一種耐高鹽高產酯酵母融合子的製備方法與流程

2023-05-17 05:02:56 2

本發明涉及酵母菌育種領域，特別涉及一種耐高鹽高產酯酵母融合子的製備方法。
背景技術：
：醬油或醬的傳統釀造生產中，存在多種耐鹽性酵母，它們在發酵過程中所起的作用意義重大。其中，莫格球擬酵母能賦予醬油、醬特定香氣成分，在食鹽18％，含氮量1.4％左右的環境中繁殖，稱之為「抗滲透壓性酵母」或「耐鹽性酵母」。但是，莫格球擬酵母在高鹽條件下，生長緩慢，產酯香的能力較低，滿足不了高品質醬油製備的需要。因此，亟需一種在高鹽條件下，生長較快，產酯能力較強的菌株。這有利於提高醬油的酯香味，縮短發酵時間，節約生產成本。技術實現要素：本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種耐高鹽高產酯酵母融合子的製備方法。本發明的另一目的在於提供通過上述製備方法得到的耐高鹽高產酯酵母融合子。本發明的目的通過下述技術方案實現：一種耐高鹽高產酯酵母融合子的製備方法，包括如下步驟：(1)活化菌種：對漢遜德巴利酵母和莫格球擬酵母活化；(2)製備原生質體：將活化後的漢遜德巴利酵母和莫格球擬酵母的細胞壁去除，分別得到漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體；(3)滅活原生質體：①通過熱處理滅活漢遜德巴利酵母原生質體，使其滅活效率達到100％；②通過紫外線滅活莫格球擬酵母原生質體，使其滅活效率達到100％；(4)電融合滅活原生質體：將滅活後的漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體進行電融合，然後進行培養，得到融合子；(5)篩選融合子：將融合子接種於含26％(w/w)nacl的培養基培養發酵，檢測發酵得到的產物的酯含量；同時檢測融合子的生長速度，得到耐高鹽高產酯酵母融合子。所述的漢遜德巴利酵母優選為漢遜德巴利酵母(debaryomyceshansenii)zxl20141126，保藏編號gdmccno：60127，於2016年12月5日保藏於位於中國廣東廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所的廣東省微生物菌種保藏中心。所述的莫格球擬酵母優選為莫格球擬酵母(torulopsismogii)zxl20161207，保藏編號為gdmccno：60126，於2016年12月5日保藏於位於中國廣東廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所的廣東省微生物菌種保藏中心。步驟(1)中所述的活化的目的是使得漢遜德巴利酵母和莫格球擬酵母處於良好的生長狀態，如處於對數生長期。所述的活化的步驟優選如下：取新鮮漢遜德巴利酵母和莫格球擬酵母的斜面菌種各一環，分別接種至麥芽汁液體培養基中，28℃、150r/min振蕩培養12h；再以1％(v/v)接種量分別轉接菌液至麥芽汁液體培養基中，28℃、200r/min振蕩培養，其中漢遜德巴利酵母培養6h，莫格球擬酵母培養8h。步驟(2)中所述的原生質體優選通過如下步驟製備得到：(a)將活化後的漢遜德巴利酵母和莫格球擬酵母的菌懸液濃度分別調整為107個細胞/ml；分別取1ml，通過離心得到菌體；(b)用高滲緩衝液洗滌菌體，離心，取菌體；在菌體中加入3ml預處理劑，於30℃、200r/min振蕩處理20min；預處理劑的成分如下：pbs緩衝液為溶劑，含0.2％(w/w)β-巰基乙醇和0.1％(w/w)edta；(c)離心，用pbs緩衝液洗滌；加入1ml20mg/ml蝸牛酶溶液，37℃酶解處理，其中，漢遜德巴利酵母的處理時間為30min，莫格球擬酵母的處理時間為45min；(d)酶解結束後，離心，高滲緩衝溶液洗滌，分別得到漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體；懸浮於高滲緩衝溶液中保存。