為銨鹽5。如上所述可以發生脫保護以產生心磷脂。
圖4所示的本發明的另一實施方案生產心磷脂的醚類似物，其中烷基替代心磷脂甘油側鏈的醯基。按照該方案，1，2-O-二烷基-sn-甘油9反應與2-O-保護的甘油2在氯亞磷醯胺7的存在下偶聯，提供中間體10。通過類似於圖3所述的步驟，該中間體10在2-丁酮中用NaI脫甲基化產生保護的心磷脂類似物11，其經脫保護產生心磷脂的醚類似物12。
本發明另一實施方案在圖5中表示。在該方法中，磷脂酸(PA)13與2-O-保護的甘油2(Y是羥基保護基，優選苄基等，或甲矽烷基，例如叔丁基二甲基甲矽烷基等)在惰性溶劑(例如二氯甲烷等)中在縮合劑的存在下反應，接著用氫氧化銨水溶液處理以形成心磷脂前體5，所述縮合劑如N，N』-二環己基碳二亞胺(DCC)，或N，N』-羰二咪唑(CDI)等。如上所述脫保護產生心磷脂6。
本發明另一實施方案在圖6中表示。在該方法中，將不含保護基的甘油14直接用作縮合反應中的反應物。通過在三異丙基苯磺醯氯(TPSCI)和吡啶的存在下與磷脂酸(PA)13縮合發生甘油14的伯醇的選擇性磷酸化，接著用氫氧化銨水溶液處理以產生心磷脂6。其它偶聯劑如DCC，CDI等也可以用於這種心磷脂的一步合成。
本發明另一實施方案在圖7中表示。在該方法中，將二氯磷酸酯15用於偶聯反應中來構建核心結構。在該方案中，1，2-二醯甘油1和2-保護的甘油2與二氯磷酸酯15在鹼如吡啶的存在下反應，產生保護的心磷脂前體8。然後通過與NaI反應去除保護的心磷脂8的甲基，生產心磷脂前體的鈉鹽，其然後通過用稀HCl接著10％氫氧化銨處理轉化為銨鹽5。如上所述可以發生脫保護以產生成熟的心磷脂。
本發明另一實施方案在圖8中表示。在該方法中，產生心磷脂的醚類似物，將二氯磷酸酯15用於偶聯反應以構建核心結構。在該方案中，1，2-二醯基-sn-甘油9和2-保護的甘油2與二氯磷酸酯15反應以產生保護的中間體10。然後通過與NaI反應和用稀HCl接著10％氫氧化銨處理去除中間體10的甲基以生產保護的銨鹽11。如上所述可以發生脫保護以產生成熟的心磷脂。
所述方法可以用於製備多種新的心磷脂種類。例如，該方法可以用於製備含有任何期望脂肪酸鏈作為R1和/或R2取代基的心磷脂及其類似物。優選的脂肪酸碳鏈長度範圍為約C4至約C34，優選約C14至約C24，包括丁酸(C4:0)，戊酸(C5:0)，己酸(C6:0)，庚酸(C7:0)，辛酸(C8:0)，壬酸(C9:0)，癸酸(C10:0)，十一烷酸(C11:0)，十二烷酸(C12:0)，十三烷酸(13:0)，十四烷酸(C14:0)，十五烷酸(C15:0)，棕櫚酸(C14:0)，十七烷酸(C17:0)，硬脂酸(C18:0)，十九烷酸(C19:0)，花生酸(C20:0)，二十一烷酸(C21:0)，二十二烷酸(C22:0)，二十三烷酸(C23:0)，二十四烷酸(C24:0)，10-十一烷酸(C11:1)，11-十二烷酸(C12:1)，12-十三碳烯酸(C13:1)，肉豆蔻腦酸(C14:1)，10-十五碳烯酸(C15:1)，棕櫚油酸(C16:1)，油酸(C18:1)，亞油酸(C18:2)，亞麻酸(C18:3)，二十碳二烯酸(C20:2)，二十碳三烯酸(C20:3)，花生四烯酸(順-5，8，11，14-二十碳四烯酸)，和順-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸等等。對於醚類似物，烷基鏈的碳鏈長度範圍也為約C4至約C34，優選約C14至約C24。其它脂肪酸鏈也可以用作R1和/或R2取代基。其實例包括飽和脂肪酸如甲酸(或蟻酸)，醋酸(或乙酸)，丙酸(或丙酸)，丁酸(或丁酸)，二十六烷酸(或蠟酸)，二十八烷酸(或褐煤酸)，三十烷酸(或蜂花酸)，三十二烷酸(或紫膠蠟酸)，三十四烷酸(或三十四烷酸)，三十六烷酸(或三十六烷酸)等；單烯不飽和脂肪酸如反-2-丁烯酸(或巴豆酸)，順-2-丁烯酸(或異巴豆酸)，2-己烯酸(或異氫山梨酸)，4-癸酸(或4-十碳烯酸)，9-癸酸(或癸烯酸)，4-十二碳烯酸(或5-十二碳烯酸)，5-十二碳烯酸(或十二碳-5-烯酸)，9-十二碳烯酸(或月桂烯酸)，4-十四碳烯酸(或粗租酸)，5-十四碳烯酸(或抹香鯨酸)，6-十八碳烯酸(或巖芹酸)，反-9-十八碳烯酸(或反油酸)，反-11-十八碳烯酸(或牛痘酸)，9-二十碳烯酸(或鱈肝油酸)，11-二十碳烯酸(或巨頭鯨魚酸)，11-二十二碳烯酸(或鯨蠟烯酸)，13-二十二碳烯酸(或芥酸)，15-二十四碳烯酸(或神經酸)，17-二十六碳烯酸(或西門木烯酸)，21-三十碳烯酸(或三十碳烯酸)等；二烯不飽和脂肪酸如2，4-戊二烯酸(或β-乙烯基丙烯酸)，2，4-己二烯酸(或山梨酸)，2，4-癸二烯酸(或烏桕酸)，2，4-十二碳二烯酸，9，12-十六碳二烯酸，順-9，順-12-十八碳二烯酸(或α-亞油酸)，反-9，反-12-十八碳二烯酸(或反亞油酸)，反-10-反-12-十八碳二烯酸，11，14-二十碳二烯酸，13，16-二十二碳二烯酸，17，20-二十六碳二烯酸等；三烯不飽和脂肪酸，如6，10，14-十六碳三烯酸(或十六碳三烯酸)，7，10，13-十六碳三烯酸，順-6，順-12-十八碳三烯酸(或γ-亞麻酸)，反-8，反-10，順-12-十八碳三烯酸(或α-十八碳三烯酸)，反-8，反-10，反-12-十八碳三烯酸(或β-十八碳三烯酸)，順-8，反-10，順-12-十八碳三烯酸，順-9，順-12，順-15-十八碳三烯酸(或α-亞麻酸)，反-9，反-12，反-15-十八碳三烯酸(或反亞麻酸)，順-9，反-11，反-13-十八碳三烯酸(或α-桐酸)，反-9，反-11，反-13-十八碳三烯酸(或β-桐酸)，順-9，反-11，順-13-十八碳三烯酸(或石榴酸)，反-9，反-11，反-13-十八碳三烯酸，5，8，11-二十碳三烯酸，8，11，14-二十碳三烯酸等；四烯不飽和脂肪酸如4，8，11，14-十六碳四烯酸，6，9，12，15-十六碳四烯酸，4，8，12，15-十八碳四烯酸(或4，8，12，15-十八碳四烯酸)，6，9，12，15-十八碳四烯酸，9，11，13，15-十八碳四烯酸(或α-或β-十八碳四烯酸)，9，12，15，18-十八碳四烯酸，4，8，12，16-二十碳四烯酸，6，10，14，18-二十碳四烯酸，4，7，10，13-二十二碳四烯酸，7，10，13，16-二十二碳四烯酸，8，12，16，19-二十二碳四烯酸等；五和六烯不飽和脂肪酸如4，8，12，15，18-二十碳五烯酸(或二十碳五烯酸)，4，7，10，13，16-二十碳五烯酸，4，8，12，15，19-二十二碳五烯酸(或祭魚酸)，7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸，4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸，4，8，12，15，18，21-二十四碳六烯酸(或二十四碳六烯酸)等；支鏈脂肪酸如3-甲基丁酸(或異戊酸)，d-6-甲基辛酸，8-甲基癸酸，10-甲基十一烷酸(或異月桂酸)，d-10-甲基十二烷酸，11-甲基十二烷酸(或異十一烷酸)，12-甲基十三烷酸(或異肉豆蔻酸)，d-12-甲基十四烷酸，13-甲基十四烷酸(或異十五烷酸)，14-甲基十五烷酸(或異棕櫚酸)，d-14-甲基十六烷酸，15-甲基十六烷酸，10-甲基十七烷酸，16-甲基十七烷酸(或異硬脂酸)，t-D-10-甲基硬脂酸(或結核硬脂酸)，d-16-甲基硬脂酸，18-甲基十九烷酸(或異花生酸)，d-18-甲基花生酸，20-甲基二十一烷酸(或異二十二碳烷酸)，d-20-甲基二十二烷酸，22-甲基二十三烷酸(或異二十四烷酸)，d-22-甲基二十四烷酸，24-甲基二十五烷酸(或異蠟酸)，d-24-甲基二十六烷酸，26-甲基二十七烷酸(或異二十八烷酸)，d-28-甲基三十烷酸，2，4，6-(D)-三甲基二十八烷酸(mycoceranic酸或2，4，6-三甲基硬脂酸)，2-甲基-順-2-丁烯酸(當歸酸)，2-甲基-反-2-丁烯酸(或順芷酸)，4-甲基-3-戊烯酸(或4-甲基-3-戊烯酸)，d-2，4(L)，6(L)-三甲基-反-2-二十四碳烯酸(或C27-結核菌烯酸或黴脂酸)等。
本文所述心磷脂分子和通過本發明方法生產的心磷脂分子可以用於脂類製劑。優選製劑或組合物是包括本發明心磷脂類似物的脂類組合物。包括本發明心磷脂的複合物，乳劑和其它製劑也在本發明的範圍內。按照本發明的這些製劑可以通過任何適當技術製備。除了本發明合成的心磷脂以外，脂類組合物，複合物，乳劑等可以包括其它成分穩定劑，吸收促進劑，抗氧化劑，磷脂，生物可降解聚合物，和藥物活性劑。在一些實施方案中，優選本發明組合物，特別是脂類組合物，還包括靶向劑(targetingagent)，如糖類或蛋白質或其它與特異性底物結合的配體，如抗體(或其片段)或識別細胞受體的配體。這些試劑(如糖或一種或多種選自下組的蛋白質抗體，抗體片段，肽，肽激素，受體配體，如對細胞受體的抗體，及其混合物)的包括可以促進將脂質體導向預定組織或細胞類型。
親油性形成脂質體的成分，如磷脂醯膽鹼，通過上述方法製備的心磷脂，膽甾醇和α-生育酚可以溶解或分散在適當溶劑或溶劑組合中並乾燥。適當的溶劑包括任何非極性或輕微極性溶劑，如叔丁醇，乙醇，甲醇，氯仿，或丙酮，其可以蒸發而不留下藥物不可接受的殘渣。乾燥可以是任何適當方法如凍幹，還優選在凍幹期間使用防凍劑(例如保護性糖如海藻糖)。親水性成分可以溶解在包括水的極性溶劑中。
通過將乾燥的親油性成分與親水性混合物混合可以形成脂質體。可以通過強烈均化混合物的任何方法混合極性溶液和乾燥脂質膜。可以通過渦旋，磁力攪拌和/或超聲進行均化。
脂質體還可以包含活性劑，本發明提供將活性劑保留在脂質體中的方法。該方法包括製備如本文所述的心磷脂或心磷脂類似物，和在脂質體中包括心磷脂或心磷脂類似物及活性劑。活性劑可以與脂類(如本發明的心磷脂)的一部分複合，或活性劑可以包埋在脂質體內。按照該方法，活性劑可以溶解或分散在適當溶劑中並在混合前加入脂質體混合物。典型地親水性活性劑將直接加入極性溶劑，疏水性活性劑將加入用於溶解其它成分的非極性溶劑，但這不是必須。活性劑可以溶解在第三溶劑或溶劑混合物並在均化混合物之前將脂質膜脂質膜加入極性溶劑的混合物。
通常，脂質體可以具有淨中性，負或正電荷。例如，由含有磷脂醯膽鹼，膽甾醇，心磷脂和足夠的硬脂胺以克服心磷脂淨負電荷的溶液可以形成正脂質體。由含有例如磷脂醯膽鹼，膽甾醇，和/或心磷脂的溶液可以形成負脂質體。
包括本發明心磷脂的脂質體還可以在脂質相內包括其它成分。優選的成分包括磷脂醯膽鹼，其選自二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼，二硬脂醯磷脂醯膽鹼，二油醯磷脂醯膽鹼，二棕櫚醯磷脂醯膽鹼，二花生四烯醯磷脂醯膽鹼，卵磷脂醯膽鹼，大豆磷脂醯膽鹼，氫化大豆磷脂醯膽鹼及其混合物。另一優選成分是磷脂醯甘油，其選自二肉豆蔻醯磷脂醯甘油，二硬脂醯磷脂醯甘油，二油醯磷脂醯甘油，二棕櫚醯磷脂醯甘油，二花生四烯醯磷脂醯甘油，及其混合物。脂質體還可以包括甾醇，其選自膽甾醇，聚乙二醇，膽甾醇衍生物，糞甾醇，膽甾烷醇，膽甾烷，膽甾醇半琥珀酸酯，膽甾醇硫酸酯，及其混合物。
取決於具體組合物和用於製備它們的方法，本發明的脂質體可以是多層或單層囊。可以製備脂質體而在所選大小範圍內具有基本上均勻的大小，如約1微米或更小，或約500nm或更小，約200nm或更小，或約100nm或更小。一種有效的分級方法包括將脂質體的水性混懸液擠壓通過一系列具有選擇均勻孔徑的聚碳酸酯膜；膜的孔徑將大致對應於通過擠壓該膜生產的脂質體的最大尺寸。
脂質體可以包被生物可降解聚合物如蔗糖，表氯醇，蔗糖的支鏈親水聚合物，聚乙二醇，聚乙烯醇，甲氧基聚乙二醇，乙氧基聚乙二醇，聚環氧乙烷，聚氧乙烯，聚氧丙烯，醋酸纖維素，海藻酸鈉，N，N-二乙氨基乙酸酯，聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物，聚乙烯吡咯烷酮，聚氧乙烯X-月桂基醚，其中X為9-20，和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯。
抗氧化劑可以包括在本發明的脂質體製劑，複合物，乳劑或其它製劑中。適當的抗氧化劑包括化合物如抗壞血酸，生育酚，和deteroxime甲磺酸鹽。
如果需要，吸收促進劑也可以包括在本發明的脂質體製劑，複合物，乳劑等中。適當的吸收促進劑包括Na-水楊酸-鵝脫氧膽酸，Na-脫氧膽酸，聚氧乙烯9-月桂基醚，鵝脫氧膽酸-脫氧膽酸和聚氧乙烯9-月桂基醚，一油精，Na-牛磺-24，25-二氫梭鏈孢酸，Na-牛磺脫氧膽酸，Na-甘鵝脫氧膽酸，油酸，亞油酸，亞麻酸。聚合物吸收促進劑也可以包括如聚氧乙烯醚，聚氧乙烯山梨糖醇酐酯，聚氧乙烯10-月桂基醚，聚氧乙烯16-月桂基醚，氮酮(azone)(1-十二烷基氮雜環庚烷-2-酮)。
本發明的脂質體和其它類型的組合物，包括本發明的心磷脂(包括按照本發明方法製備的那些)，可以配製而包括活性劑。活性劑可以是例如包埋在組合物中的脂質體內。與組合物中的一種成分複合(例如與組合物中的心磷脂複合)，或否則存在組合物中。包括在本發明組合物中通常被認為是對於在表面活性劑存在下穩定的活性劑。當組合物包括脂質體時，親水性活性劑是穩定的，並可以包括在脂質體內部以致脂質體雙層產生擴散屏障，防止它任意擴散在身體中。認為疏水性活性劑特別適合於用於本發明製劑，特別是脂質體製劑，因為它們不僅通過顯示降低的毒性有益，而且它們傾向於在脂質體的脂雙層中很穩定。對於醫療或化妝品應用，製劑可以是在生理學上相容的，如藥用的，並且可以包括普通技術人員已知的其它試劑(例如緩衝液，抗生素，防腐劑或其它賦形劑，如一種或多種藥用賦形劑)以配製藥物組合物。
當按照本發明的組合物包含活性劑時，本發明還提供使用該製劑向人或動物細胞施用活性劑的方法。細胞可以是體外的，在該情形中製劑可以用於診斷或研究目的，或將活性劑傳遞給移植到人或動物患者中的細胞。備選地，細胞可以是體內的，在該情形中本發明提供將活性劑傳遞至人或動物，例如需要使用活性劑治療或為化妝品目的的患者中的方法。該方法可以用於將實際上任何活性劑施用於例如患者患病的細胞或器官。適當的活性劑包括用於治療病症的診斷劑和藥劑，所述病症如炎症(例如慢性炎症)，依賴於血管生成的疾病，關節炎，再狹窄，牛皮癬，癌症(例如肺癌，腦癌或中樞神經系統的其它癌，黑色素瘤，胰腺癌，肝癌，睪丸或卵巢癌，和其它腫瘤疾病)，多發性硬化，阿爾茨海默氏病，帕金森氏症，和各種血管病。脂質體製劑，乳劑，或複合物也可以用於抗真菌應用，並可以包含適當的抗真菌劑作為活性劑。典型地，活性劑可以是一種或多種基因和基因載體，反義分子(例如寡核苷酸)，蛋白質和肽，蛋白質或化學藥物(例如疏水性或親水性藥物)或診斷劑。
適合於本發明的活性劑包括作用於以下各項的試劑外周神經，腎上腺素能受體，膽鹼能受體，骨骼肌，心血管系統，平滑肌，血液循環系統，突觸位點，神經效應器接合位點，內分泌和激素系統，免疫系統，生殖系統，骨骼系統，消化和排洩系統，組胺系統和中樞神經系統。適當的試劑可以選自例如蛋白質，酶，激素，核苷酸，多核苷酸，核蛋白，多糖，糖蛋白，脂蛋白，多肽，類固醇，萜類，三萜，類維生素A，抗-潰瘍H2受體拮抗劑，抗潰瘍藥物，降鈣藥，溼潤劑，化妝品等。活性劑可以是鎮痛藥；麻醉劑；抗心率失常藥，抗生素；抗過敏藥，抗真菌劑，抗癌劑(例如米託蒽醌(參見例如國際專利公開WO 02/32400)，紫杉烷類(例如參見國際專利公開WO 00/01366)，紫杉醇，喜樹鹼，和喜樹鹼衍生物((例如SN-38)(參見例如國際專利公開WO 02/058622)，伊立替康(參見例如國際專利公開WO 03/030864)，和其它喜樹鹼)，吉西他濱，蒽環黴素，反義寡核苷酸(例如靶向癌基因，如raf基因(參見例如國際專利公開WO 98/43095))，長春花屬生物鹼(例如長春瑞濱，參見例如國際專利公開WO 03/018018)，抗體，環磷醯胺(cytoxine)，免疫毒素等)，抗高血壓藥(例如二氫吡啶，抗抑鬱藥，cox-2抑制劑)；抗凝血劑；抗抑鬱藥；抗糖尿病藥，抗癲癇藥，抗炎皮質甾類；治療阿爾茨海默氏病或帕金森氏病的藥劑；抗潰瘍藥；抗原蟲藥，抗焦慮藥，甲狀腺藥，抗甲狀腺藥，抗病毒藥，食慾減退藥，二膦酸鹽，強心變力劑，心血管藥，皮質甾類，利尿劑，多巴胺能藥，腸胃病藥，止血藥，降膽甾醇藥，抗高血壓藥；免疫抑制藥；抗痛風藥，抗瘧藥，抗偏頭痛藥，抗毒蕈鹼藥，抗炎藥，如治療風溼病，關節炎，牛皮癬，炎性腸病，局限性迴腸炎的藥劑；或治療包括多發性硬化的脫髓鞘性病的藥劑；眼藥；疫苗(例如抗流感病毒，肺炎，A型肝炎，B型肝炎，C型肝炎，霍亂毒素B-亞基，傷寒，惡性瘧原蟲，白喉，破傷風，單純皰疹病毒，結核病，HIV，SARS病毒，百日咳桿菌，麻疹，流行性腮腺炎，風疹，細菌類毒素，牛痘病毒，腺病毒，金絲雀痘病毒病毒，卡介苗，肺炎克氏桿菌疫苗等)；組胺受體拮抗劑，安眠藥，腎保護劑，脂調節劑，肌肉鬆弛藥，精神安定藥，親神經藥，阿片類激動劑和拮抗劑，擬副交感神經藥，蛋白酶抑制劑，前列腺素，鎮靜劑，性激素(例如雄性激素，雌激素等)，興奮劑，擬交感神經藥，血管舒張藥和黃質和這些種類的合成的類似物。治療劑可以是腎毒性的，如環孢菌素和兩性黴素B，或心臟毒性的，如兩性黴素B和紫杉醇。例舉性的抗癌劑包括美法侖，氮芥，磷酸雌莫司汀(extramustine phosphate)，烏拉莫司汀，異環磷醯胺，甘露莫司汀，trifosfamide，鏈脲菌素，二溴甘露醇，米託蒽醌，甲氨蝶呤，氟尿嘧啶，阿糖胞苷，替加氟，idoxide，泰素，紫杉醇，道諾黴素，柔紅黴素，博來黴素，兩性黴素，卡鉑，順鉑，紫杉醇，BCNU，長春新鹼，喜樹鹼，多柔比星，依託泊苷，細胞因子，核酶，幹擾素，寡核苷酸和前述的官能衍生物。