步驟(a)、(b)和(c)中所述的離心的條件優選為3000r/min離心10min。步驟(b)、(c)和(d)中所述的洗滌的次數優選為2次。步驟(c)中所述的酶解處理的方式優選為水浴處理。步驟(d)中所述的離心的條件優選為4000r/min離心10min。所述的高滲緩衝液的組成優選如下：pbs緩衝液為溶劑，溶質為蔗糖和甘露糖，蔗糖的濃度為170g/l，甘露醇的濃度為0.8mol/l。本申請中所述的pbs緩衝液優選通過如下步驟製備得到：濃度為0.2mol/l的kh2po4溶液與濃度為0.2mol/l的k2hpo4溶液按體積比9:1混勻，hcl調節ph值至5.8。步驟(3)中所述的熱處理滅活的條件優選為於60～65℃水浴保溫870～900s，間歇振蕩。步驟(3)中所述的紫外線滅活的條件優選如下：紫外燈功率30w，照射距離14～15cm時，滅活85～90s。所述的滅活效率通過如下步驟確定：將滅活處理後的原生質體稀釋，塗布固體高滲完全培養基(hyperosmoticcompletemedium，hcm)，28℃培養3～5d，觀察菌落的生長情況；無菌落長出，則滅活效率達到100％。所述的固體高滲完全培養基的組成如下：葡萄糖20g/l、酵母膏10g/l、蛋白腖20g/l、0.8mol/l甘露醇、170g/l蔗糖、瓊脂15g/l。步驟(4)中所述的電融合的具體步驟優選如下：1)用等滲融合液洗滌滅活後的漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體，再用等滲融合液懸浮；將漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體混合，得到原生質體混懸液，其中，漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體的濃度分別為106個/ml；2)融合電極小室用75％(v/v)酒精浸泡30分鐘後晾乾進行無菌操作；將融合小室電極連接細胞融合儀cry-3，將混懸液加入到融合小室內；先調節成串脈衝所需頻率2000khz，然後調節成串脈衝電壓為40～50v，調節融合脈衝脈寬至所需值40～50μs，調節融合脈衝所需個數5～7，調節融合脈衝電壓至所需值140～160v；3)同時按下成串脈衝及融合脈衝開關，完成電融合。步驟1)中所述的等滲融合液為濃度10～20％(w/v)的糖醇溶液或糖溶液，電阻值不低於3～3.5千歐。所述的糖醇優選為甘露醇或山梨糖醇。所述的糖優選為葡萄糖。步驟1)中所述的洗滌的次數優選為3～4次。步驟2)中所述的融合脈衝脈寬優選為50μs。所述的脈衝的個數優選為7個。步驟(5)中所述的培養基的組成優選如下：葡萄糖20g/l、酵母提取物10g/l、蛋白腖20g/l、nacl26g/l。步驟(5)中所述的酯含量的檢測步驟優選如下：將所述的產物進行離心，再通過微孔濾膜過濾處理後，用氣相質譜法測定。所述的氣相質譜法的色譜條件優選如下：日本島津公司gcms-qp2010plus氣相色譜質譜聯用儀；採用ei離子原；色譜柱：rtx-wax交聯石英毛細管柱；檢測器溫度：250℃，進樣口溫度：250℃；升溫程序：35℃保持2min，以10℃/min速率升溫至250℃，保持5min；載氣：氦氣，流量為1ml/min；分流比：1/30；樣品進樣量1μl。一種耐高鹽高產酯酵母融合子，通過上述製備方法得到。所述耐高鹽高產酯酵母融合子在醬油生產中的應用。