按照該方法可以傳遞的藥物的另外實例包括乙二磺酸丙氯拉嗪(prochlorperzine edisylate)，硫酸亞鐵，氨基己酸，鹽酸美加明，鹽酸普魯卡因胺，硫酸苯丙胺，去氧麻黃鹼鹽酸鹽，benzamphetamine鹽酸鹽，硫酸異丙腎上腺素，吩美曲秦鹽酸鹽，氯貝膽鹼，氯醋甲膽鹼，鹽酸毛果芸香鹼，硫酸阿託品，溴東莨菪鹼，異丙碘銨，曲地氯銨，鹽酸苯乙雙胍，鹽酸哌甲酯，膽茶鹼，鹽酸頭孢氨苄，地芬尼多，鹽酸美克洛嗪，馬來酸丙氯拉嗪，酚苄明，馬來酸硫乙拉嗪，茴茚二酮，雙苯茚酮丁四硝酯，地高辛，異氟磷，乙醯唑胺，醋甲唑胺，苄氟噻嗪，chloropromaide，妥拉磺脲，醋酸氯地孕酮，非那二醇，別嘌醇，阿司匹林鋁，氨甲蝶呤，醋磺胺甲噁唑，紅黴素，氫化可的松，醋酸氫可的松，醋酸可的松，地塞米松及其衍生物如倍他米松，曲安西龍，甲睪酮，17-S-雌二醇，炔雌醇，炔雌醇3-甲醚，潑尼松龍，醋酸17α-羥孕酮，19-降孕甾酮(norprogesterone)，炔諾孕酮，炔諾酮，炔諾酮，norethiederone，黃體酮，諾孕酮，異炔諾酮，阿司匹林，吲哚美辛，萘普生，非諾洛芬，舒林酸，吲哚洛芬，硝化甘油，硝酸異山梨酯，普萘洛爾，噻嗎洛爾，阿替洛爾，阿普洛爾，西咪替丁，可樂定，丙咪嗪，左旋多巴，氯丙嗪，甲基多巴，二羥苯丙氨酸，茶鹼，葡糖酸鈣，酮洛芬，布洛芬，頭孢氨苄，紅黴素，氟哌啶醇，佐美酸，乳酸亞鐵，長春胺，安定，酚苄明，地爾硫_，米力農，頭孢羥唑鈉甲酸酯，quanbenz，氫氯噻嗪，雷尼替丁，氟比洛芬，fenufen，氟洛芬，託美丁，阿氯芬酸，甲芬那酸，氟芬那酸，difuinal，尼莫地平，尼群地平，尼索地平，尼卡地平，非洛地平，利多氟嗪，噻帕米，戈洛帕米，氨氯地平，米氟嗪，賴諾普利，依那普利，依那普利拉，卡託普利，雷米普利，法莫替丁，尼扎替丁，硫糖鋁，依汀替丁，tetratolol，米諾地爾，氯氮_，安定，阿米替林，和丙米嗪。更多的實例是蛋白質和肽，包括但不限於骨形態形成蛋白，胰島素，肝素，秋水仙素，胰高血糖素，促甲狀腺激素，甲狀旁腺和垂體激素，降鈣素，腎素，催乳激素，促腎上腺皮質激素，促甲狀腺激素，促卵泡激素，絨毛膜促性腺素，促性腺激素釋放激素，生長激素(例如，牛生長激素，豬生長激素等)，催產素，加壓素，GRF，生長激素釋放抑制因子，賴氨酸加壓素，促胰酶素，黃體化激素，LHRH，LHRH激動劑和拮抗劑，亮丙瑞林(leuprolide)，幹擾素(例如α-，β-，或γ-幹擾素，幹擾素α-2a，幹擾素α-2b，和保守的幹擾素等)，白細胞介素，生長激素(例如人生長激素及其衍生物如甲硫氨酸-人生長激素和去苯丙氨酸人生長激素，牛生長激素，豬生長激素，類胰島素生長激素等)，消化激素，甲狀腺素，抗甲狀腺素，生育抑制劑如前列腺素，生育促進劑，生長因子如類胰島素生長因子，凝血因子，胰島激素釋放因子，這些化合物的類似物和衍生物，和這些化合物的藥用鹽，或它們的類似物或衍生物。活性劑(用於診斷或治療應用)也可以是或包括核酸，如RNA，DNA(例如寡核苷酸，質粒，噬菌體或病毒載體等)。活性劑也可以是試劑(兩種或更多)的混合物，其可以有利地在脂質體製劑，複合物，乳劑或其它製劑中共同施用。
化學治療劑和其它抗癌劑，如以上所述，很適合用於本發明的組合物和治療方法。可以將含有化學治療劑和其它抗癌劑的脂質體製劑，複合物，乳劑等直接注射到腫瘤組織中以將化學治療劑和其它抗癌劑直接傳遞到癌細胞。在一些情形中，特別是在腫瘤切除後，脂質體製劑，乳劑，複合物或其它本發明製劑可以直接移植到產生的空腔中或可以作為塗層施用於剩餘組織。在手術後施用本發明脂質體製劑的情形中，可以利用具有較大直徑的約1微米的脂質體，因為它們不必通過脈管系統。
當組合物包括活性劑時，本發明提供將活性劑傳遞至細胞的方法。按照該方法，如本文所述製備包含本發明心磷脂和所需活性劑的組合物。然後將組合物暴露於細胞以將活性劑傳遞給細胞。該方法可以用於將活性劑如藥物，核酸，和其它適當的試劑傳遞至任何期望細胞。例如，該方法可以用於體外應用以將活性劑傳遞給培養物中的細胞。備選地，該方法可以用於將活性劑如藥物傳遞給體內細胞。當在體內使用該方法時，它可以用於治療人或動物疾病。在該實施方案中，將組合物保留於人或動物以便將活性劑傳遞給人或動物。在一些應用中，試劑和組合物可以用於化妝品。該方法的一種優選應用包括治療癌症，如在本文中所述當組合物包含一種或多種抗癌劑時。
對於體內應用，優選組合物包括一種或多種藥用賦形劑。此外，藥物活性劑如抗癌藥，核酸和本文所述的蛋白質試劑可以以適於傳遞藥物有效劑量的濃度摻入到本發明的組合物中。如治療醫師或獸醫認為合適，可以改變藥物活性劑如抗癌劑的劑量，選擇治療劑治療的適當劑量在這些專業人員的技術範圍內。
該方法提供藥物製劑的給藥，該藥物製劑除了活性劑的脂質體製劑(和含有本發明心磷脂和活性劑的其它製劑)以外包括無毒，惰性藥物上適當的賦形劑。藥物上適當的賦形劑包括所有類型的固體，半固體或液體稀釋劑，填充劑和助劑。本發明還包括劑量單位的藥物製劑。這意味著製劑是單獨部分的形式，例如小瓶，注射器，膠囊，藥丸，栓劑，或安瓿，其中活性劑脂質體製劑的含量對應於部分或多個單個劑量。劑量單位可以包含例如1，2，3或4個單個劑量，或1/2，1/3，或1/4的單個劑量。單個劑量優選含有一次給藥提供活性劑的量，通常對應於整個，半個，三分之一，四分之一個日劑量。
片劑，錠劑，膠囊，丸劑，顆粒劑，栓劑，溶液，混懸劑和乳劑，糊劑，軟膏(例如乾性皮膚軟膏)，凝膠，乳膏，洗劑(如乾性皮膚軟化劑，溼潤劑等)，散劑和噴霧劑可以是適當的藥物製劑。除了脂質體活性劑以外，栓劑可以包含適當的水溶性或水不溶性賦形劑。適當的賦形劑是其中本發明脂質體活性劑足夠穩定而允許治療應用的那些，如聚乙二醇，某些脂類，和這些物質的酯或混合物。油膏，糊劑，乳膏和凝膠也可以包含適當的其中對脂質體活性劑穩定的賦形劑。
如已知或開發了的，活性劑或其藥物製劑可以靜脈內，皮下，局部，口服，腸胃外，腹膜內，和/或直腸，或者通過直接注射到腫瘤或器官或需要通過該方法治療的其它部位給藥。基於心磷脂和心磷脂類似物的製劑也可以例如作為乳膏，皮膚油膏，乾性皮膚軟化劑，溼潤劑等局部施用。
下列實施例進一步不限制性地舉例說明本發明。
實施例11A.完全保護的心磷脂的合成 R＝肉豆蔻醯(C14:0鏈)在0℃下在45分鐘內向o-氯苯基二氯磷酸酯(2.45g，9.98mmol)和無水吡啶(4.39mL，54.28mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液滴加1，2-O-二肉豆蔻醯-sn-甘油(5.00g，9.75mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液。在0℃下攪拌反應混合物1小時和在室溫下攪拌1小時後，滴加2-苄氧基-1，3-丙二醇(0.71g，3.90mmol)在CH2Cl2(8mL)中的溶液。將反應混合物在室溫下攪拌3小時。在真空中去除有機溶劑，殘渣在乙酸乙酯(150mL)和冷的0.5 N HCl(100mL)之間分配。用水，鹽水洗滌有機相，用無水Na2SO4乾燥，並真空濃縮。通過在矽膠上使用己烷/乙酸乙酯(3∶1)的快速色譜法純化獲得的殘渣，提供4.37g完全保護的心磷脂，其為無色油。產率為72％。TLC(己烷/EtOAc 3∶1)Rf＝0.31；1HNMR(500MHz，CDCl3)δ7.40-7.08(m，13H，ArH)，5.22(m，2H，RCOOCH)，4.63(m，2H，CH2Ph)，4.40-4.06(m，12H，RCOOCH2，POCH2)，3.89(m，1H，BnOCH)，2.26(m，8H，-CH2COO-)，1.57(m，8H，-CH2CH2COO-)，1.25(br s，80H，CH2)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH3)；ESI-MS，m/z(M+Na)+1576.6。
1B.2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽的合成 R＝肉豆蔻醯(C14:0鏈)方法1.向攪拌過的完全保護的心磷脂(260.3mg，0.17mmol)在THF(5mL)中的溶液加入2-吡啶醛肟(202.5mg，1.66mmol)和四甲基胍(176.0mg，1.53mmol)。在加入1滴水後，將混合物在室溫下攪拌2.5小時。在真空下去除溶劑。將殘渣溶解在CHCl3(10mL)中並用H2O(4mL×2)洗滌，用Na2SO4乾燥並真空濃縮。通過在矽膠上使用CHCl3/MeOH/NH4OH(65∶15∶1)的快速色譜法純化獲得的殘渣，提供200mg 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽，其為白色固體。產率為87％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶5)Rf＝0.64；1HNMR(500MHz，CDCl3)δ7.42-7.23(m，5H，ArH)，5.20(m，2H，RCOOCH)，4.60(s，2H，CH2Ph)，4.29-3.89(m，12H，RCOOCH2，POCH2)，3.69(m，1H，BnOCH)，2.27(m，8H，-CH2COO-)，1.56(m，8H，-CH2CH2COO-)，1.28(br s，80H，CH2)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH3)；ESI-MS，m/z(M-2NH4)2-664.9，(M-2NH4-RCOO)-1102.0，(M-2NH4+H)-1330.3方法2.向攪拌過的完全保護的心磷脂(3.88g，2.50mmol)在THF(65mL)中的溶液加入2-硝基苯甲醛肟(4.11g，24.74mmol)和四甲基胍(2.62g，22.75mmol)。在加入15滴水以後，將混合物在室溫下攪拌4小時。真空去除溶劑。將殘渣溶解在CHCl3(100mL)中並用H2O和MeOH(2mL)洗滌。用Na2SO4乾燥有機相併真空濃縮。通過在矽膠上使用CHCl3/MeOH/NH4OH(65∶15∶1)的快速色譜法純化獲得的黃色殘渣，提供2.17g 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽，其為白色固體。產率為64％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶5)Rf＝0.64。
1C.1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(四肉豆蔻醯心磷脂)的合成 R＝肉豆蔻醯基(C14:0鏈)方法1.將2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(520.1mg，0.38mmol)樣品溶解在THF(25mL)中，並用鈀黑(200mg)在氫氣球下氫化3.5小時。在過濾去除催化劑以後，將溶液蒸乾。將殘渣溶解在THF(7mL)中，然後使用丙酮(35mL)沉澱。將混合物保持在冰箱中過夜，次日，過濾白色固體並用少量冷丙酮洗滌。在真空乾燥器中用無水硫酸鈣乾燥12小時和用P2O5乾燥5小時後，獲得415.1mg 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(四肉豆蔻醯心磷脂)。產率為86％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶5)Rf＝0.29；1HNMR(500MHz，CDCl3)δ7.32(br s，NH4)，5.26(m，2H，RCOOCH)，4.34-3.92(m，13H，RCOOCH2POCH2HOCH)，2.33(m，8H，-CH2COO-)，2.29(t，J＝7.5，1H，CHOH)，1.58(m，8H，-CH2CH2COO-)，1.30(br s，80H，CH2)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH3)；FTIR(ATR)3231s，2918s，2850s，1738s，1467w，1378w，1203ms，1067s cm-1；ESI-MS，m/z(M-2NH4)2-619.9，(M-2NH4-RCOO)-1011.9，(M-2NH4+H)-1240.2。
方法2.將2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(124.7mg，0.09mmol)樣品溶解在THF(15mL)中，用10％Pd-C(50mg)在50psi的壓力下氫化過夜。在過濾去除催化劑以後，將溶液蒸乾。將殘渣溶解在THF(2mL)中，然後使用丙酮(10mL)沉澱。將混合物保持在冰箱中過夜，過濾白色固體並用少量冷丙酮洗滌。在真空乾燥器中用無水硫酸鈣乾燥3小時後，獲得98.6mg 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(四肉豆蔻醯心磷脂)。產率為85％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶5)Rf＝0.29。
實施例22A.順-2-苯基-1，3-二噁烷-5-基叔丁基二甲基甲矽烷基醚的合成 按照Dodd等，J.Chem.Soc.Perkin I，2273-2277(1976)所述方法經過修改從順-2-苯基-1，3-二噁烷-5-醇製備標題化合物。下列是改進的方法。
向順-2-苯基-1，3-二噁烷-5-醇(5.01g，27.8mmol)和咪唑(3.78g，55.5mmol)在DMF(15mL)中的溶液分份加入二甲基叔丁基甲矽烷基氯(5.03g，33.4mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜，然後加入H2O(20mL)。用己烷(25mL×3)萃取混合物。合併有機相，用鹽水洗滌，用Na2SO4乾燥並真空濃縮以給出定量產率(8.18g)的順-2-苯基-1，3-二噁烷-5-基-叔丁基二甲基甲矽烷基醚，其為無色油。該產物用於下一步驟合成而不進一步純化。
2B.2-O-叔丁基二甲基甲矽烷基甘油的合成
按照Dodd等，J.Chem.Soc.Perkin I，2273-2277(1976)所述方法從順-2-苯基-1，3-二噁烷-5-基叔丁基二甲基甲矽烷基醚製備標題化合物。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ3.65(m，5H，CH2CHCH2)，1.88(t，J＝6.0，2H，OH)，0.92(s，9H，SiCCH3)，0.12(s，6H，SiCH3)。
2C.完全保護的心磷脂的合成 R＝肉豆蔻醯基(C14:0鏈)在0℃下在15分鐘內向o-氯苯基二氯磷酸酯(1.51g，6.15mmol)和無水吡啶(2.7mL，33.3mmol)在CH2Cl2(6mL)中的溶液滴加1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油(3.08 g，6.0mmol)在CH2Cl2(30mL)中的溶液。在0℃下攪拌反應混合物1小時和在室溫下攪拌1小時以後，滴加2-O-叔丁基二甲基甲矽烷基甘油(495.3mg，2.4mmol)在CH2Cl2(6mL)中的溶液。在室溫下攪拌反應混合物3小時。真空去除有機溶劑，小心用冷乙酸乙酯(120mL)/0.25NHCl(120mL)處理剩餘的殘渣。用水，鹽水洗滌有機相，用無水Na2SO4乾燥和真空濃縮。通過在矽膠上使用己烷/乙酸乙酯(4∶1-3.5∶1)的快速色譜法純化獲得的殘渣，提供2.79g完全保護的心磷脂，其為無色油。產率為74％。TLC(己烷/EtOAc 3∶1)Rf＝0.42；1HNMR(500MHz，CDCl3)δ7.41(d，J＝8.0Hz，4H，ArH)，7.23(t，J＝8.0Hz，2H，ArH)，7.12(t，J＝8.0Hz，2H，ArH)，5.23(m，2H，RCOOCH)，4.36-4.06(m，13H，RCOOCH2，POCH2，SiOCH)，2.26(m，8H，-CH2COO-)，1.57(m，8H，-CH2CH2COO-)，1.25(br s，80H，CH2)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH3)，0.87(s，9H，SiCCH3)，0.08(s，6H，SiCH3)。
2D.1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)-2-O-(叔丁基二甲基甲矽烷基)甘油二銨鹽的合成 R＝肉豆蔻醯基(C14:0鏈)向攪拌過的完全保護的心磷脂(0.68g，0.43mmol)在THF(10mL)中的溶液加入2-硝基苯醛肟(0.71g，4.26mmol)和四甲基胍(0.45g，3.91mmol)。在加入3滴水後，將混合物在室溫下攪拌3小時。真空去除溶劑。將殘渣溶解在CHCl3(25mL)中並用H2O(10mL)洗滌。用Na2SO4乾燥有機相併真空濃縮。通過在矽膠上使用CHCl3/MeOH/NH4OH(65∶15∶1)的快速色譜法純化獲得的黃色殘渣，提供370mg 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)-2-O-(叔丁基二甲基甲矽烷基)甘油二銨鹽，其為白色固體。產率為62％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶5)Rf＝0.64；1HNMR(500MHz，CDCl3)δ7.32(br s，NH4)，5.26(m，2H，RCOOCH)，4.34-3.92(m，13H，RCOOCH2，POCH2，SiOCH)，2.30(m，8H，-CH2COO-)，1.58(m，8H，-CH2CH2COO-)，1.30(br s，80H，CH2)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH3)，0.87(s，9H，SiCCH3)，0.08(s，6H，SiCH3)。