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果：(1)本發明選擇白酒生產大曲中分離篩選的高產酯漢遜德巴利酵母(debaryomyceshansenii)zxl20141126以及醬油生產中分離篩選的耐鹽莫格球擬酵母(torulopsismogii)zxl20161207作為親本株製備融合子，具有如下優點：漢遜德巴利酵母zxl20141126來源於白酒生產大曲，除了具有高產酯特性，還具有在高溫(50℃)下生長的特性；耐鹽莫格球擬酵母zxl20161207具有在高鹽(24％)條件生長的特性；將二者作為親本製備得到的融合子，融合兩親本的高產酯與耐高鹽、以及能耐高溫的特點，不僅產酯達到6g/l，且在18％nacl的高鹽條件下仍能保持高產特性，從而，該融合子特別適合用於製備醬油。(2)本發明提供的方法是原生質體電融合酵母選育方法，無細胞壁障礙，細胞融合頻率高，從而使基因重組的頻率也高；對於參與融合的親本株，可以不需要特殊的遺傳標記或精確的遺傳分析，且育種快速、準確，菌株生命活力好。(3)本發明提供的方法可重複性好，能重複篩選到產酯高、且在26％nacl的高鹽條件下仍能保持高產特性的融合子。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。實施例1(1)取新鮮漢遜德巴利酵母(debaryomyceshansenii)zxl20141126和莫格球擬酵母(torulopsismogii)zxl20161207的斜面菌種各一環，分別接種至含30ml麥芽汁液體培養基的250ml搖瓶中，28℃、150r/min振蕩培養12h。以1％(v/v)接種量分別轉接菌液至含90ml麥芽汁液體培養基的500ml搖瓶中，28℃、200r/min振蕩培養，其中漢遜德巴利酵母培養6h，莫格球擬酵母培養8h。(2)分別調節活化後的兩種酵母菌懸液濃度至107/ml，取1ml加入1.5ml離心管中，3000r/min離心10min收集菌體；以高滲緩衝液(0.2mol/lkh2po4溶液90.0ml與0.2mol/lk2hpo4溶液10.0ml混勻，hcl調節ph值至5.8，分別添加170g/l蔗糖和0.8mol/l甘露醇)洗滌離心兩次，除去培養液，加入3ml預處理劑(pbs緩衝液為溶劑，其中含0.2％(w/w)β-巰基乙醇和0.1％(w/w)edta)，30℃、200r/min振蕩處理20min。(3)離心去除預處理劑，用pbs緩衝液洗滌2次，加入1ml20mg/ml蝸牛酶溶液，水浴37℃處理漢遜德巴利酵母30min，莫格球擬酵母45min；酶解結束後，4000r/min下離心10min去除蝸牛酶液，高滲緩衝溶液洗滌2次，懸浮於高滲緩衝溶液中保存。(4)原生質體的滅活取製備好的漢遜德巴利酵母原生質體菌懸液，調節為106個/ml，於溫度60℃恆溫水浴鍋中保溫0、150、300、450、600、750、900、1050s，間歇振蕩，取樣0.1ml稀釋塗布固體高滲完全培養基(組成如下：葡萄糖20g/l、酵母膏10g/l、蛋白腖20g/l、0.8mol/l甘露醇、170g/l蔗糖、瓊脂15g/l，下同)，28℃培養3～5d，計算致死率。表1漢遜德巴利酵母原生質體致死率實驗時間(s)平均菌落數(個)致死率(％)05601504323.23003242.94502653.66001180.4750591.1900010010500100取製備好的莫格球擬酵母原生質體菌懸液，調節為106/ml，選取紫外燈功率30w，照射距離15cm時，滅活0、15、30、45、60、75、90、105s，取樣0.1ml稀釋塗布固體高滲完全培養基，28℃培養3～5d，計算致死率。表2莫格球擬酵母原生質體致死率實驗(5)滅活原生質體的電融合使用溫度60℃恆溫水浴鍋中保溫900s，間歇振蕩滅活得到的漢遜德巴利酵母原生質體和紫外燈功率30w，照射距離15cm時，滅活90s得到的莫格球擬酵母原生質體進行細胞融合。電融合應在電介質濃度(導電率)極低的等滲融合液中進行。用雙重去離子水加甘露醇，濃度為15％，其電阻值不低於3～3.5千歐。滅活原生質體在融合前在融合液中洗滌3～4次，每次洗滌後1000轉/分×1分鐘。將漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體混合，得到原生質體混懸液，其中，漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體的濃度分別為106個/ml。(6)融合電極小室用75％(v/v)酒精浸泡30分鐘後晾乾進行無菌操作；將融合小室電極連接細胞融合儀cry-3，將混懸液加入到融合小室內；先調節成串脈衝所需頻率2000khz，然後調節成串脈衝電壓為30v，緩慢提高至40v時均成串排列好，調節融合脈衝脈寬至所需值50μs，調節融合脈衝所需個數7，調節融合脈衝電壓至所需值140v。140v時明顯見雙球啞鈴形細胞融合，直至170v融合現象明顯，大於170v細胞破。最後確定140～160v為好。(7)同時按下成串脈衝及融合脈衝開關，此時在倒置顯微鏡中可觀察到細胞移動並排列成串狀。按一下脈衝觸發開關，可觀察到細胞被電脈衝擊穿，並與相鄰的細胞發生融合的景象。此時實驗完成。取下融合小室，關掉電源。以未經滅活的菌液混合液對照。融合結束後，將菌液適當稀釋，塗布hcm平板，28℃避光培養3d～5d，形成的37個菌落者即為融合子。(8)融合子的初篩：檢出的37株融合子進一步的發酵試驗結果證明，在含18％(w/v)以上nacl的培養基(葡萄糖20g/l、酵母提取粉10g/l、蛋白腖20g/l，nacl按實驗需求添加)中，在30℃培養，仍能生長代謝產酯≥1g/l的耐高鹽高產酯的融合子有6株。與親株相比，這6株融合子整合了親株的優良性狀(見表3)。產酯的檢測：發酵產物進行離心，再通過微孔濾膜過濾處理後，用氣相質譜法測定。色譜條件如下：日本島津公司gcms-qp2010plus氣相色譜質譜聯用儀；採用ei離子原；色譜柱：rtx-wax交聯石英毛細管柱；檢測器溫度：250℃，進樣口溫度：250℃；升溫程序：35℃保持2min，以10℃/min速率升溫至250℃，保持5min；載氣：氦氣，流量為1ml/min；分流比：1/30；樣品進樣量1μl。表36株融合子在不同高鹽濃度下的產酯量(g/l)由上述實驗可知，本實施例中，一種耐高鹽高產酯的選育方法利用滅活雙親原生質體電融合技術選育出的ym5菌株克服了雙親y和m菌株的不足之處，在各種nacl濃度的高鹽條件下的產酯能力顯著高於其親本菌株m，而且ym5菌株在18％nacl濃度培養72h的菌體濃度可以達到1.2×108個/ml，而親本莫格球擬酵母zxl20161207在同樣高鹽環境下生長速度慢，需要培養100h才能達到108個/ml，親本漢遜德巴利酵母zxl20141126在同樣高鹽環境下幾乎不生長。ym5菌株在高達50℃，18％nacl濃度培養，仍能正常生長代謝，60h的菌體濃度可以達到1.0×108個/ml。其他5個融合子在高鹽下的產酯能力雖然弱於ym5株，但是較親本，均具有能在高鹽(18％nacl)、高溫(50℃)環境下生長以及產酯的能力。實施例2一種耐高鹽高產酯酵母融合子的製備方法，包括如下步驟：(1)取新鮮漢遜德巴利酵母(debaryomyceshansenii)zxl20141126(保藏編號gdmccno：60127)和莫格球擬酵母(torulopsismogii)zxl20161207(保藏編號gdmccno：60126)的斜面菌種各一環，分別接種至含30ml麥芽汁液體培養基的250ml搖瓶中，28℃、150r/min振蕩培養12h。以1％(v/v)接種量分別轉接菌液至含90ml麥芽汁液體培養基的500ml搖瓶中，28℃、200r/min振蕩培養，其中漢遜德巴利酵母培養6h，莫格球擬酵母培養8h。(2)分別調節活化後的兩種酵母菌懸液濃度至107/ml，取1ml加入1.5ml離心管中，3000r/min離心10min收集菌體；以高滲緩衝液(0.2mol/lkh2po4溶液90.0ml與0.2mol/lk2hpo4溶液10.0ml混勻，hcl調節ph值至5.8，分別添加170g/l蔗糖和0.8mol/l甘露醇)洗滌離心兩次，除去培養液，加入3ml預處理劑(含0.2％β-巰基乙醇和0.1％edta的pbs緩衝液)，30℃、200r/min振蕩處理20min。