2E.1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(四肉豆蔻醯心磷脂)的合成 R＝肉豆蔻醯基(C14:0鏈)
向攪拌過的1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)-2-O-(叔丁基二甲基甲矽烷基)甘油二銨鹽(138.0mg，0.099mmol)在CHCl3(10mL)，MeOH(20mL)和H2O(7mL)中的混合物，滴加1N HCl(0.3mL)。將混合物在室溫下攪拌6小時，然後在冰浴中冷卻。向冷的反應混合物滴加10％NH4OH(2mL)。真空去除有機溶劑，用CHCl3萃取剩餘的水層兩次。用Na2SO4乾燥合併的有機層，濃縮至乾燥。將殘渣溶解在THF(5mL)中，然後使用丙酮(25mL)沉澱。將混合物保持在冰箱中過夜，過濾白色固體並用少量冷丙酮洗滌。在真空乾燥器中用無水硫酸鈣乾燥1小時和用P2O5乾燥5小時後，獲得115mg 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(四肉豆蔻醯心磷脂)。產率為83％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH65∶25∶5)Rf＝0.29。由實施例2E製備的四肉豆蔻醯心磷脂的表徵與實施例1C相同。
實施例33A.完全保護的不飽和心磷脂的合成 R＝油醯基(C18:1鏈)用1，2-O-二油醯基-sn-甘油替代1，2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油，按照實施例2C所述方法製備標題化合物。產物為無色油，產率為35％。TLC(己烷/EtOAc 3∶1)Rf＝0.46；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.41(d，J＝8.0Hz，4H，ArH)，7.23(t，J＝8.0Hz，2H，ArH)，7.12(t，J＝8.0Hz，2H，ArH)，5.36(m，8H，烯烴質子)，5.24(m，2H，RCOOCH)，4.35-4.06(m，13H，RCOOCH2，POCH2，SiOCH)，2.28(m，8H，-CH2COO-)，2.00(m，16H，烯丙基CH2)，1.57(m，8H，-CH2CH2COO-)，1.28(br s，88H，CH2)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH3)，0.88(s，9H，SiCCH3)，0.08(s，6H，SiCH3)。ESI-MS，m/z(M+Na)+1816.4。
3B.1，3-二-(1，2-O-二油醯基-sn-甘油-3-磷醯基)-2-O-(叔丁基二甲基甲矽烷基)甘油二銨鹽的合成 R＝油醯基(C18:1鏈)方法1.向攪拌過的完全保護的不飽和心磷脂(170.0mg，0.095mmol)在THF(3mL)中的溶液加入2-吡啶醛肟(92.7mg，0.76mmol)和四甲基胍(80.6mg，0.70mmol)，所述不飽和心磷脂按照實施例3A所述方法製備。在加入1滴水後，將混合物在室溫下攪拌7小時。真空去除溶劑。將殘渣溶解在CHCl3(10mL)中並用H2O(4mL×2)洗滌，用Na2SO4乾燥，真空濃縮。通過使用CHCl3/MeOH/NH4OH(65∶15∶1)的快速色譜法純化獲得的殘渣，提供134mg 1，3-二(1，2-O-二油醯基-sn-甘油-3-磷醯基)-2-O-(叔丁基二甲基甲矽烷基)甘油二銨鹽，其為白色膠狀固體。產率為88％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶5)Rf＝0.67；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.39(br s，NH4)，5.34(m，8H，烯烴質子)，5.25(m，2H，RCOOCH)，4.31-3.90(m，13H，RCOOCH2，POCH2，SiOCH)，2.30(m，8H，-CH2COO-)，2.01(m，16H，烯丙基CH2)，1.59(m，8H，-CH2CH2COO-)，1.29(br s，88H，CH2)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH3)，0.87(s，9H，SiCCH3)，0.08(s，6H，SiCH3)。ESI-MS，m/z(M-2NH4)2-784.8，(M-2NH4-RCOO)-1288.3，(M-2NH4+H)-1571.9。
方法2.向攪拌過的完全保護的不飽和心磷脂(0.59g，0.33mmol)在THF(8mL)中的溶液加入2-硝基苯甲醛肟(0.54g，3.23mmol)和四甲基胍(0.35g，3.00mmol)，所述不飽和心磷脂由實施例3A所述方法製備。在加入3滴水後，在室溫下攪拌混合物3小時。真空去除溶劑。將殘渣溶解在CHCl3(15mL)中，用H2O(6mL)洗滌。真空濃縮有機相。通過使用CHCl3/MeOH/NH4OH(65∶15∶1)的快速色譜法純化獲得的黃色殘渣，提供350mg 1，3-二(1，2-O-二油醯基-sn-甘油-3-磷醯基)-2-O-(叔丁基二甲基甲矽烷基)甘油二銨鹽，其為白色膠狀固體。產率為66％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶5)Rf＝0.67。
3C.1，3-二(1，2-O-二油醯基-sn-甘油-3-磷醯基)-甘油二銨鹽(四油醯心磷脂)的合成 R＝油醯基(C18:1鏈)向攪拌過的1，3-二(1，2-O-二油醯基-sn-甘油-3-磷醯基)-2-O-(叔丁基二甲基甲矽烷基)甘油二銨鹽(110.1mg，0.069mmol)在CHCl3(10mL)，MeOH(20mL)和H2O(7mL)中的混合物滴加1N HCl(0.3mL)。將混合物在室溫下攪拌5小時。加入另外0.1mL 1N HCl。將混合物在室溫下攪拌另外4小時，然後在冰浴中冷卻。向冷卻的反應混合物滴加10％NH4OH(2mL)。真空去除有機溶劑，用CHCl3萃取剩餘殘渣。濃縮有機層至乾燥。通過在矽膠上使用CHCl3/MeOH/NH4OH(65∶15∶1)的快速色譜法純化粗製產物，提供71mg 1，3-二(1，2-O-二油醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(四油醯基心磷脂)，其為白色膠狀固體。產率為70％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH65∶25∶5)Rf＝0.40；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.43(br s，NH4)，5.34(m，8H，烯烴質子)，5.19(m，2H，RCOOCH)，4.38-3.91(m，13H，RCOOCH2，POCH2，HOCH)，2.29(m，8H，-CH2COO-)，2.17(br s，1H，OH)，2.01(m，16H，烯丙基CH2)，1.58(m，8H，-CH2CH2COO-)，1.29(br s，88H，CH2)，0.87(t，J＝6.5，12H，CH3).ESI-MS，m/z(M-2NH4)2-727.6，(M-2NH4-RCOO)-1174.2，(M-2NH4+H)-1456.6。
實施例4
4A.完全保護的心磷脂的合成 R＝肉豆蔻醯基(C14:0鏈)在室溫下在30分鐘內向N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯(1.92g，9.22mmol)和無水N，N-二異丙基乙胺(1.92mL，11.1mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液滴加1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油(4.61g，9.0mmol)在CH2Cl2(45mL)中的溶液。在室溫下攪拌反應混合物1.5小時以後，加入1H-四唑在乙腈(71.8mL，24.3mmol)中的3wt％溶液。向該反應混合物滴加2-苄氧基-1，3-丙二醇(0.66g，3.60mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液。將反應混合物在室溫下攪拌3小時。然後將反應混合物冷卻至-40℃，加入77％的間氯過苯甲酸(2.64g，11.80mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液以使反應混合物的溫度保持在0℃以下。在升溫至25℃時，將混合物轉移至分液漏鬥和用5％NaHCO3(2×50mL)，冷1N HCl(2×15mL)，水，鹽水洗滌。用Na2SO4乾燥有機相併真空濃縮，產生油殘渣。通過在矽膠上用己烷/乙酸乙酯(2∶1-1∶1)洗脫的快速色譜法純化殘渣，提供4.38g完全保護的心磷脂，其為無色油。產率為90％。TLC(己烷/EtOAc 1∶1)Rf＝0.16；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.35(m，5H，ArH)，5.22(m，2H，RCOOCH)，4.67(m，2H，CH2Ph)，4.34-4.06(m，12H，RCOOCH2，POCH2)，3.83(m，1H，BnOCH)，3.75(dt，J1＝11.4，J2＝3.0，6H，POCH3)，2.31(m，8H，-CH2COO-)，1.59(m，8H，-CH2CH2COO-)，1.25(br s，80H，CH2)，0.88(t，J＝6.6，12H，CH3)。
4B.2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽的合成
R＝肉豆蔻醯基(C14:0鏈)向攪拌過的完全保護的心磷脂(1.80g，1.32mmol)在2-丁酮(85mL)中的溶液加入NaI(0.59g，3.96mmol)，將反應混合物回流1.5小時，冷卻至25℃。過濾得到的白色沉澱，用冷2-丁酮洗滌以產生1.71g 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二鈉鹽，其為白色固體。
通過應用按照Bligh和Dyer，Can.J.Biochem.，37911-917(1959)的萃取方法，將二鈉鹽轉化為其對應的游離酸。因此，上述二鈉鹽溶解在CHCl3(80mL)，MeOH(160mL)和0.1N HCl(80mL)的冷混合物中，在室溫下攪拌40分鐘。加入H2O(80mL)和CHCl3(80mL)，分離分開的CHCl3層，用H2O(50mL)洗滌。通過加入15mL 10％NH4OH中和有機層。分離有機層，真空濃縮以獲得殘渣，其進一步通過使用CHCl3/MeOH/NH4OH(65∶15∶1)的短矽膠柱純化，提供1.42g 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽，其為白色固體。產率為79％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶5)Rf＝0.64。由實施例4B製備的終產物的表徵與實施例1B相同。
4C.1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(四肉豆蔻醯心磷脂)的合成 R＝肉豆蔻醯基(C14:0，鏈)
按照實施例1C所述方法製備標題化合物。由實施例4所述方法製備的四肉豆蔻醯心磷脂的表徵與實施例1相同。
實施例55A.2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二甲酯的合成 R＝肉豆蔻醯基(C14:0鏈)在室溫下在15分鐘內向攪拌過的N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯(1.02g，5.15mmol)和無水N，N-二異丙基乙胺(1.2mL，6.94mmol)在CH2Cl2(4mL)中的溶液滴加1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油(2.00g，4.13mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液。在室溫下攪拌反應混合物1.5小時以後，加入1H-四唑在乙腈(31.0mL，10.5mmol)中的3wt％溶液。向該反應混合物中，加入2-苄氧基-1，3-丙二醇(0.30g，1.65mmol)在CH2Cl2(5mL)中的溶液。在室溫攪拌反應混合物3小時。然後將反應混合物冷卻至-40℃，加入77％的間-氯過苯甲酸(1.14g，6.6mmol)在CH2Cl2(7mL)中的溶液。將混合物逐漸升溫至室溫30分鐘，然後轉移至分液漏鬥，用5％NaHCO3(2×30mL)，1N HCl(2×20mL)，水，鹽水洗滌。用Na2SO4乾燥有機相，真空濃縮。
通過在矽膠上使用己烷/乙酸乙酯(1∶0-1∶1)的梯度的快速色譜法純化殘渣，提供1.69g 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二甲酯。產率為79％。TLC(己烷/EtOAc 1∶1)Rf＝0.24.1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.35-7.29(m，5H，ArH)，4.68(m，2H，CH2Ph)，4.26-4.02(m，8H，POCH2)，3.86(m，2H，ROCH)，3.75(d，J1＝12.0，6H，POCH3)，3.61-3.38(m，13H，-CH2OCH2-，-CH2OCH-，BnOCH)，1.54(m，8H，-CH2CH2O-)，1.29(m，88H，CH2)，0.88(t，J＝6.7，12H，CH3)。
5B.2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽的合成 R＝肉豆蔻醯基(C14:0鏈)向攪拌過的2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二甲酯(230mg，0.18mmol)在2-丁酮(4mL)中的溶液加入NaI(88mg，0.59mmol)。將反應混合物回流1.5小時，冷卻至25℃，然後0℃。將得到的固體沉澱過濾，用冷2-丁酮洗滌以產生2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽。將二銨鹽放入氯仿/甲醇/0.1 NHCl(30∶5∶15mL)，劇烈攪拌1小時。分離有機層，用氯仿(2×10mL)萃取水層。用水(2×10mL)洗滌合併的有機萃取液。將氫氧化銨水溶液(5mL)加入氯仿萃取液，真空濃縮並在高真空下乾燥過夜，提供231mg 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽。產率為60％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH，65∶25∶5)Rf＝0.5；1H NMR(CDCl3)δ7.29-7.21(m，5H，ArH)，4.57(m，2H，CH2Ph)，4.21-3.38(m，23H，POCH2，-CH2OCH2-；-CH2OCH-，BnOCH)，1.50(m，8H，CH2CH2O-)，1.25(m，88H，CH2)，0.89(t，12H，J＝6.54 Hz，CH3)；ESI-MS，m/z(M-2NH4+H)-，1274.1，(M-2NH4)2-636.9。
5C.1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(四肉豆蔻醯心磷脂醚類似物)的合成
R＝肉豆蔻醯基(C14:0鏈)將2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(85mg，0.065mmol)溶解在四氫呋喃(10mL)中。向其中加入10％Pd-C(70mg)，在Parr氫化器上在50psi下振蕩混合物16小時。將溶液過濾通過硅藻土墊，用氯仿(5mL)洗滌。合併濾液和洗液，真空濃縮並乾燥。在從四氫呋喃(0.2mL)-丙酮(8mL)混合物中結晶後，得到44mg 1，3-二-(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽。產率為56％。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH，65∶25∶5)Rf＝0.28；1H NMR(CDCl3)δ7.29(br，NH4+)，4.20-3.80(m，8H，POCH2)，3.57-3.41(m，15H，CH2OCH2；CH2OCH-，HOCH)，2.3(br，1H，OH)，1.53(m，8H，CH2CH2O-)，1.25(m，88H，CH2)，0.875((t，12H，J＝6.9Hz，CH3)；ESI-MS，m/z 1184.7(M-2NH4+H)-，591.3(M-2NH4)2-。