(3)離心去除預處理劑，用pbs緩衝液洗滌2次，加入1ml20mg/ml蝸牛酶溶液，水浴37℃處理漢遜德巴利酵母30min，莫格球擬酵母45min；酶解結束後，4000r/min下離心10min去除蝸牛酶液，高滲緩衝溶液洗滌2次，懸浮於高滲緩衝溶液中保存。(4)原生質體的滅活取製備好的漢遜德巴利酵母的原生質體菌懸液，調節為106個/ml，於溫度60℃恆溫水浴鍋中保溫900s，間歇振蕩，取樣稀釋塗布固體高滲完全培養基，28℃培養3～5d，無菌落長出，滅活率達到100％。取製備好的莫格球擬酵母的原生質體菌懸液，調節為106/ml，選取紫外燈功率30w，照射距離15cm時，滅活90s，取樣稀釋塗布固體高滲完全培養基，28℃培養3～5d，無菌落長出，滅活率達到100％。(5)滅活原生質體的電融合電融合應在電介質濃度(導電率)極低的等滲融合液中進行。用雙重去離子水加甘露醇，濃度為20％，其電阻值不低於3～3.5千歐。滅活原生質體在融合前在融合液中洗滌3～4次，每次洗滌後1000轉/分×1分鐘。將漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體混合，得到原生質體混懸液，其中，漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體的濃度分別為106個/ml。(6)融合電極小室用75％(v/v)酒精浸泡30分鐘後晾乾進行無菌操作；將融合小室電極連接細胞融合儀cry-3，將混懸液加入到融合小室內；先調節成串脈衝所需頻率2000khz，然後調節成串脈衝電壓為30v，緩慢提高至40v時均成串排列好，調節融合脈衝脈寬至所需值50μs，調節融合脈衝所需個數7，調節融合脈衝電壓至所需值140v。(7)同時按下成串脈衝及融合脈衝開關，此時在倒置顯微鏡中可觀察到細胞移動並排列成串狀。按一下脈衝觸發開關，可觀察到細胞被電脈衝擊穿，並與相鄰的細胞發生融合的景象。此時實驗完成。取下融合小室，關掉電源。以未經滅活的菌液混合液對照。融合結束後，將菌液適當稀釋，塗布hcm平板，28℃避光培養3d～5d，形成的30個菌落者即為融合子。(8)融合子的初篩：檢出的30株融合子進一步的發酵試驗結果證明，得到5株在含18％(w/v)以上nacl的培養基中，仍能生長代謝產酯≥1g/l的耐高鹽高產酯的融合子。與親株相比，這5株融合子整合了親株的優良性狀。本實施例中，一種耐高鹽高產酯的選育方法利用滅活雙親原生質體電融合技術選育出的5株融合子菌株克服了雙親y和m菌株的不足之處，在各種nacl濃度的高鹽條件下的產酯能力顯著高於其親本菌株m，而且在18％nacl濃度培養72h的菌體濃度均可以達到≥1.0×108個/ml，而親本莫格球擬酵母zxl20161207在同樣高鹽環境下生長速度慢，需要培養100h才能達到108個/ml，親本漢遜德巴利酵母zxl20141126在同樣高鹽環境下幾乎不生長。5株融合子菌株在高達50℃，18％nacl濃度培養，仍能正常生長代謝，72h的菌體濃度可以達到1.0×108個/ml。實施例3(1)取新鮮漢遜德巴利酵母zxl20141126(保藏編號gdmccno：60127)和莫格球擬酵母zxl20161207(保藏編號gdmccno：60126)的斜面菌種各一環，分別接種至含30ml麥芽汁液體培養基的250ml搖瓶中，28℃、150r/min振蕩培養12h。以1％(v/v)接種量分別轉接菌液至含90ml麥芽汁液體培養基的500ml搖瓶中，28℃、200r/min振蕩培養，其中漢遜德巴利酵母培養6h，莫格球擬酵母培養8h。(2)分別調節活化後的兩種酵母菌懸液濃度至107/ml，取1ml加入1.5ml離心管中，3000r/min離心10min收集菌體；以高滲緩衝液(0.2mol/lkh2po4溶液90.0ml與0.2mol/lk2hpo4溶液10.0ml混勻，hcl調節ph值至5.8，分別添加170g/l蔗糖、0.8mol/l甘露醇)洗滌離心兩次，除去培養液，加入3ml預處理劑(含0.2％β-巰基乙醇和0.1％edta的pbs緩衝液)，30℃、200r/min振蕩處理20min。(3)離心去除預處理劑，用pbs緩衝液洗滌2次，加入1ml20mg/ml蝸牛酶溶液，水浴37℃處理漢遜德巴利酵母30min，莫格球擬酵母45min；酶解結束後，4000r/min下離心10min去除蝸牛酶液，高滲緩衝溶液洗滌2次，懸浮於高滲緩衝溶液中保存。(4)原生質體的滅活取製備好的漢遜德巴利酵母原生質體菌懸液，調節為106個/ml，於溫度65℃恆溫水浴鍋中保溫870s，間歇振蕩，取樣稀釋塗布固體高滲完全培養基，28℃培養3～5d，無菌落長出，滅活率達到100％。取製備好的莫格球擬酵母的原生質體菌懸液，調節為106/ml，選取紫外燈功率30w，照射距離14cm時，滅活85s，取樣稀釋塗布固體高滲完全培養基，28℃培養3～5d，無菌落長出，滅活率達到100％。(5)滅活原生質體的電融合電融合應在電介質濃度(導電率)極低的等滲融合液中進行。用雙重去離子水加甘露醇，濃度為15％，其電阻值不低於3～3.5千歐。滅活原生質體在融合前在融合液中洗滌3～4次，每次洗滌後1000轉/分×1分鐘。將漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體混合，得到原生質體混懸液，其中，漢遜德巴利酵母原生質體和莫格球擬酵母原生質體的濃度分別為106個/ml。(6)融合電極小室用75％(v/v)酒精浸泡30分鐘後晾乾進行無菌操作；將融合小室電極連接細胞融合儀cry-3，將混懸液加入到融合小室內；先調節成串脈衝所需頻率2000khz，然後調節成串脈衝電壓為30v，緩慢提高至50v時均成串排列好，調節融合脈衝脈寬至所需值40μs，調節融合脈衝所需個數5，調節融合脈衝電壓至所需值150v。(7)同時按下成串脈衝及融合脈衝開關，此時在倒置顯微鏡中可觀察到細胞移動並排列成串狀。按一下脈衝觸發開關，可觀察到細胞被電脈衝擊穿，並與相鄰的細胞發生融合的景象。此時實驗完成。取下融合小室，關掉電源。以未經滅活的菌液混合液對照。融合結束後，將菌液適當稀釋，塗布hcm平板，28℃避光培養3d～5d，形成26個菌落者即為融合子。(8)融合子的初篩：檢出的26株融合子進一步的發酵試驗結果證明，得到3株在含18％(w/v)以上nacl的培養基中，仍能生長代謝產酯≥1g/l的耐高鹽高產酯的融合子。與親株相比，這3株融合子整合了親株的優良性狀。本實施例中，一種耐高鹽高產酯的選育方法利用滅活雙親原生質體電融合技術選育出的3株融合子菌株克服了雙親y和m菌株的不足之處，在各種nacl濃度的高鹽條件下的產酯能力顯著高於其親本菌株m，而且在18％nacl濃度培養72h的菌體濃度均可以達到≥1.0×108個/ml，而親本莫格球擬酵母zxl20161207在同樣高鹽環境下生長速度慢，需要培養100h才能達到108個/ml，親本漢遜德巴利酵母zxl20141126在同樣高鹽環境下幾乎不生長。3株融合子菌株在高達50℃，18％nacl濃度培養，仍能正常生長代謝，80h的菌體濃度可以達到1.0×108個/ml。對比例1本例的操作基本同實施例1，區別僅在於用異常漢遜酵母cicc1433和莫格球擬酵母cicc1709作為親本。原生質體的滅活步驟中，熱處理滅活的是異常漢遜酵母cicc1433，紫外滅活的是莫格球擬酵母cicc1709。得到的融合子菌株在≥18％nacl濃度下生長緩慢，培養98h才能達到108個/ml，產酯量最高僅為2.1g/l。在培養溫度≥37℃，其他培養條件相同時，融合子菌株不能生長，無耐高溫特性。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。當前第1頁12