實施例66A.2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽的合成 R＝肉豆蔻醯基(C14:0鏈)向攪拌過的N，N』-二環己基碳二亞胺(265mg，1.28mmol)在吡啶(2mL)中的溶液滴加1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷脂酸(281mg，0.47mmol)在無水CH2Cl2(3mL)中的溶液。在室溫下攪拌該溶液5分鐘，然後加入2-苄氧基-1，3-丙二醇(0.71g，3.90mmol)在CH2Cl2(8mL)中的溶液，繼續在室溫下攪拌24小時。過濾反應物，用CH2Cl2洗滌。濃縮濾液，與甲苯共蒸發以去除痕量吡啶。向該殘渣中加入CH2Cl2(15mL)，將混合物保存在冰箱中過夜。通過過濾去除白色沉澱。將濾液真空濃縮，在矽膠柱上用CHCl3/MeOH/NH4OH(65∶15∶1)洗脫純化。產生13mg(4％)。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH 65∶25∶5)Rf＝0.64。TLC與按照實施例1B所述方法製備的真實樣品相同。
6B.1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯基)甘油二銨鹽(四肉豆蔻醯心磷脂)的合成 R＝肉豆蔻醯基(C14:0鏈)按照實施例1 C所述方法製備標題化合物。TLC(CHCl3/MeOH/NH4OH65∶25∶5)Rf＝0.29。TLC與按照實施例1C所述方法製備的真實樣品相同。
實施例7本實施例顯示本發明含有心磷脂的脂質體組合物的製備。通過混合19.1μmol如上製備的四肉豆蔻醯心磷脂，96.2μmol磷脂醯膽鹼和64.6μmol膽甾醇形成小的單層囊。在充分攪拌後，在50ml圓底燒瓶中使用旋轉蒸發器將混合物蒸發乾。將隨後乾燥的脂膜重懸浮在10ml無菌非熱原性的水中。在30分鐘膨脹時間後，在定溫槽中在25℃下將獲得的懸浮液超聲15分鐘。然後用海藻糖凍幹脂質體製劑。
實施例8
本實施例顯示如上製備包括四肉豆蔻醯心磷脂的保留蒽環黴素，多柔比星的脂質體的製備。可以製備脂質體多柔比星用於臨床給藥，其通過簡單渦旋混合含有40mg心磷脂-脂質體凍乾產物和預先在0.85％NaCl中以2mg/ml製備的2.5ml多柔比星溶液的小瓶。1分鐘完成渦旋混合，將混合物保持在37℃，溫育15分鐘。
實施例9本實施例顯示保留藥物米託蒽醌鹽酸鹽的脂質體的製備。通過在叔丁醇中混合1.96gm D-α-生育酚，58.7gm如上製備的四肉豆蔻醯心磷脂，97.9gm膽甾醇，293.6gm卵磷脂醯膽鹼以使溶液總重為13.05kg來製備脂類混合物。然後將3,080gm含有122.4gm海藻糖二水合物的水溶液混合到丁醇溶液中。將小瓶裝滿11.1gm該混合物並凍幹，以使每個小瓶含有約300mg脂類。將7.5ml Novantrone_(15mg)和7.5ml水加入脂類小瓶以製備脂類包埋的米託蒽醌。使脂質體在室溫下水合30分鐘，劇烈振蕩2分鐘，以最大強度超聲10分鐘。在45分鐘內將適當量分配至注射器或標準輸液裝置，在8小時內使用。
實施例10本實施例顯示保留藥物紫杉醇的脂質體的製備。紫杉醇包封在心磷脂，磷脂醯膽鹼，膽甾醇和α-生育酚中。每mg紫杉醇的脂類比例為1.8mg心磷脂9.0mg磷脂醯膽鹼3.0mg膽甾醇0.1mg α-生育酚通過將8.89kg叔丁醇加入12.0L燒瓶和在40-45℃下加熱可以製備脂質體包封的紫杉醇。隨後在混合下加入下列各項直至溶解並在40-45℃下加熱3.412g D-α-生育酸琥珀酸酯，205g卵磷脂醯膽鹼，22.78g紫杉醇，41.00g如上製備的四肉豆蔻醯心磷脂，68.33g膽甾醇。
將得到的溶液過濾通過0.22微米濾器。將得到的濾液裝入無菌小瓶，每瓶含有約10.1g濾液。將小瓶塞好並進行凍幹。可以將它們保存在-20℃直至使用。
根據需要從乾燥脂膜用25ml生理鹽水製備脂質體。使混合物在室溫下水合約1小時，此後將小瓶渦旋約1分鐘並在槽型超聲波儀中以最大頻率超聲約10分鐘。根據本發明可以將適量的小瓶內含物轉移至輸液袋並輸注至患者中。
該紫杉醇的脂質體製劑可以用於將大量紫杉烷快速施用於人而不誘導顯著的毒性反應。治療可以在約1小時，甚至45分鐘或更少期間內靜脈內施用。考慮到正常實驗室和治療劑量變化，以大約下列劑量治療至少3位患者90mg/m2，135mg/m2，175mg/m2，250mg/m2，和300mg/m2。製劑可以作為單一藥劑給予而不用甾族化合物、抗組胺劑或其它治療劑如過敏抑制劑預處理。如果患者耐藥量允許，可以每21天重複治療。
實施例11本實施例顯示製備保留在溶液中的SN-38的脂質體。通過將約0.2gD-α-生育酸琥珀酸酯加入升溫至約35-40℃的1kg叔丁醇來製備脂質膜。將溶液混合約5分鐘直至生育酚溶解。將6.0g如上製備的四肉豆蔻醯心磷脂加入溶液，攪拌溶液約5分鐘。將約10g膽甾醇加入溶液，混合溶液約5分鐘，然後加入30g卵磷脂醯膽鹼，接著混合另外5分鐘。將約11g得到的脂類溶液凍幹以產生脂質膜。
為了製備脂質體SN-38，通過將溶液溶解在pH為8-10的鹼性水溶液中製備1.2mg/ml的SN-38溶液。近似地，將15ml該SN-38溶液加入含有脂膜的小瓶。將小瓶輕輕渦旋，使在室溫下水合30分鐘，劇烈渦旋2分鐘，在槽型超聲波儀中以最大強度超聲約10分鐘。脂質體溶液的pH降低至酸性pH。使用該方法超過90wt.％的SN-38與脂類以脂質體形式複合。
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本文所引用的所有參考文獻，包括出版物，專利申請和專利，包括在前表和否則在本說明書中引用的那些，結合於此作為參考，其程度相同於將各篇參考文獻單個和明確地顯示結合作為參考並且在本文中完整地闡述。
除非在本文中另有說明或與上下文明顯矛盾，在描述本發明的上下文中(特別是在後附權利要求的上下文中)術語「一個(a)」和「一個(an)」和「該(the)」和類似對象的使用應當認為包括單數和複數。除非另外指出，術語「包含」，「具有」，「包括」，和「含有」應當認為是開放式的術語(即意味著「包括但不限於」)。除非在本文中另外指出，本文數值範圍的列舉僅意欲用作單獨提及位於範圍內的每個分離值的簡寫方法，每個分離值結合在說明書中而似乎在本文中被單獨引用。除非在本文中另有說明或與上下文明顯矛盾，可以以任何適當的順序實施本文描述的所有方法。除非另外要求，任何和所有實施例，或本文提供的例舉性的語言(例如「如」)的使用僅意欲更好地舉例說明本發明，而未對本發明的範圍施加限制。說明書中的語言不應當認為是指任何未要求的要素為本發明實施所必需。
本文描述了本發明的優選實施方案，包括發明人已知的實施本發明的最佳方式。在閱讀前面的說明書以後，那些優選實施方案的變化對於本領域那些普通技術人員可變得明顯。發明人期望技術人員適當地使用這些變化，發明人意欲除了如本文具體描述以外實施本發明。因此，本發明包括在於此後附的權利要求中引用主題的所有適用法律允許的改進和等效物。此外，除非在本文中另有說明或與上下文明顯矛盾，本發明包括上述要素以其所有可能變化的任何組合。
權利要求
1.一種心磷脂分子，其具有下列結構 其中Z1和Z2相同或不同並且是-O-C(O)-，-O-，-S-，或-NH-C(O)-；R1和R2相同或不同並且可以是H和/或飽和或不飽和烷基；R3為(CH2)n且n＝0-10；R4為氫，烷基，取代烷基，環烷基，取代的環烷基，肽，二肽，多肽，蛋白質，糖類如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖等，雜環，核苷，或多核苷酸；X為陽離子。
2.按照權利要求1的心磷脂分子，其中所述化合物具有下列結構
3.按照權利要求1的心磷脂分子，其中所述化合物是具有下列結構的心磷脂醚類似物
4.一種具有下列結構的心磷脂類似物 其中Z1和Z2相同或不同並且是-O-C(O)-，-O-，-S-，-NH-C(O)-；R1和R2相同或不同並且是H或飽和或不飽和烷基；R3為(CH2)n且n＝0-10；R4為氫，烷基，取代烷基，環烷基，取代的環烷基，肽，二肽，多肽，蛋白質，糖類如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖等，雜環，核苷，或多核苷酸；R5為接頭；X為陽離子。
5.按照權利要求4的心磷脂類似物，其中所述接頭包含烷基，取代烷基，環烷基，取代環烷基，烷氧基，聚烷氧基如PEG化的含有1至500個烷氧基單體單元的醚，取代的聚烷氧基等，肽，二肽，多肽，蛋白質，糖類如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖。
6.權利要求1-5中任何一項的心磷脂分子，其中R1和/或R2中至少一個是飽和或不飽和的含有14-34個碳的烷基。
7.權利要求1-6中任何一項的心磷脂分子，其中X為非毒性陽離子。
8.權利要求1-7中任何一項的心磷脂分子，其中X為氫，銨，鈉，鉀，鈣或鋇離子。
9.一種製備心磷脂分子或其類似物的方法，其包含在偶聯劑N，N』-二環己基碳二亞胺或N，N』-羰二咪唑的存在下將磷脂酸和2-O-保護的甘油反應。
10.一種製備心磷脂分子或其類似物的方法，其包含在偶聯劑三異丙基苯磺醯氯，或N，N』-二環己基碳二亞胺或N，N』-羰二咪唑的存在下將磷脂酸和甘油反應。
11.一種製備心磷脂分子的方法，其包含在偶聯劑二氯磷酸酯或N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯存在下將式V的醇和2-O-保護的甘油或2-O-取代的甘油反應 其中Z1和Z2相同或不同並且是-O-C(O)-，-O-，-S-，-NH-C(O)-；R1和R2相同或不同並且是H和/或飽和或不飽和烷基；R3為(CH2)n且n＝0-10。
12.權利要求11的方法，其中R1和/或R2中至少一個是飽和或不飽和的含有4-34個碳的烷基。
13.權利要求11的方法，其中R1和/或R2中至少一個是飽和或不飽和的含有14-24個碳的烷基。
14.權利要求11的方法，其中所述心磷脂分子是權利要求1-3中任何一項的分子。
15.一種製備權利要求2的心磷脂的方法，其包含在偶聯劑的存在下將1，2-O-二醯甘油和2-O-保護的甘油反應，所述偶聯劑為二氯磷酸酯或N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯。
16.一種製備權利要求3的心磷脂的方法，其包含在偶聯劑的存在下將1，2-O-二烷基甘油和2-O-保護的甘油反應，所述偶聯劑為二氯磷酸酯或N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯。
17.一種製備權利要求4或5的心磷脂的方法，其包含將式V的醇和式VI的二醇(其中R4和R5定義如上)在偶聯劑的存在下反應，所述偶聯劑是二氯磷酸酯或N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯
18.權利要求11-17中任何一項的方法，其中所述偶聯劑是式VII的二氯磷酸酯 其中W是烷基或取代烷基，包括甲基，乙基，異丙基，叔丁基，烯丙基，2-取代的乙基，滷代乙基如2，2，2-三溴乙基；苄基或取代的苄基；苯基或取代的苯基如2-氯苯基，4-氯苯基和2，4-二氯苯基；或其它任何可去除的保護基。
19.權利要求11-17的方法，其中所述偶聯劑是N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯。
20.按照權利要求9-19中任何一項的方法生產的心磷脂或心磷脂類似物。
21.一種製備脂質體的方法，其包含通過權利要求9-19中任何一項的方法製備心磷脂或心磷脂類似物，和然後將所述心磷脂或心磷脂類似物包括在脂質體中。
22.一種將活性劑保留在脂質體中的方法，其包含通過權利要求9-19中的任何一種方法製備心磷脂或心磷脂類似物，和將所述心磷脂或心磷脂類似物和活性劑包括在脂質體中。
23.權利要求22的方法，其中所述活性劑包括藥物。
24.權利要求22的方法，其中所述活性劑包括寡核苷酸。
25.權利要求22的方法，其中所述活性劑包括抗癌劑。
26.權利要求22的方法，其中所述活性劑包埋在脂質體中。
27.權利要求22的方法，其中所述活性劑與所述心磷脂複合。
28.權利要求21-27中任何一項的方法，其另外包含用防凍劑凍幹所述脂質體。
29.按照權利要求21-28中任何一項的方法製備的脂質體組合物。
30.一種包含權利要求1-8中任何一項的心磷脂的組合物。
31.一種包含按照權利要求9-19中任何一項的方法生產的心磷脂或心磷脂類似物的組合物。
32.權利要求29-31中任何一項的組合物，其另外包含磷脂醯膽鹼，甾醇，和生育酚。
33.權利要求29-32中任何一項的組合物，其另外包含選自以下各項的磷脂醯膽鹼二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼，二硬脂醯磷脂醯膽鹼，二油醯磷脂醯膽鹼，二棕櫚醯磷脂醯膽鹼，二花生四烯醯磷脂醯膽鹼，卵磷脂醯膽鹼，大豆磷脂醯膽鹼，氫化大豆磷脂醯膽鹼，及其混合物。
34.權利要求29-33中任何一項的組合物，其另外包含選自以下各項的磷脂醯甘油二肉豆蔻醯磷脂醯甘油，二硬脂醯磷脂醯甘油，二油醯磷脂醯甘油，二棕櫚醯磷脂醯甘油，二花生四烯醯磷脂醯甘油，及其混合物。
35.權利要求29-34中任何一項的組合物，其另外包含選自以下各項的甾醇膽甾醇，膽甾醇衍生物，糞甾醇，膽甾烷醇，膽甾烷，膽甾醇半琥珀酸酯，膽甾醇硫酸酯，及其混合物。
36.權利要求29-35中任何一項的組合物，其另外包含靶向劑。
37.權利要求36的組合物，其中所述靶向劑是蛋白質。
38.權利要求37的組合物，其中所述蛋白質選自抗體，抗體片段，肽，肽激素，受體配體，及其混合物。
39.權利要求36的組合物，其中所述靶向劑是糖類。
40.權利要求29-39中任何一項的組合物，其另外包含配體。
41.權利要求40的組合物，其中所述配體是抗體或細胞受體的配體。
42.權利要求29-41中任何一項的組合物，其包含活性劑。
43.權利要求42的組合物，其中所述活性劑與所述心磷脂複合。
44.權利要求42或43的組合物，其中所述活性劑包含一種或多種遺傳載體，反義分子，蛋白質，肽，或藥物。
45.權利要求42-44中任何一項的組合物，其中所述活性劑包含一種或多種抗癌劑。
46.權利要求29-45的組合物，其是脂類複合物或乳劑的形式。
47.權利要求29-46中任何一項的組合物，其包含脂質體。
48.權利要求47的組合物，其中所述脂質體包含心磷脂。
49.權利要求47或48的組合物，其另外包含活性劑。
50.一種組合物，其包含脂質體形式的權利要求1-8和20中任何一項的心磷脂或心磷脂類似物和活性劑。
51.一種組合物，其包含脂質體形式的按照權利要求9-19中任何一項的方法製備的心磷脂或心磷脂類似物和活性劑。
52.權利要求47-51中任何一項的組合物，其中所述活性劑包埋在一種或多種脂質體中。
53.權利要求47-52中任何一項的組合物，其中所述活性劑與所述心磷脂複合。
54.按照權利要求47-53中任何一項的凍幹形式的組合物。
55.權利要求54的組合物，其另外包含防凍劑。
56.權利要求47-55中任何一項的組合物，其中所述脂質體直徑為約1微米或更小。
57.權利要求47-56中任何一項的組合物，其中所述脂質體直徑為約500nm或更小。
58.權利要求47-57中任何一項的組合物，其中所述脂質體直徑為約200nm或更小。
59.權利要求47-58中任何一項的組合物，其中所述脂質體直徑為約100nm或更小。
60.權利要求29-59中任何一項的組合物，其另外包含藥用賦形劑。
61.權利要求29-60中任何一項的組合物在製備治療疾病的藥物中的應用。
62.按照權利要求61的應用，其中所述疾病是癌症。
63.一種將活性劑傳遞至細胞的方法，其包含製備按照權利要求42-60中任何一項的組合物，和將該組合物暴露於細胞。
64.權利要求63的方法，其中所述細胞是在體外。
65.權利要求63的方法，其中所述細胞是在體內。
66.一種治療人或動物疾病的方法，其包含製備按照權利要求42-60中任何一項的組合物，和將該組合物暴露於需要其的人或動物以使活性劑傳遞至所述人或動物患者。
67.權利要求66的方法，其中所述疾病是癌症，所述活性劑是抗癌劑。
68.權利要求63-67中任何一項的方法，其中所述組合物包括一種或多種脂質體。
69.權利要求63-68中任何一項的方法，其中所述活性劑與組合物中的心磷脂複合。
70.權利要求68或69的方法，其中所述活性劑包埋在組合物中的脂質體內。
全文摘要
本發明提供新的心磷脂合成途徑，該心磷脂具有不同鏈長、不飽和或飽和的不同脂肪酸和/或烷基鏈。反應路線可以用於產生新形式的心磷脂，包括心磷脂變體。通過本發明方法製備的心磷脂可以便利地整合到可還包括活性劑如疏水性或親水性藥物的脂質體及其它脂類製劑中。這些製劑可以用於治療疾病或診斷和/或分析測定。脂質體還可以包括例如用於將它們靶向某一細胞類型或特定組織的配體。
文檔編號C07F9/10GK1714094SQ03811913
公開日2005年12月28日 申請日期2003年5月23日 優先權日2002年5月24日
發明者M·U·艾哈邁德, 林貞, S·M·阿里, I·艾哈邁德 申請人:新藥物公司